王少敏， 葉小磊， 倪曙民， 趙廷啟， 葉 孟△

(1寧波大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院腫瘤內(nèi)科，2寧波市醫(yī)學(xué)科學(xué)研究所，浙江 寧波315020)

BCL-3 基因最初發(fā)現(xiàn)于B 細(xì)胞慢性淋巴細(xì)胞白 血病(B-cell chronic lymphocytic leukemia，B-CLL)的一個亞型中，并被認(rèn)為是其分子特征。此后的研究顯示，BCL-3 在血液腫瘤及實體腫瘤中均可見過度或失控表達(dá)，并可對促進腫瘤形成的基因進行調(diào)控，發(fā)揮著促進腫瘤形成的作用［1］。但BCL-3 在大腸癌中的表達(dá)狀況鮮有報道，有報道顯示其在結(jié)直腸癌轉(zhuǎn)移灶的表達(dá)與預(yù)后存在相關(guān)性［2］。本課題組之前的研究表明，BCL-3 在結(jié)直腸癌組織中主要表達(dá)于胞核;BCL-3 在癌旁組織及正常結(jié)直腸黏膜中主要表達(dá)于胞漿，而胞核表達(dá)較低［3］。為進一步探索BCL-3對結(jié)直腸癌細(xì)胞生物學(xué)特性的影響，本研究通過慢病毒技術(shù)構(gòu)建干擾BCL-3 基因表達(dá)的慢病毒載體系統(tǒng)，在高表達(dá)BCL-3 的結(jié)直腸癌細(xì)胞株中穩(wěn)定沉默BCL-3 基因，并進一步探索該基因沉默后對細(xì)胞增殖和藥物敏感性的影響。

材 料 和 方 法

1 材料

慢病毒載體包括pLKO. 1-TRC-eGFP、pΔ8. 91(病毒輔助質(zhì)粒)及pMD2. G(輔助質(zhì)粒，編碼VSVG)，慢病毒載體、DMEM 培養(yǎng)基及293T 細(xì)胞株購自北京中原公司;人大腸癌細(xì)胞株購自中科院上海生化細(xì)胞所細(xì)胞庫;慢病毒由293T 細(xì)胞包裝制備得到。5-氟尿嘧啶、奧沙利鉑和伊立替康等化合物均購自Sigma。質(zhì)粒小抽試劑盒以及分子克隆所用的內(nèi)切酶均購自上海生工生物工程有限公司。其它試劑如嘌呤霉素及磷酸鈣轉(zhuǎn)染試劑等均為分子生物學(xué)或者分析純級別。本研究所用到的抗體均購自Santa Cruz。

2 方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 人大腸癌細(xì)胞株LoVo、HT-29、RKO、SW620 和HCT-116 常規(guī)培養(yǎng)于含10%胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)的DMEM 培養(yǎng)液中，于37℃、飽和濕度、5% CO2培養(yǎng)箱中，3 ～4 d 傳代1次。取對數(shù)生長期細(xì)胞，按一定濃度接種培養(yǎng)用于實驗。

2.2 慢病毒表達(dá)載體構(gòu)建 將合成好的shRNA 寡核苷酸序列(共設(shè)計4 對BCL-3-shRNA 寡核苷酸序列，委托上海生工生物合成得到，見表1)退火形成雙鏈DNA 片段。與雙酶切線性化后的pLKO. 1-TRC載體(含GFP 編碼序列)連接。取4 μL 所得的連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5α 感受態(tài)細(xì)胞，37 ℃恒溫培養(yǎng)過夜。挑取3 個單克隆菌落接種至ampicillin 抗性的LB 培養(yǎng)液中，小搖過夜。用試劑盒小量提取質(zhì)粒后，分別用EcoR I 和NcoI 酶切鑒定，產(chǎn)物進行1%瓊脂糖凝膠電泳。鑒定正確的質(zhì)粒命名為:pLKO. 1-TRCBCL-3-shRNA。將酶切鑒定正確的細(xì)菌培養(yǎng)擴增，取凍存菌液用于測序以進一步確認(rèn)。

表1 4 對BCL-3-shRNA 寡核苷酸序列Table 1. Sequences of four pairs of BCL-3-shRNA oligonucleotide

2.3 慢病毒顆粒包裝 轉(zhuǎn)染前1 d 對293T 細(xì)胞進行分皿。使用磷酸鈣轉(zhuǎn)染法將含GFP 以及各個BCL-3-shRNA 的表達(dá)質(zhì)粒，連同pΔ8.91 及pMD2. G這2 個包裝質(zhì)粒按照5∶3∶2 的質(zhì)量比共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞。12 h 后更換完全培養(yǎng)基，24 h 后就可以有GFP 熒光蛋白表達(dá)。37 ℃培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)，并在熒光顯微鏡下觀察熒光表達(dá)情況。48 ～72 h 期間收集上清，0. 45 μm 濾器過濾培養(yǎng)液上清后凍存于-80 ℃冰箱中備用。

