張劍美， 王 娟， 宋春艷， 袁宗麗， 陳岳祥

(第二軍醫(yī)大學長征醫(yī)院消化內(nèi)科，上海200003)

潰瘍性結(jié)腸炎(ulcerative colitis，UC)是一種腸道非特異性炎癥反應，其病因尚不明確，發(fā)病機制復雜，與環(huán)境因素、遺傳易感性、感染因素、免疫反應等均有密切關(guān)系，尤其是腸道黏膜屏障功能及黏膜免疫應答在UC 的發(fā)生、發(fā)展、變化、轉(zhuǎn)歸過程中發(fā)揮著重要作用［1］。其病情遷延反復，難以有效控制，目前仍缺乏有效的治療藥物。

腸道黏膜為腸腔天然屏障，主要由腸上皮細胞組成，阻止病原菌或有毒大分子物質(zhì)侵入黏膜，有效隔離體內(nèi)外環(huán)境。其選擇通透性功能保證了機體所需營養(yǎng)物質(zhì)選擇性吸收和轉(zhuǎn)運，有效維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定。近年研究發(fā)現(xiàn)肝細胞核因子4α(hepatocyte nuclear factor 4α，HNF4α)在維持腸道屏障結(jié)構(gòu)及功能方面發(fā)揮重要作［2］。HNF4α 為配體激活核轉(zhuǎn)錄因子，屬于核受體超家族成員，是HNFs 家族中HNF4蛋白一種亞型，以同源二聚體形式存在，通過與順式作用元件結(jié)合，使染色體解聚，激活靶基因表達［3］。HNF4α 可通過乙酰化、甲基化、磷酸化以及與Smad3或Smad4 結(jié)合調(diào)節(jié)其自身活性，從而發(fā)揮多種生物學功能。HNF4α 在腸道組織中主要表達于腸上皮細胞，調(diào)控腸上皮細胞的增殖、分化、凋亡，維持腸道黏膜的穩(wěn)態(tài)［4］。

本實驗旨在通過觀察HNF4α 在不同濃度DSS誘導的小鼠實驗性結(jié)腸炎腸黏膜中的表達情況，探討其與腸道黏膜屏障中重要連接蛋白:內(nèi)皮型鈣黏蛋白(E-cadherin，E-CAD)、連接黏附分子1(junctional adhesion molecule 1，JAM-1)、橋粒糖蛋白2(desmocollin 2，DSC-2)的關(guān)系，明確其在結(jié)腸炎發(fā)生、發(fā)展中的作用。

材 料 和 方 法

1 動物

BALB/c 小鼠22 只，SPF 級，雄性，6 周齡，體重20 ～22 g ，由上海斯萊克實驗動物中心提供。

2 試劑

DSS 分子量36 ～50 kD，購自MP 生物醫(yī)學公司;HE 染色試劑，解放軍第411 醫(yī)院病理科提供;小鼠抗人HNF4αⅠ抗(人鼠通用)，購自R＆D;HRP 標記抗鼠/兔通用型免疫組化檢測Ⅱ抗和DAB 顯色試劑盒購自Dako;Trizol、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR Green PCR試劑盒購自TaKaRa 公司。

3 方法

3.1 分組及造模 小鼠稱重、編號，隨機分為3 組:正常對照組(n =6)、2%DSS 組(n =6)和2.5%DSS組(預實驗中2.5%DSS 誘導后可出現(xiàn)個體死亡，故增加該組樣本數(shù)，n =10)。清潔級動物房飼養(yǎng)1 周后，分別給小鼠自由飲用普通飲用水(對照組)和分別含有2%、2.5%DSS 的飲用水，連續(xù)6 d，建立小鼠急性結(jié)腸炎模型。造模結(jié)束后，頸椎脫臼法處死所有小鼠，采集末端結(jié)腸標本備用。

3.2 小鼠一般情況觀察及疾病活動指數(shù)評分 造模過程中，每天觀察各組小鼠的體重變化、大便性狀、便血情況并進行疾病活動指數(shù)(disease activity index，DAI)評分［5］。體重變化:無下降，0 分;下降1% ～5%，1 分;下降5% ～10%，2 分;下降10% ～15%，3 分;下降＞15%，4 分。大便性狀:正常，0 分;松散，2 分;稀便，4 分。便血程度:正常，0 分;少量便血，2 分;重度血便，4 分。DAI =體重下降+大便性狀+便血程度。

3.3 結(jié)腸組織學損傷評分 取結(jié)腸組織石蠟切片常規(guī)脫蠟至水，蘇木素液染核，鹽酸酒精分化，氨水返藍，伊紅染色數(shù)秒，逐級脫水、透明、中性樹膠封片。染色結(jié)果:細胞核呈藍黑色，細胞質(zhì)呈淡紅色。組織損傷學評分如下［6］:炎癥嚴重程度:無，0 分;輕度，1 分;中度，2 分;重度，3 分。病變深度:無，0 分;黏膜下層，1 分;肌層，2 分;漿膜層，3 分。隱窩破壞:無，0 分;基底1/3 被破壞，1 分;基底2/3 被破壞，2分;僅有完整表面上皮，3 分;全部隱窩和上皮被破壞，4 分。病變范圍:1% ～25%，1 分;26% ～50%，2分;51% ～75%，3 分;76% ～100%，4 分。組織學損傷評分=炎癥嚴重程度+病變深度+隱窩破壞+病變范圍。

