高伊星， 唐中偉， 袁志兵， 劉 春， 徐 剛， 陳德偉， 高鈺琪， 阮懷珍△

(第三軍醫(yī)大學1基礎部神經(jīng)生物學教研室，2高原軍事醫(yī)學系病理生理學與高原生理學教研室，3高原醫(yī)學教育部重點實驗室，重慶400038)

低氧環(huán)境可引起人體一定程度的生理功能障礙和病理生理變化。機體約20%的氧是由腦消耗的，因此中樞神經(jīng)系統(tǒng)對缺氧反應尤為敏感。研究表明，低氧環(huán)境下，中樞神經(jīng)系統(tǒng)的谷氨酸等神經(jīng)遞質代謝紊亂，嚴重時甚至可造成神經(jīng)元功能的丟失［1］和胚胎大鼠神經(jīng)干細胞凋亡［2］。有關高原缺氧對學習記憶功能的影響的研究結果不盡一致。我們以往研究發(fā)現(xiàn)，大鼠在胚胎期及新生期處于高原低氧的環(huán)境中其學習記憶能力受到抑制，可能與低氧環(huán)境下海馬區(qū)域NMDA 受體的數(shù)量和功能相關［3］，但也有研究報道，間斷性缺氧對新生大鼠的學習記憶功能沒有影響［4］，甚至有促進作用［5］。但對于成年期動物而言，連續(xù)性高原缺氧環(huán)境暴露是否影響其空間學習和記憶功能尚缺乏研究。本文旨在探討急性和慢性高原持續(xù)性缺氧對成年大鼠空間學習和記憶功能的影響。

材 料 和 方 法

1 材料

1.1 動物和分組 成年雄性SD 大鼠(由第三軍醫(yī)大學大坪醫(yī)院動物實驗中心提供)，起始體質量160 g ～180 g。動物先在光/暗周期為12 h/12 h、光照時間(8:00 ～20:00)的條件下飼養(yǎng)適應3 d。本實驗分為三部分。實驗一:隨機分為平原組(A 組)和急性高原缺氧組(B 組)，每組15 只;實驗二:隨機分為平原組(C 組)和慢性高原缺氧組(D 組)，每組13 只;實驗三:隨機分為平原組(E 組)和急性高原缺氧組(F 組)，每組15 只。

1.2 主要儀器 高原低壓環(huán)境模擬艙(第三軍醫(yī)大學高原軍事醫(yī)學系);Morris 水迷宮(中國醫(yī)學科學院藥物所)。

2 方法

2.1 高原缺氧模型制備 B 組置于低壓艙模擬海拔7 000 m高原，連續(xù)暴露72 h 后返回平原，24 h 后兩組同時進行Morris 水迷宮定位巡航實驗和空間探索實驗;D 組置于低壓艙模擬海拔6 000 m 高原，連續(xù)暴露35 d 后返回平原，24 h 后同時進行Morris 水迷宮定位巡航實驗和空間探索實驗。F 組于Morris水迷宮定位巡航實驗和空間探索實驗后置于低壓艙模擬海拔7 000 m 高原，連續(xù)暴露72 h 后返回平原，2 h 后進行空間探索實驗。

2.2 Morris 水迷宮實驗 實驗一:A 組和B 組大鼠進行水迷宮實驗，將各組大鼠在開始訓練前取出平臺在水中適應20 s，再進行學習訓練，連續(xù)訓練3 d，每天4 次，記錄大鼠尋找平臺的時間(逃避潛伏期)。如果時間超過120 s 大鼠未尋找到平臺，則引導大鼠至平臺并停留20 s，第4 d 行120 s 的空間探索實驗，記錄大鼠穿越平臺的次數(shù)、在目標象限停留的時間、在目標象限的行進速度和第一次尋找到平臺的時間。實驗二:C 組和D 組大鼠進行水迷宮學習訓練，連續(xù)訓練5 d，每天4 次，第6 天行空間探索實驗(方法同前)，所記錄數(shù)據(jù)同前。實驗三:E 組和F 組均先進行連續(xù)5 d 的學習訓練，第6 天行空間探索實驗后，F(xiàn) 組于低壓艙模擬海拔7 000 m 連續(xù)暴露72 h 后返回平原，2 h 后行空間探索實驗(方法同前)，所記錄數(shù)據(jù)同前。所有實驗過程中保持實驗室的光線和環(huán)境布局不變。

