冷曉飛, 姜海峰, 劉小林, 王高學(xué), 張 艷, 高洪濤, 常亞青

(1. 大連太平洋海珍品有限公司, 遼寧 旅順 116045; 2. 西北農(nóng)林科技大學(xué) 動(dòng)物科技學(xué)院, 陜西 楊凌 712100; 3.大連海洋大學(xué) 農(nóng)業(yè)部海洋水產(chǎn)增養(yǎng)殖學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 遼寧 大連 116023)

動(dòng)物腸道的正常菌群是腸道的正常組成部分, 水生動(dòng)物的腸道微生物與宿主以及所處的水生環(huán)境形成的相互依賴、相互制約的微生態(tài)系, 對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收、 免疫反應(yīng)以及器官的發(fā)育等方面具有其他因素不可替代的作用[1]。并且, 隨著對(duì)益生菌研究越來(lái)越多的關(guān)注, 很多研究表明水生動(dòng)物腸道優(yōu)勢(shì)菌和次優(yōu)勢(shì)菌可以作為益生菌, 而且具有更好的定植效果[2-3]。皺紋盤(pán)鮑(Haliotis discus hannaiIno)是中國(guó)北方海域重要的養(yǎng)殖珍品。近幾年來(lái), 隨著集約化程度的提高, 養(yǎng)殖皺紋盤(pán)鮑病害頻繁發(fā)生, 給苗種、成鮑生產(chǎn)造成很大的經(jīng)濟(jì)損失。與此同時(shí), 對(duì)皺紋盤(pán)鮑病害尚無(wú)有效的防治措施[4]。細(xì)菌性病害的原因很大程度上由環(huán)境和體內(nèi)外的菌群結(jié)構(gòu)失衡引起的[5], 研究其腸道菌群結(jié)構(gòu)與組成, 對(duì)糾正機(jī)體菌群失調(diào)、增強(qiáng)機(jī)體體質(zhì)和開(kāi)發(fā)苗種培育、人工養(yǎng)殖中的益生菌制劑應(yīng)用具有重要的意義。最早Sawabe等[6]研究了日本海域的皺紋盤(pán)鮑腸道內(nèi)的微生物區(qū)系, 證明了不同環(huán)境下腸道菌群結(jié)構(gòu)與組成具有顯著的差異。而對(duì)我國(guó)海域的皺紋盤(pán)鮑腸道內(nèi)微生物區(qū)系研究尚未見(jiàn)報(bào)道。因此本研究著重于研究人工養(yǎng)殖的皺紋盤(pán)鮑和野生皺紋盤(pán)鮑腸道中微生物的組成和數(shù)量, 并采用PCR-DGGE指紋圖譜技術(shù)分析二者的相似度, 初步探討了人工養(yǎng)殖階段對(duì)皺紋盤(pán)鮑腸道菌群的影響, 從而對(duì)皺紋盤(pán)鮑腸道菌群有一個(gè)初步的了解。為進(jìn)一步深入研究皺紋盤(pán)鮑疾病防控以及鮑魚(yú)專用益生菌制劑的研制提供科學(xué)基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 樣品采集

10只健康野生皺紋盤(pán)鮑平均體質(zhì)量126.72g±10.71 g、平均殼長(zhǎng)10.34cm±0.22cm于2010年10月由潛水員采集于遼寧省旅順口區(qū)海域, 稱謂野生組; 10只健康養(yǎng)殖皺紋盤(pán)鮑平均體質(zhì)量122.70g±15.50g、平均體長(zhǎng)10.33cm±1.15cm隨機(jī)挑選于遼寧省旅順口大連太平洋海珍品有限公司養(yǎng)殖場(chǎng)稱謂養(yǎng)殖組。養(yǎng)殖組鮑魚(yú)從剝離后開(kāi)始投喂粉狀配合餌料, 5個(gè)月后改為籠養(yǎng)飼喂海帶。