2.4 慢病毒感染 取對數(shù)生長期大腸癌細(xì)胞，接種于6 孔板培養(yǎng)12 h 后，棄上清每孔滴加病毒懸液200 μL，加入含polybrene (4 mg/L)的培養(yǎng)基，感染8 h后換普通培養(yǎng)基;48 h 后加含嘌呤霉素(0. 5 mg/L)的培養(yǎng)基，隔2 d 更換該培養(yǎng)基。3 次篩選后加普通培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h 后收集細(xì)胞于培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)，進行后續(xù)實驗。

2.5 RT-PCR 收集各組細(xì)胞，用Trizol 提取細(xì)胞總RNA，使用MMLV 逆轉(zhuǎn)錄酶逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。以各組cDNA 為模板，加入緩沖液、引物等進行PCR，各樣本重復(fù)3 次。BCL-3 上游引物序列5’-CCG GAG GCG CTT TAC TAC C -3’，下游引物序列5’-TAG GGG TGT AGG CAG GTT CAC -3’;GAPDH 內(nèi)參照上游引物序列5’-GGT CGT ATT GGG CGC CTG GTC ACC-3’，下游引物序列5’-CAC ACC CAT GAC GAA CAT GGG GGC-3’。PCR 結(jié)束后加入上樣緩沖液后對產(chǎn)物進行1.5%的瓊脂糖電泳，凝膠成像系統(tǒng)觀察結(jié)果。

2.6 Western blotting 檢測 冷的PBS 淋洗細(xì)胞2遍，在RIPA 裂解液中冰上裂解細(xì)胞，提取細(xì)胞蛋白后在10% SDS-PAGE 膠上電泳。蛋白分離后經(jīng)恒流1.5 h 電轉(zhuǎn)移到PVDF 膜后，使用含5%脫脂牛奶的封閉液封閉1 h，與BCL-3 特異性抗體室溫孵育1 h或者4 ℃過夜后，次日加入Ⅱ抗室溫孵育1 h，TBST洗膜3 次，取出膜后加入ECL 發(fā)光液，暗室中壓片顯影。

2.7 細(xì)胞增殖 細(xì)胞增殖檢測使用MTT 法，實驗前1 d 細(xì)胞按1 ×104cells/well 鋪96 孔板，設(shè)shRNA 穩(wěn)定干擾組(經(jīng)過嘌呤霉素篩選后穩(wěn)定沉默BCL-3 的RKO 細(xì)胞)，vector 組(經(jīng)過嘌呤霉素篩選后的空白載體組)，每個時點設(shè)5 個復(fù)孔，分別于0 h、24 h、48 h、72 h 和96 h 收集細(xì)胞，加入5 g/L 的MTT 溶液，37℃孵育4 h 后，棄上清每孔加150 μL DMSO 后在酶標(biāo)儀上550 nm 處讀取吸光度(A550)。實驗重復(fù)3次。以時間和A550值繪制增殖曲線。

2.8 軟瓊脂克隆形成實驗 取對數(shù)生長期細(xì)胞，消化吹打成單細(xì)胞，活細(xì)胞計數(shù)，用含20% FBS 的DMEM 培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞密度至4 ×107/L。按1∶1 比例混合已高壓滅菌的1.2%瓊脂糖PBS 溶液和2 ×DMEM 培養(yǎng)基(含2 ×抗生素和20%FBS)，100 μL/well 加入至96 孔板，冷卻凝固后為底層膠。按1∶1比例混合高壓滅菌的0.8%瓊脂糖PBS 溶液和細(xì)胞混懸液，按100 μL/well 加入至含底層膠的96 孔板中，待上層瓊脂凝固后，置入37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，每隔2 ～3 d 加少許培養(yǎng)液防瓊脂膠變干。培養(yǎng)14 d 后用0.005%結(jié)晶紫染色1 h 后，在顯微鏡下計算克隆形成率。設(shè)5 個復(fù)孔，實驗重復(fù)3 次。

2.9 藥物敏感性檢測 使用MTT 法對BCL-3 基因沉默前后的藥物敏感性進行檢測，實驗前1 d，取對數(shù)生長期細(xì)胞按1 ×104cells/well 分到96 孔板，加入不同濃度的藥物，化合物根據(jù)溶解性特點使用DMSO 或者PBS 制備成10 mmol/L 儲液后，使用時用培養(yǎng)液稀釋成所需濃度，分別為20、10、5、2.5、1.25 和0.625 μmol/L，每組濃度設(shè)置5 個復(fù)孔，培養(yǎng)48 h 后，加入5 g/L MTT 溶液，37 ℃繼續(xù)培養(yǎng)4 h，棄上清每孔加150 μL DMSO 后在酶標(biāo)儀上550 nm 處讀取吸光度值，使用Prism 5.02 計算半數(shù)抑制濃度(median inhibitory concentration，IC50)數(shù)值。實驗重復(fù)3 次。