3 統(tǒng)計學處理

數(shù)據(jù)以均數(shù)± 標準差(mean ± SD)表示，采用SPSS 16.0 軟件包分析，用t 檢驗進行組間比較，以P ＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結 果

1 急性高原缺氧對大鼠空間學習和記憶能力的影響

以Morris 水迷宮實驗檢測大鼠空間學習記憶力。在定位巡航實驗中，急性高原缺氧組(B 組)在第1 天的逃避潛伏期較平原組(A 組)顯著縮短(P ＜0.05)。在第2 天和第3 天的巡航實驗中，兩組的逃避潛伏期較第1 天顯著縮短(P ＜0.05)，但A、B 兩組間無顯著差異(P ＞0.05)，見表1。第4 天在撤去平臺后120 s 內兩組動物穿越平臺的次數(shù)及在目標象限停留時間的百分比均無顯著差異(P ＞0.05)，見表2。

2 慢性高原缺氧對大鼠空間學習和記憶能力的影響

在定向巡航實驗中，平原對照組(C 組)和慢性高原缺氧組(D 組)逃避潛伏期均隨著訓練天數(shù)增加而縮短，但在各個時點上2 組大鼠的逃避潛伏期相比均無顯著差異(P ＞0.05)，見表3。第6 天撤去平臺后，C 組大鼠和D 組大鼠120 s 內跨越平臺的次數(shù)及在目標象限停留時間的百分比等均無顯著差異(P ＞0.05)，見表4。

表1 急性高原缺氧對大鼠空間學習能力的影響Table 1. Effects of acute hypobaric hypoxia on spatial learning of rats (mean±SD.n=15)

表2 急性高原缺氧對大鼠空間記憶能力的影響Table 2. Effects of acute hypobaric hypoxia on spatial memory of rats (mean±SD.n=15)

表3 慢性高原缺氧對大鼠空間學習能力的影響Table 3. Effects of chronic hypobaric hypoxia on spatial learning of rats (mean±SD.n=13)

表4 慢性高原缺氧對大鼠空間記憶能力的影響Table 4. Effects of chronic hypobaric hypoxia on spatial memory of rats (mean±SD.n=13)

3 急性缺氧對大鼠空間記憶維持的影響

為了檢測缺氧對于大鼠空間記憶維持的影響，在缺氧前對大鼠進行定位巡航實驗，連續(xù)訓練5 d，每天4 次，第6 天進行空間探索實驗后，隨機分為平原組(E 組)和急性高原缺氧組(F 組)，F(xiàn) 組急性高原缺氧72 h，2 h 后行空間探索實驗，結果顯示，兩組大鼠穿越平臺的次數(shù)及在目標象限停留時間的百分比等均無顯著差異(P ＞0.05)，見表5。

表5 急性高原缺氧對大鼠空間記憶能力維持的影響Table 5. Effects of acute hypobaric hypoxia on spatial memory maintenance of rats (mean±SD.n=15)

討 論

研究表明，高原缺氧可影響機體的計算、判斷、精細操作等認知功能，但其是否影響成年動物空間學習、記憶能力以及學習所獲得的空間位置覺和方向覺的維持尚缺乏研究。Morris 水迷宮是一種經(jīng)典的檢測動物空間位置覺和方向覺(空間定位)的學習、記憶能力的方法［6］。大量文獻表明動物在水迷宮實驗中的表現(xiàn)通常與海馬回路的長時程增強(long-term potentiation，LTP)產(chǎn)生及NMDA 受體功能密切相關［7-9］。在本實驗中，我們發(fā)現(xiàn)在急性高原缺氧后，大鼠在第1 d 的巡航實驗中其學習能力較平原組大鼠顯著增加，而隨后幾天的巡航實驗和最后1 d的空間探索中與平原組相比沒有顯著差異;而慢性缺氧的大鼠在整個實驗過程中與平原組大鼠相比均無顯著差異。這些結果表明成年期大鼠在急、慢性缺氧后其空間位置覺和方向覺(空間定位)的學習、記憶能力并未受到明顯抑制，甚至在急性缺氧再復氧后的短期(1 d)內學習能力有一定提升。