3.4 免疫組織化學染色 取結(jié)腸組織石蠟切片常規(guī)脫蠟至水，堿修復液熱修復抗原，山羊血清封閉，HNF4αⅠ抗(1∶200 稀釋)4 ℃過夜，次日滴加標記有HRP 的抗鼠/兔通用型Ⅱ抗室溫孵育，DAB(1∶70 稀釋)室溫顯色，鏡下控制反應時間。蘇木素輕度復染，逐級脫水、透明、中性樹膠封片。染色結(jié)果判定:HNF4α 蛋白定位于細胞核，呈棕黃色顆粒。根據(jù)陽性染色范圍，將免疫組化切片用專業(yè)圖像分析軟件Image-Pro Plus 6.0 進行半定量分析，每張切片掃4個視野，用圖像分析系統(tǒng)測量陽性染色面積并自動計算其與總面積的百分比。

3.5 實時熒光定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應( real-time RT-PCR) Trizol 法提取結(jié)腸組織RNA，-80 ℃冰箱保存。取1 μg RNA 按說明書進行逆轉(zhuǎn)錄反應合成cDNA，用于PCR 擴增。PCR 引物采用Primer Premier 5 設(shè)計，由上海英濰捷基公司合成，引物序列見表1。Real-time RT-PCR 反應條件為:95 ℃預變性30 s，之后95 ℃5 s，60 ℃34 s，40 個循環(huán)后進行溶解曲線檢測。數(shù)據(jù)處理采用2-ΔΔCt法。

表1 目的基因引物序列Table 1. The sequences of the primers for target genes

4 統(tǒng)計學處理

采用SPSS 18.0 統(tǒng)計軟件，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差(mean±SD)表示，Kolmogorov-Smirnov 方法進行正態(tài)性檢驗，Levene 方法進行方差齊性檢驗，多樣本均數(shù)間的比較符合方差齊性采用LSD-t 檢驗，方差不齊采用Kruskal-Wallis H 檢驗，雙變量相關(guān)性分析符合正態(tài)分布采用Pearson 方法，不符合正態(tài)分布則采用Spearman 方法。以P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

結(jié) 果

1 小鼠一般情況及DAI 評分

DSS 處理組小鼠造模后出現(xiàn)不同程度的體重下降、腹瀉、便血，毛發(fā)無光澤，飲食明顯減少，懶動等。正常對照組小鼠大便正常，體重增加，毛發(fā)有光澤，反應靈敏，活動正常。與對照組(0.00 ±0.00)相比，造模第6 天2%DSS 組DAI(5.00 ±1.79)明顯增高(P ＜0.01)，2.5%DSS 組(9.90 ±1.52)升高更顯著(P ＜0.01)。

2 小鼠結(jié)腸黏膜損傷及炎癥細胞因子表達情況

光鏡下，DSS 處理組小鼠結(jié)腸黏膜結(jié)構(gòu)出現(xiàn)不同程度損傷，可見廣泛的黏膜糜爛、出血、大面積深層潰瘍，呈明顯的急性炎癥反應，上皮細胞脫落，大部分腺體被破壞，腺管排列紊亂，黏膜及黏膜下層大量炎性細胞浸潤，黏膜下層新生小血管形成，有的區(qū)域腺體完全喪失，炎細胞浸潤全層，見圖1。2%DSS組小鼠結(jié)腸組織學評分(7.00 ± 0.90)較對照組(0.00 ±0.00)明顯升高(P ＜0.01)，2.5%DSS 組評分(11.70 ±0.90)升高更顯著(P ＜0.01)。正常組小鼠腸黏膜中腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factorα，TNF-α)和白細胞介素1β(interleukin-1β，IL-1β)mRNA 表達水平較低，經(jīng)過DSS 誘導6 d 腸黏膜中炎癥因子TNF-α 和IL-1β mRNA 出現(xiàn)不同程度升高，2.5%DSS 組升高更明顯(P ＜0.05)，見圖2。'

Figure 1. HE staining of mouse colon tissues. A1 and A2:control;B1 and B2:2%DSS;C1 and C2:2.5%DSS.圖1 小鼠結(jié)腸組織HE 染色

Figure 2. Relative mRNA expression of TNF-α and IL-1β in colontissues. Mean±SD. * P ＜0.05，＊＊P ＜0.01 vs control.圖2 小鼠結(jié)腸組織中TNF-α 和IL-1β mRNA 的表達