1.2 方法

1.2.1 可培養(yǎng)細(xì)菌的分離、純化

參照Sawabe等[6]方法: 無(wú)菌條件下, 用手術(shù)刀將軟組織同殼分離后立即浸入70%酒精1min消毒體表, 再用無(wú)菌水沖洗數(shù)遍。用鑷子及剪刀取下皺紋盤(pán)鮑消化道, 置于預(yù)先稱重的無(wú)菌離心管中稱重并編號(hào)。為探討個(gè)體間差異, 對(duì)養(yǎng)殖組和野生組每個(gè)皺紋盤(pán)鮑個(gè)體的腸道樣品進(jìn)行單獨(dú)分離。分離得到的樣品經(jīng)研磨后梯度稀釋至10-4, 分別吸取各個(gè)稀釋度0.1 mL涂布2216E平板, 每個(gè)稀釋度涂3個(gè)平板, 22℃培養(yǎng)5 d。將剩余的研磨樣品分為養(yǎng)殖組和野生組均勻混合后保藏于-80 ℃冰箱中備用。培養(yǎng)結(jié)束后取適當(dāng)稀釋度的平板計(jì)算細(xì)菌菌落數(shù), 并依據(jù)菌落的形態(tài)特征及菌體形態(tài)特征進(jìn)行分類(lèi)并統(tǒng)計(jì)各類(lèi)型細(xì)菌的比例。 隨機(jī)挑取各類(lèi)型菌株在2216E平板上分離純化3次, 單克隆菌株保種于-80 ℃冰箱中備用。

1.2.2 細(xì)菌鑒定

采用細(xì)菌基因組提取試劑盒(Bioteke)提取單克隆菌株的DNA作為模板, 分別擴(kuò)增16S rDNA基因片段, 將獲得的16S rDNA基因序列于GenBank中比對(duì)以獲得序列信息, 并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。將序列信息提交至GenBank中的核苷酸數(shù)據(jù)庫(kù)中。

1.2.3 腸道微生物總DNA提取

采用細(xì)菌基因組提取試劑盒(Bioteke)提取腸道微生物總DNA, 操作步驟按照產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。提取的總DNA采用微量核酸定量?jī)x(Nano drop 2000)測(cè)定DNA濃度, 置-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4 PCR-DGGE指紋圖譜分析

采用16S V3可變區(qū)通用引物(F357-GC和R518)對(duì)2個(gè)樣品中的腸道細(xì)菌進(jìn)行PCR -DGGE指紋分 析[7], 10%聚丙烯變性膠分離V3區(qū)擴(kuò)增片段, 變性劑梯度范圍為40% ～60%。每個(gè)加樣孔加入10×Loading buffer 10 μL和樣品PCR產(chǎn)物30 μL的混合樣品。先在40 V下電泳1 h, 然后80V電泳10～12 h。

凝膠染色, 電泳結(jié)束后, 凝膠于EB染液中染色20 min, 用Bio-Rad凝膠成像系統(tǒng)采集圖像。采用Quantity One(Bio-Rad Laboratories, CA, USA)軟件分析指紋圖譜。

2 結(jié)果與分析

2.1 皺紋盤(pán)鮑腸道細(xì)菌數(shù)量和組成

養(yǎng)殖組和野生組可培養(yǎng)的好氧及兼性厭氧菌數(shù)量分別為(3.50±0.85)×106個(gè)/g, (3.03±1.10)×106個(gè)/g。根據(jù)在2216E培養(yǎng)基上的不同菌落形態(tài)及菌體形態(tài)特征, 共分離到12類(lèi)細(xì)菌。從中選出具有代表性的43株菌株測(cè)序(GenBank登錄號(hào): JQ083308- JQ083350)結(jié)果表明: 這13類(lèi)細(xì)菌分別與8個(gè)屬相似度較高, 分別為弧菌屬(Vibrio)、玫瑰桿菌屬(Roseobacter)、希瓦氏菌屬(Shewanella)、芽孢桿菌屬(Bacillus)、需鹽桿菌屬(Salegentibacter)、火紅菌屬(Flammeovirga)、古名菌屬(Tamlana)、嗜瓊脂屬(Agarivorans)。其中, 火紅菌屬、古名菌屬、嗜瓊脂屬細(xì)菌具有降解瓊脂能力?；【饕N類(lèi)有Vibrio halioticoli、Vibrio cyclitrophicus、溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)和Vibrio Alcanivorax; 希瓦氏菌由Shewanella colwelliana、Shewanella pacifica組成; 養(yǎng)殖組和野生組每個(gè)個(gè)體的腸道菌群組成及比例見(jiàn)表1。