3 統(tǒng)計學(xué)處理

數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(means±SD)表示，均數(shù)比較采用t 檢驗。采用SPSS 13.0 軟件進行統(tǒng)計分析。以P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 BCL-3 在不同結(jié)直腸癌細(xì)胞株中的表達(dá)水平

RT-PCR 檢測結(jié)果表明，5 株大腸癌細(xì)胞株中RKO 細(xì)胞的BCL-3 mRNA 表達(dá)明顯高于其它細(xì)胞株，見圖1A。Western blotting 檢測結(jié)果也表明，5 株大腸癌細(xì)胞株中RKO 細(xì)胞BCL-3 蛋白表達(dá)也明顯高于其它細(xì)胞株，見圖1B。這表明無論RNA 水平或者蛋白水平，BCL-3 的表達(dá)水平以RKO 細(xì)胞株最高，因此后續(xù)實驗以該細(xì)胞株作為研究對象。

Figure 1. The expression of BCL-3 mRMA (A)and protein (B)in different colorectal cancer cell lines.圖1 不同結(jié)直腸癌細(xì)胞株中BCL-3 mRNA 和蛋白的表達(dá)

2 重組慢病毒感染RKO 細(xì)胞后BCL-3 蛋白的表達(dá)

含不同序列shRNA 重組慢病毒感染RKO 細(xì)胞48 h 后，提取感染細(xì)胞的蛋白進行免疫印跡分析，與vector 組相比，含BCL-3-shRNA2 的重組慢病毒感染RKO 細(xì)胞后BCL-3 蛋白表達(dá)明顯下降，而含其它序列BCL-3-shRNA 的重組慢病毒感染RKO 細(xì)胞后BCL-3 蛋白表達(dá)仍較高。這表明含shRNA2 的重組慢病毒可有效沉默RKO 細(xì)胞的BCL-3 基因表達(dá)，見圖2。

Figure 2. The expression of BCL-3 protein in RKO cells transfected with lentiviral vectors containing different shRNAs.圖2 不同序列shRNA 重組慢病毒感染RKO 細(xì)胞后BCL-3蛋白的表達(dá)

3 目標(biāo)細(xì)胞的篩選

含shRNA2 序列的重組慢病毒顆粒感染RKO 細(xì)胞48 h 后，加入嘌呤霉素進行篩選得到穩(wěn)定沉默BCL-3 的細(xì)胞株，熒光顯微鏡下觀察可見大量熒光，表明獲得了高效率的感染，見圖3。

4 BCL-3 沉默對RKO 細(xì)胞增殖能力的影響

Figure 3. The expression of GFP in RKO cells transfected with lentiviral vectors containing GFP and shRNA2 against BCL-3 for 48 h(×200).A:bright-field image;B:fluorescent image.圖3 含GFP 及shRNA2 的病毒感染RKO 細(xì)胞48 h 后熒光顯微鏡下觀察GFP 的表達(dá)情況

RKO 細(xì)胞分設(shè)vector 組及pLKO.1-BCL-3-shRNA2 組(shRNA2 穩(wěn)定干擾組)。MTT 法檢測表明，2組細(xì)胞培養(yǎng)不同時間后，pLKO.1-BCL-3-shRNA2 組的A550值均明顯較vector 組低，培養(yǎng)96 h，2 組的A550值差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P ＜0.05)，見圖4A。這表明穩(wěn)定沉默BCL-3 基因后RKO 細(xì)胞的增殖能力降低。

細(xì)胞克隆形成實驗也表明，vector 組及pLKO.1-BCL-3-shRNA2 組的克隆形成率分別為93% ±16%及21% ±4%，2 組之間克隆形成率的差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P ＜0.05)，見圖4B。這表明穩(wěn)定沉默BCL-3基因后RKO 細(xì)胞的克隆形成能力顯著降低。

Figure 4. Effects of BCL-3 gene silencing on proliferation (A)and colony formation (B)of RKO cells.Mean±SD.n=5. * P ＜0.05 vs vector.圖4 穩(wěn)定沉默BCL-3 對細(xì)胞生長曲線和克隆形成能力的影響