3 小鼠腸黏膜HNF4α mRNA 及蛋白表達變化

正常組小鼠腸上皮細胞中HNF4α mRNA(1.00±0.19)及蛋白表達(1.00 ±0.15)水平均較高，免疫組化染色顯示HNF4α 主要定位在細胞核，呈棕黃色顆粒，見圖3。經(jīng)DSS 誘導6 d 2% DSS 組小鼠HNF4α mRNA(0.29 ±0.08)及蛋白表達量(0.27 ±0.12)較正常組明顯減少(P ＜0. 01)，2. 5% DSS組HNF4α mRNA(0.10 ±0.11)及蛋白水平(0.11 ±0.07)下降更顯著(P ＜0.01)。

4 HNF4α 蛋白表達水平與疾病嚴重程度的相關(guān)性

采用Pearson 方法分析小鼠腸黏膜中HNF4α 蛋白表達水平與DAI 及結(jié)腸損傷組織學評分的相關(guān)性，結(jié)果顯示隨著HNF4α 蛋白表達水平降低，DAI及組織學評分增高，相關(guān)系數(shù)r 分別為-0.88 和-0.93，呈顯著負相關(guān)(P ＜0.01)。

Figure 3. Protein expression of HNF4α in colon tissues (upper panels，immunohistochemistry staining with HNF4α;lower panels，immunohistochemistry staining with HNF4α and nucleus). A1 and A2:control;B1 and B2:2%DSS;C1 and C2:2.5%DSS.圖3 小鼠結(jié)腸組織中HNF4α 蛋白的表達

5 HNF4α mRNA 表達水平與細胞間連接蛋白的相關(guān)性

正常組小鼠腸黏膜中E-CAD、JAM-1 和DSC-2 mRNA 表達水平較高。2%DSS 組小鼠腸黏膜中ECAD、JAM-1 和DSC-2 出現(xiàn)不同程度減少，2.5%DSS組下降更明顯(P ＜0.01)。對HNF4α 與上述連接蛋白mRNA 進行Pearson 相關(guān)性分析，發(fā)現(xiàn)隨著HNF4α 表達減少，E-CAD、JAM-1 和DSC-2 表達均有下降，相關(guān)系數(shù)分別為0.96、0.73 和0.59，呈明顯正相關(guān)(P ＜0.01)。

討 論

DSS 誘導動物實驗性結(jié)腸炎是當今研究潰瘍性結(jié)腸炎的經(jīng)典模型之一，其癥狀和腸道改變與人類UC 相似［7］。本研究中模型組小鼠DAI 升高，組織病理學損傷加重，炎癥因子(TNF-α 和IL-1β)表達顯著上升，細胞間連接蛋白(E-CAD、JAM-1 和DSC-2)表達則明顯下調(diào)。E-CAD、JAM-1 和DSC-2 分別為緊密連接、黏附連接和橋粒的重要成員，參與維持腸道天然屏障結(jié)構(gòu)及功能，在封閉細胞旁間隙中具有重要作用［8］。研究認為細胞間連接若被破壞，腸道通透性增加，更易誘發(fā)結(jié)腸炎［9］。所以尋找可調(diào)控炎癥因子或連接蛋白的上游基因成為研究焦點。

近年研究發(fā)現(xiàn)HNF4α 是重要的腸道屏障功能基因，在UC 發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用。腸上皮細胞中HNF4α 基因表達缺陷可導致細胞形態(tài)異常，細胞間連接松散［10］。胎鼠結(jié)腸缺乏HNF4α 基因則無法形成正常結(jié)腸結(jié)構(gòu)，成年小鼠結(jié)腸缺乏HNF4α 基因則會導致腸上皮細胞分化受阻，細胞間隙增寬，數(shù)月后可出現(xiàn)自發(fā)性結(jié)腸炎，經(jīng)DSS 誘導則可在數(shù)日內(nèi)誘發(fā)急性結(jié)腸炎［11-13］。本研究中模型組小鼠腸道中HNF4α 表達明顯下降，作為重要的腸道功能蛋白，HNF4α 對疾病嚴重程度是否有影響?我們采用Pearson 方法進行相關(guān)性分析，結(jié)果提示隨著HNF4α表達降低，炎癥程度、病變范圍均有加重，兩者間呈明顯負相關(guān)。

為了進一步明確HNF4α 通過何種機制來影響炎癥嚴重程度，我們分析了HNF4α 與連接蛋白、炎癥因子之間的關(guān)系，結(jié)果表明HNF4α 與屏障連接蛋白E-CAD、JAM-1、DSC-2 表達水平呈明顯正相關(guān)，但與炎癥因子間相關(guān)性無統(tǒng)計學差異。這與Battle等［10］沉默肝細胞中HNF4α 基因表達導致多種連接蛋白表達缺失(如黏附連接中的E-CAD、緊密連接中的JAM-1、橋粒連接中的DSC-2 等)的結(jié)果相仿。故我們認為HNF4α 下調(diào)可導致細胞間連接蛋白減少，進而損傷腸道黏膜屏障，削弱腸道自我防護能力，這可能是UC 發(fā)病機制之一。然而本研究局限于初步分析，HNF4α 對E-CAD、JAM-1 和DSC-2 的具體調(diào)控機制仍有待進一步研究證實，也將是我們下一步研究重點。

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