從表1可以看出, 養(yǎng)殖組同野生組皺紋盤(pán)鮑腸道菌群組成相似度很高, 共有優(yōu)勢(shì)菌均為Vibrio halioticoli。玫瑰桿菌屬、希瓦氏菌屬檢出率及比例較高, 可認(rèn)為是皺紋盤(pán)鮑腸道的次優(yōu)勢(shì)菌群。Vibrio halioticoli、玫瑰桿菌和希瓦氏菌在養(yǎng)殖組中的比例分別為76.47%±13.07%、9.74%±8.10%、6.54%±2.98%, 在野生組的比例分別為 81.89%±10.70%、7.74%±4.27%、10.28%±6.71%。其余種類(lèi)細(xì)菌的檢出率及所占比例都很低。其中, 芽孢桿菌僅在養(yǎng)殖組中檢出, 且檢出率較高(80%), 屬于養(yǎng)殖組的特異性細(xì)菌。此外, 從表中可以看出個(gè)體間腸道細(xì)菌組成和比例差異很大。

2.2 16S rDNA V3可變區(qū)指紋圖譜的建立及分析

針對(duì)兩種皺紋盤(pán)鮑腸道細(xì)菌的16S rDNA基因得到的DGGE指紋分析圖譜及模式圖(圖1): 養(yǎng)殖組和野生組條帶分別有14條與12條, 表明皺紋盤(pán)鮑腸道具有豐富的微生物區(qū)系。其中, 野生組泳道中12個(gè)條帶對(duì)應(yīng)位置均對(duì)應(yīng)有養(yǎng)殖組的條帶, 而養(yǎng)殖組泳道中band2、band7屬于特異性條帶; 共有條帶中band4、band5和band14豐度較高, 表明皺紋盤(pán)鮑腸道中優(yōu)勢(shì)的菌株種類(lèi)約為3種。用戴斯系數(shù)Cs(Dice coefficient)計(jì)算兩樣品的相似性[8],Cs=2j/(a+b)(j是樣品A與B間相同的條帶。a和b分別是各自的條帶數(shù)), 可知養(yǎng)殖組腸道菌群同野生組的相似性系數(shù)為92.31%(24/26)。

3 討論

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圖1 養(yǎng)殖組皺紋盤(pán)鮑及野生組皺紋盤(pán)鮑腸道細(xì)菌16S rDNA的PCR-DGGE指紋圖譜及模式圖 Fig.1 PCR-DGGE fingerprint and its pattern of the V3 region of 16S rDNA of the bacteria from the gastrointestinal of Haliotis discus hannai

關(guān)于海洋軟體動(dòng)物腸道菌群組成的研究相對(duì)于海水魚(yú)類(lèi)很少, 幾乎大多數(shù)的研究表明海水魚(yú)類(lèi)腸道的優(yōu)勢(shì)菌同海水中優(yōu)勢(shì)菌群結(jié)構(gòu)一致, 均為弧菌 或假單胞菌[9]。Tanaka等[10]采用常規(guī)培養(yǎng)方法分析了日本海域的不同發(fā)育階段皺紋盤(pán)鮑腸道內(nèi)細(xì)菌變化規(guī)律: 1齡后的個(gè)體微生物區(qū)系趨于穩(wěn)定, 主要為具海藻酸降解酶活力的不動(dòng)發(fā)酵菌(Alginolytic、 non-motile fermenters)、弧菌屬(Vibrio)、噬纖維菌屬(Cytophaga), 其中, NMF(non-motile fermenters)細(xì)菌占腸道菌群總數(shù)量的80%以上,V. halioticoli占 NMF的96%。從大連海域皺紋盤(pán)鮑腸道菌群結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn), 野生與人工養(yǎng)殖主要由V. halioticoli(比例≥76%)、玫瑰桿菌(比例≥7.74%)和希瓦氏菌(比例≥6.54%)組成, 同日本海域皺紋盤(pán)鮑腸道菌群組成具有一定的差異。大連海域的皺紋菌群中V. halioticoli占主導(dǎo), 希瓦氏菌和玫瑰桿菌檢出數(shù)量較多, 但并未檢出噬纖維菌; 希瓦氏菌和玫瑰桿菌均為海水中豐度較高的細(xì)菌, 在很多水生動(dòng)物腸道內(nèi)及藻類(lèi)表面均有發(fā)現(xiàn)[11-13], 可能通過(guò)皺紋盤(pán)鮑攝食進(jìn)入腸道內(nèi)并定植。有研究表明水域環(huán)境對(duì)魚(yú)類(lèi)腸道微生物菌群結(jié)構(gòu)具有顯著的影響[14], 日本海域同大連海域皺紋盤(pán)鮑腸道菌群組成的差異的原因可能是由于水域環(huán)境的不同。

