楊 希， 李衛(wèi)華， 黃崢嶸

(1 福建醫(yī)科大學第一臨床醫(yī)學院，福建 福州350005;2廈門大學附屬第一醫(yī)院心內科，福建 廈門361003;3寧波市醫(yī)療中心李惠利醫(yī)院心內科，浙江 寧波315041)

他汀類藥物是3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A(3-hydroxy-3-methylglutaryl-coenzyme A，HMG-CoA)還原酶抑制劑，可以降低血漿總膽固醇(total cholesterol，TC)、低密度脂蛋白膽固醇(low-density lipoprotein cholesterol，LDL-C)和甘油三酯(triglyceride，TG)水平，升高血漿高密度脂蛋白膽固醇水平(high-density lipoprotein cholesterol，HDL-C)［1］。在過去的20 年間，總計超過170 000 名參與者的多項大型臨床試驗表明，他汀類藥物能夠降低心血管事件的發(fā)生率［2］。有研究顯示，辛伐他汀可通過抑制血清可溶性CD40L(sCD40L)及動脈組織CD40/CD40L 表達途徑從而保護血管功能［3］。因此，他汀被廣泛應用于動脈粥樣硬化性心血管疾病以及卒中的一級和二級預防［4-7］。然而，與他汀類藥物對心血管疾病的有益作用相反，基于多項大型隨機對照臨床試驗的薈萃分析表明，和安慰劑組比較，使用他汀類藥物能夠增加新發(fā)糖尿病的發(fā)生風險［8-10］。

胰腺β 細胞功能障礙和胰島素抵抗是2 型糖尿病的兩大病理生理機制。目前有關他汀類藥物增加新發(fā)糖尿病發(fā)生風險的相關機制尚未闡明，因此本研究將通過體外培養(yǎng)小鼠胰腺β 細胞株MIN6，從細胞整體水平及分子基因水平探討辛伐他汀對胰腺β細胞功能的影響并探討其可能的機制，為深入研究他汀類藥物導致胰腺β 細胞功能障礙以及他汀對糖代謝的影響提供相關實驗依據(jù)。

材 料 和 方 法

1 材料

小鼠胰腺β 細胞株MIN6(以下簡稱MIN6 細胞，由上海交通大學醫(yī)學院附屬瑞金醫(yī)院內分泌研究所惠贈)。SW-CJ-1F 超凈工作臺、恒溫水浴鍋、3111 型CO2恒溫恒濕細胞培養(yǎng)箱、倒置相差顯微鏡(Olympus)、LD5-2A 型臺式低速離心機、低溫高速離心機、luminometer(Modulus)、BR680 多功能酶標儀(Bio-Rad)、紫外可見分光光度計、逆轉錄PCR 儀、Light-Cycler? 480 Real-Time PCR 擴增儀(Roche)、垂直電泳儀、電轉儀和電泳與凝膠成像分析系統(tǒng);高糖DMEM 培養(yǎng)基和胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)均購自HyClone;辛伐他汀購自Merck;牛血清白蛋白(bovine serum albumin，BSA)購自Roche;胰島素放射免疫分析藥盒購自北京北方生物技術研究所;ATP檢測試劑盒購自碧云天生物技術研究所;BCA 蛋白質定量試劑盒及總RNA 提取試劑盒均購自天根生化科技(北京)有限公司;逆轉錄試劑盒及熒光定量PCR 試劑盒均購自TaKaRa。引物由Invitrogen 合成。小鼠內向整流鉀離子通道6.2(inwardly rectifying potassium channel 6.2，Kir6.2)多克隆抗體、葡萄糖轉運體2(glucose transporter 2，GLUT2)多克隆抗體以及山羊抗兔多克?、蚩咕徸訟bcam;電壓依賴性鈣離子通道1.2(voltage -dependent calcium channel 1.2，CaV1.2)多克隆抗體購自Novus;GAPDH 單克隆抗體購自Cell Signaling。其它化學試劑均購自國藥集團化學試劑有限公司。