5 BCL-3 穩(wěn)定沉默后細(xì)胞對藥物敏感性的變化

RKO 細(xì)胞分設(shè)BCL-3 沉默前組及BCL-3 沉默后組，通過MTT 法檢測化療藥物伊立替康、奧沙利鉑及5-氟尿嘧啶對RKO 細(xì)胞的IC50。與沉默前組相比，沉默后組3 種藥物對RKO 細(xì)胞的IC50均有所降低，伊立替康及氟尿嘧啶對RKO 細(xì)胞的IC50在沉默前后差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P ＞0.05);但奧沙利鉑對RKO細(xì)胞的IC50在沉默前后差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P ＜0.05)，見表2。這表明BCL-3 表達(dá)下降后RKO 細(xì)胞對奧沙利鉑的敏感性顯著提高。

表2 BCL-3 基因沉默前后藥物對RKO 細(xì)胞IC50的變化Table 2. The IC50 of drugs for RKO cells before and after BCL-3 gene silencing (μmol/L.Mean±SD.n=5)

討 論

慢病毒感染靶細(xì)胞發(fā)揮基因沉默的作用穩(wěn)定而持久，可顯著提高RNA 干擾的抑制效率，該技術(shù)作為新一代高效表達(dá)載體大大促進腫瘤的基因基礎(chǔ)研究［4-5］。BCL-3 在多數(shù)惡性腫瘤組織中豐富表達(dá)，且與結(jié)直腸癌的預(yù)后相關(guān)［2］。從本研究結(jié)果來看BCL-3 僅在結(jié)腸癌細(xì)胞株RKO 中有較高的表達(dá)，因此后續(xù)實驗主要以RKO 細(xì)胞為主要研究對象。不少研究顯示，BCL-3 基因活化后可以直接調(diào)控cyclin D1 表達(dá)，進而促進細(xì)胞G1期的快速轉(zhuǎn)換［6］，在乳腺癌細(xì)胞過表達(dá)BCL-3 后直接促進移植瘤在裸鼠內(nèi)的增殖［7］。而對BCL-3 基因沉默，考察其對結(jié)直腸癌生物學(xué)行為及藥物敏感性的研究尚未見報道。利用慢病毒技術(shù)對BCL-3 基因進行沉默后發(fā)現(xiàn)，RKO 細(xì)胞的增殖能力顯著下降，細(xì)胞生長變慢，同時RKO細(xì)胞克隆形成能力也顯著減弱。該結(jié)果與Zamora等［8］在宮頸癌中的報道類似，他們研究不僅發(fā)現(xiàn)細(xì)胞克隆形成能力下降，增殖變緩，而且敲除BCL-3 的細(xì)胞出現(xiàn)損傷應(yīng)答，并發(fā)生G2/M 延滯和中性體擴增。

BCL-3 蛋白是新發(fā)現(xiàn)的一種核轉(zhuǎn)錄因子κB(nuclear factor κB，NF-κB)家族蛋白，在NF-κB 途徑中有著重要的調(diào)控作用。BCL-3 蛋白具有7 個錨蛋白樣重復(fù)序列，屬于NF-κB 抑制蛋白家族，具有調(diào)節(jié)NFκB 的亞細(xì)胞轉(zhuǎn)位及其DNA 結(jié)合活性的功能。BCL-3 在胞核內(nèi)通過與p50 及p52 形成異源性復(fù)合物而擔(dān)任轉(zhuǎn)錄激活或轉(zhuǎn)錄抑制劑，激活或抑制靶基因的轉(zhuǎn)錄，發(fā)揮著促癌作用。BCL-3 活化后能通過抑制p53 活性而發(fā)揮抗凋亡作用［9］。NF-κB 在腫瘤耐藥中的研究顯示，NF-κB 途徑參與了腫瘤鉑類化合物的耐藥性［10］。因此，本研究還考察了BCL-3 基因沉默前后RKO 細(xì)胞對臨床化療藥物敏感性的變化，結(jié)果顯示，BCL-3 基因沉默后顯著提高其對奧沙利鉑的藥物敏感性，而對氟尿嘧啶及伊立替康的敏感性提高并不明顯，這說明BCL-3 在結(jié)直腸癌的奧沙利鉑耐藥方面可能扮演著重要角色。

BCL-3 在實體瘤中的致癌作用盡管得到了部分了解，但仍需要進一步探索其在相關(guān)腫瘤信號途徑中的調(diào)控作用。進一步探索BCL-3 對大腸癌中癌基因及抑癌基因的影響，以及BCL-3 通過何種途徑促進大腸癌的耐藥，探明BCL-3 在大腸癌生長及耐藥中的機制。此外研究顯示BCL-3 的活化被認(rèn)為和結(jié)直腸癌患者的預(yù)后密切相關(guān)，因此BCL-3 對結(jié)直腸癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移能力的影響，包括遷移和侵襲等方面的作用和相關(guān)機制也將作為重要考察方向。這些都有待進一步研究。

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