對(duì)比大連海域養(yǎng)殖組和野生組個(gè)體間腸道菌群組成, 總體上看, 野生組和養(yǎng)殖組腸道細(xì)菌組成差異很小。關(guān)于魚(yú)類(lèi)的腸道菌群研究中有報(bào)道表明不同種類(lèi)魚(yú)的腸道菌群具有特異性, 這可能與自身免疫有關(guān)[15-16], 而皺紋盤(pán)鮑在不同養(yǎng)殖環(huán)境下的腸道菌群組成的高度相似性同樣反映了貝類(lèi)腸道對(duì)其共生細(xì)菌具有特異選擇性。值得注意的是, 芽孢桿菌僅在養(yǎng)殖組中檢出, 其來(lái)源于人工養(yǎng)殖環(huán)境或餌料有待于進(jìn)一步研究。

Sawabe等[6]報(bào)道皺紋盤(pán)鮑腸道可培養(yǎng)的細(xì)菌數(shù)量為106～109個(gè)/g, 本研究中皺紋盤(pán)鮑可培養(yǎng)的好氧及兼性厭氧菌的平均數(shù)約為106個(gè)/g, 與之相比處于正常水平。另外, Ring? 等[17]指出魚(yú)類(lèi)不同個(gè)體間由于受攝食、健康狀況等不定因素的影響, 腸道細(xì)菌數(shù)量存在較大差異, 與本文研究結(jié)果相符。

分析16S rDNA 指紋圖譜表明, 養(yǎng)殖組和野生組皺紋盤(pán)鮑腸道細(xì)菌組成的相似度很高(Cs=92.31%), 同常規(guī)培養(yǎng)方法得到的結(jié)果相吻合。養(yǎng)殖組和野生組有12個(gè)共有條帶, 養(yǎng)殖組有2條特異性條帶(band2、band7), 進(jìn)一步說(shuō)明了養(yǎng)殖皺紋盤(pán)鮑腸道菌群結(jié)構(gòu)同野生皺紋盤(pán)鮑發(fā)生了改變, 但人工組兩條特異性條帶的豐度相對(duì)較低, 說(shuō)明其所代表的細(xì)菌在腸道中的數(shù)量并不占優(yōu)勢(shì)。外來(lái)細(xì)菌在皺紋盤(pán)鮑腸道菌群中不能占優(yōu)勢(shì)的原因可能與皺紋盤(pán)鮑對(duì)腸道共生微生物的特異選擇性相關(guān)。

鮑魚(yú)是海洋植食性動(dòng)物, 腸道細(xì)菌對(duì)降解海藻及營(yíng)養(yǎng)合成具有重要的作用[18-19], 對(duì)分離得到的腸道細(xì)菌的特性進(jìn)行研究可以更加深入了解皺紋盤(pán)鮑腸道細(xì)菌的共生關(guān)系。在下一步的工作中, 作者將通過(guò)對(duì)皺紋盤(pán)鮑腸道細(xì)菌產(chǎn)酶和拮抗能力進(jìn)行研究, 并將指紋圖譜上的條帶回收測(cè)序, 確定皺紋盤(pán)鮑腸道微生物區(qū)系, 以便于深入了解皺紋盤(pán)鮑腸道微生態(tài)規(guī)律, 為鮑魚(yú)專用益生菌的開(kāi)發(fā)奠定基礎(chǔ)。

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