2 方法

2.1 MIN6 細胞的培養(yǎng)及分組 MIN6 細胞在高糖DMEM 培養(yǎng)基、5%CO2、37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)基中包含15%FBS、1 ×105U/L 青霉素、100 mg/L鏈霉素、2 mmol/L L-谷氨酰胺和70 μmol/L β-巰基乙醇。接種密度為6 ×108/L，每2 d 更換1 次培養(yǎng)基。實驗分為4 組，分別用含0、2、5 和10 μmol/L 辛伐他汀的高糖DMEM 培養(yǎng)基培養(yǎng)48 h。

2.2 胰島素釋放試驗及細胞內胰島素含量的檢測

將對數(shù)生長期的細胞消化離心后按5 ×104cells/well 接種于12 孔細胞培養(yǎng)板，待細胞長至60% ～70%融合，PBS 洗滌細胞1 次，分別給予不同組處理，在37 ℃、含95%空氣和5%CO2的培養(yǎng)箱中孵育48 h 后，行胰島素釋放試驗。吸出培養(yǎng)基，無糖Krebs-Ringer 碳酸氫鹽緩沖液(KRBB:115 mmol/L NaCl，4.7 mmol/L KCl，1.2 mmol/L MgSO4，1.2 mmol/L KH2PO4，1.3 mmol/L CaCl2，24 mmol/L NaHCO3，0.1% BSA 和10 mmol/L HEPES，pH 7.4)洗滌細胞2 遍，加入無糖Krebs-Ringer 緩沖液，37 ℃孵育2 h，吸出緩沖液，每組分別加入含2.8 mmol/L(低糖)或16.7 mmol/L(高糖)葡萄糖的Krebs-Ringer 緩沖液，37 ℃孵育1 h，小心吸取上清液后4 ℃、1 000 r/min 離心5 min，取上清-70 ℃保存待測或直接用于檢測。相應的細胞加入等量的酸醇提取液(75%無水乙醇，1.5%鹽酸，23.5%超純水;4 ℃貯存)，4℃冰箱靜置過夜，次日取上清離心后測定胰島素，即為細胞內胰島素的含量。每組實驗均設復孔，重復3次。采用放射免疫分析法(嚴格按照試劑盒說明書操作)測定胰島素水平。胰島素濃度測定結果用細胞總蛋白濃度校正。

2.3 MIN6 細胞內三磷酸腺苷( adenine trisphosphate，ATP) 含量的測定 正常對照組細胞及予以辛伐他汀處理結束的細胞，采用生物化學發(fā)光法(螢光素酶方法)檢測細胞內ATP 含量。ATP 水平的測定按照ATP 檢測試劑盒說明書操作。吸除培養(yǎng)液，12 孔板每孔加入100 μL 裂解液裂解細胞。4 ℃、12 000 ×g 離心8 min，取上清。加100 μL ATP 檢測工作液到檢測管內，室溫放置5 min。加20 μL 樣品，迅速用微量移液器混勻，至少間隔2 s 后，立即用luminometer 測定RLU 值。ATP 檢測試劑盒購自碧云天生物技術研究所，結果由細胞總蛋白濃度校正。

2.4 Kir6.2、CaV1.2 及GLUT2 mRNA 的檢測 用總RNA 提取試劑盒提取MIN6 細胞的總RNA，用TaKa-Ra 逆轉錄試劑盒進行逆轉錄，最后cDNA 進行實時熒光定量PCR 擴增。PCR 反應體系為:cDNA 1 μL、上下游引物(10 μmol/L)各0.4 μL、SYBR? Premix Ex TaqTMⅡ(2 ×)5 μL、無核酶水3.2 μL。PCR 反應條件:95 ℃預變性30 s，95 ℃5 s，59 ℃15 s，72 ℃20 s，共55 個循環(huán)。每次反應設3 ～4 個復孔，重復3次。由實時熒光定量PCR 儀配套軟件算出每個反應的平均熒光值，并除以相應內參照GAPDH 的平均熒光值，得到比值y，將正常對照組y 值的平均值視為100%，即可得出其它辛伐他汀處理組的相對熒光值。Kir6.2 上游引物5'-AAGGGCATTATCCCTGAGGAA-3'，下游引物5'-TTGCCTTTCTTGGACACGAAG-3';CaV1. 2 上游引物5'-AGACGCTATGGGCTATGA-3'，下游引物5'-AACACCGAGAACCAGATTTA-3';GLUT2 上游引物5'-TCAGAAGACAAGATCACCGGA-3'，下游引物5'-GCTGGTGTGACTGTAAGTGGG-3';GAPDH 上游引物5'-AGGTCGGTGTGAACGGATTTG-3'，下游引物5'-TGTAGACCATGTAGTTGAGGTCA-3'。