長期以來，人們普遍認為缺氧會抑制海馬神經(jīng)元功能，從而導致其學習記憶能力降低。一些人體研究表明，登山或者在低壓艙模擬高原缺氧暴露可導致學習、記憶功能受損［10-11］。在動物實驗方面，也有研究報道缺氧會引起學習記憶能力的衰退。Mikati 等［4］報道，新生大鼠出生后急性缺氧至P10，其成年后(P80)學習記憶能力明顯下降。Simonova等［12］將大鼠在出生后即行間斷性缺氧至第19 天，然后在P23 ～P32 和P100 ～P109 時對大鼠進行水迷宮實驗，結果顯示缺氧組大鼠的逃生潛伏期較對照組大鼠顯著延長。我們以往的研究也發(fā)現(xiàn)低氧幼鼠和低氧孕鼠所生子鼠在其平均逃生潛伏期明顯高于正常對照組［3］。這些研究結果表明高原低氧可造成胚胎期或新生期動物的學習、記憶能力受損，其機制可能與缺氧影響神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育等因素有關。

近年來，有越來越多的文獻對缺氧是否引起機體學習記憶功能減退提出了不一致的觀點。Mikati等［4］研究發(fā)現(xiàn)出生后的大鼠慢性缺氧后其水迷宮實驗表現(xiàn)與對照組大鼠相比無顯著差異。此外，有研究表明缺氧對于大腦學習和記憶功能具有促進作用。Wittner 等［5］研究發(fā)現(xiàn)，出生后30 d 的大鼠短暫缺氧后，其逃避潛伏期較對照組大鼠顯著縮短，探索效率(search efficiencies for the memory acquisition test)顯著升高。Zhang 等［13］報道，大鼠出生后即行模擬海拔2 000 m 和5 000 m 高原的間斷性缺氧4 周后，其逃生潛伏期較對照組顯著縮短。而同樣的缺氧方式在成年大鼠則表現(xiàn)為水迷宮實驗沒有明顯差異，但在穿梭箱(shutter-box)實驗中，海拔5 000 m 缺氧25 d 的大鼠其有效回避反應顯著減少，該研究認為高原低壓缺氧抑制了海馬-非依賴性的認知，而對海馬-依賴性的學習記憶功能沒有顯著影響［14］。上述這些研究中所采用的缺氧方式、強度以及持續(xù)時間均有所不同，這可能是這些研究得到的結論不一致的重要原因。上述研究中采用的均是間歇性缺氧的模式，有關持續(xù)性不間斷高原缺氧暴露對成年動物學習記憶能力影響的報道匱乏。本研究采用持續(xù)性不間斷模擬高原缺氧的模式，這更接近真實的高原缺氧環(huán)境，更有利于準確反映高原缺氧對機體學習記憶的影響。

本研究結果顯示，急、慢性持續(xù)性高原缺氧暴露后，成年大鼠的空間位置覺和方向覺(空間定位)的學習、記憶能力并未受到明顯抑制，我們推測其可能是由于缺氧誘導中樞神經(jīng)系統(tǒng)產(chǎn)生某些內源性保護機制。研究表明，低氧可以促進神經(jīng)干細胞增殖，抑制其凋亡，并誘導其分化，從而可能對大腦損傷有潛在的修復能力［15］。另一方面，低氧刺激興奮性氨基酸、多巴胺等神經(jīng)遞質的釋放可能也參與其中，但具體的機制尚有待進一步研究。我們以往的研究結果顯示，模擬高原缺氧(7 000 m，2.5 h/d，3 d)對小鼠海馬CA1 區(qū)的神經(jīng)元結構和密度無顯著影響［16］。Langmeier 等［17］的研究也顯示，出生后1 d 的大鼠暴露于模擬高原環(huán)境(7 000 m，8 h/d，18 d)，1 周后觀察腦組織的形態(tài)學變化，未見細胞結構顯著損傷。在本研究中我們檢測了慢性高原缺氧大鼠海馬的形態(tài)學變化和與學習記憶功能密切相關的突觸素的表達，結果顯示無顯著變化(數(shù)據(jù)未列出)?？傊?，高原缺氧環(huán)境下機體不同類型學習記憶功能的變化特點、規(guī)律及其機制有待進一步深入研究。

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