2.5 Kir6.2、CaV1.2 及GLUT2 蛋白表達的檢測

采用Western blotting 檢測Kir6.2、CaV1.2 及GLUT2蛋白的表達水平。收集細胞后加入細胞裂解液，冰上裂解20 ～30 min，期間振蕩數(shù)次。13 400 ×g、4 ℃離心20 ～30 min，吸取上清，使用BCA 蛋白質定量試劑盒測定蛋白濃度。向蛋白質樣品中加入5 ×上樣緩沖液煮沸8 min，直接用于后續(xù)電泳或-70 ℃儲存?zhèn)溆谩estern blotting:取蛋白樣品，進行SDSPAGE、轉膜、封閉、Ⅰ抗Ⅱ抗反應、洗膜、顯影定影。采用Bio-Rad Quantity One 軟件分析顯影條帶，將Kir6. 2/GAPDH、CaV1. 2/GAPDH 及GLUT2/GAPDH的相對灰度值作為Kir6.2、CaV1.2 及GLUT2 的蛋白表達相對水平。

3 統(tǒng)計學處理

采用SPSS 19.0 軟件分析。計量資料以均數(shù)±標準差(mean ±SD)表示，多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析或非參數(shù)檢驗，以P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

結 果

1 辛伐他汀對MIN6 細胞胰島素分泌功能及細胞內胰島素含量的影響

1.1 低糖狀態(tài)下MIN6 細胞胰島素的分泌及細胞內胰島素含量 辛伐他汀處理組MIN6 細胞在低糖狀態(tài)下細胞內的胰島素含量、分泌至細胞外的胰島素量及細胞內外總胰島素量較正常對照組明顯減少(均P ＜0.05)，且胰島素分泌量呈濃度依賴性減少，見圖1。

Figure 1. Insulin levels under low glucose condition in MIN6 cells treated with simvastatin at the concentrations of 0，2，5 and 10 μmol/L. Mean±SD.n=6. * P ＜0.05 vs 0 μmol/L;# P ＜0.05 vs 2 μmol/L.圖1 低糖狀態(tài)下胰島素量比較

1.2 高糖刺激下MIN6 細胞胰島素的分泌及細胞內胰島素含量 辛伐他汀處理組MIN6 細胞在高糖狀態(tài)下細胞內的胰島素含量、分泌至細胞外的胰島素量及細胞內外總胰島素量較正常對照組明顯減少(均P ＜0.05)，且隨著辛伐他汀濃度的增加，MIN6細胞內外總胰島素量有所降低，高糖刺激下辛伐他汀10 μmol/L 組細胞內的胰島素含量、分泌至胞外的胰島素量及細胞內外總胰島素量較2 μmol/L 組明顯降低(均P ＜0.05)，見圖2。

Figure 2. Insulin levels under high glucose condition in MIN6 cells treated with simvastatin at the concentrations of 0，2，5 and 10 μmol/L. Mean±SD.n=6. * P ＜0.05，＊＊P ＜0.01 vs 0 μmol/L;##P ＜0.01 vs 2 μmol/L;△△P ＜0.01 vs 5 μmol/L.圖2 高糖狀態(tài)下胰島素量比較

2 辛伐他汀對MIN6 細胞內ATP 水平的影響

與正常對照組比較，辛伐他汀處理后的MIN6 細胞裂解液中ATP 含量明顯下降(均P ＜0.05)，辛伐他汀10 μmol/L 組較5 μmol/L 組或2 μmol/L 組、5 μmol/L 組較2 μmol/L 組ATP 含量明顯減少，差異有統(tǒng)計學意義(均P ＜0.05)，見圖3。

3 Kir6.2、CaV1.2 及GLUT2 的mRNA 水平

與正常對照組(mRNA 水平視為1)相比，辛伐他汀10 μmol/L 處理組MIN6 細胞Kir6.2 mRNA 水平上調為23.97 ±4.09(P ＜0.01)，辛伐他汀5 μmol/L處理組MIN6 細胞CaV1.2 和GLUT2 mRNA 水平分別下調為0.63 ±0.22(P ＜0.01)和0.50 ±0.21(P ＜0.05)，辛伐他汀10 μmol/L 處理組MIN6 細胞CaV1.2 和GLUT2 mRNA 水平分別下調為0.42 ±0.10(P ＜0.01)和0.26 ±0.11(P ＜0.01)，辛伐他汀10 μmol/L 處理組Kir6.2 mRNA 水平較2 μmol/L 或5 μmol/L 組明顯上調(均P ＜0.01)，10 μmol/L 處理組CaV1.2 mRNA 水平較2 μmol/L 或5 μmol/L 組明顯下調(P ＜0.01 或P ＜0.05)，5 μmol/L 組CaV1.2 mRNA 水平較2 μmol/L 組亦明顯下調(P ＜0.05)，10 μmol/L 處理組GLUT2 mRNA 水平較2 μmol/L 組明顯下調(P ＜0.05)，見圖4。

Figure 3. The content of ATP in MIN6 cells treated with simvastatin at the concentrations of 0，2，5 and 10 μmol/L for 48 h. Mean±SD. n=10. * P ＜0.05 vs 0 μmol/L;#P ＜0.05 vs 2 μmol/L;△P ＜0.05 vs 5 μmol/L.圖3 各組MIN6 細胞內ATP 含量的比較

Figure 4. The relative mRNA levels of Kir6.2，CaV1.2 and GLUT2 in MIN6 cells treated with simvastatin at the concentrations of 0，2，5 and 10 μmol/L(group C)for 48 h. Mean±SD. n=10. * P ＜0.05，＊＊P ＜0.01 vs 0 μmol/L;#P ＜0.05，##P ＜0.01 vs 2 μmol/L;△P ＜0.05，△△P ＜0.01 vs 5 μmol/L.圖4 各組MIN6 細胞Kir6.2、CaV1.2 和GLUT2 的mRNA 相對水平

4 Kir6.2、CaV1.2 及GLUT2 蛋白的表達水平

與正常對照組相比，辛伐他汀5 和10 μmol/L處理組MIN6 細胞Kir6.2 蛋白表達水平分別上調約66%和91%(均P ＜0.01)，5 和10 μmol/L 處理組Kir6.2 蛋白表達水平較2 μmol/L 組亦分別上調約23%和43%(P ＜0.05 和P ＜0.01);與正常對照組相比，辛伐他汀5 和10 μmol/L 處理組MIN6 細胞CaV1.2 蛋白表達水平分別下調約38%和79%(均P ＜0.01)，10 μmol/L 處理組CaV1.2 蛋白表達水平較2 μmol/L 和5 μmol/L 組亦分別下調約73%和67%(均P ＜0.01);與正常對照組相比，辛伐他汀10 μmol/L 處理組MIN6 細胞GLUT2 蛋白表達水平下調約38%(P ＜0.01)，10 μmol/L 處理組GLUT2蛋白表達水平較2 μmol/L 和5 μmol/L 組亦分別下調約29%和27%(P ＜0.01 和P ＜0.05)，見圖5。

Figure 5. The relative protein levels of Kir6.2，CaV1.2 and GLUT2 in MIN6 cells treated with simvastatin at the concentrations of 0，2，5 and 10 μmol/L for 48 h. Mean±SD. n=3. ＊＊P ＜0.01 vs 0 μmol/L;#P ＜0.05，##P ＜0.01 vs 2 μmol/L;△P ＜0.05，△△P ＜0.01 vs 5 μmol/L.圖5 各組MIN6 細胞Kir6.2、CaV1.2 和GLUT2 蛋白表達相對水平

討 論

他汀類藥物通過特異性抑制膽固醇合成過程中的限速酶——HMG-CoA 還原酶的活性，從而抑制膽固醇合成、降低血漿膽固醇水平，具有穩(wěn)定血管內粥樣斑塊、抗動脈粥樣硬化作用，因此被廣泛應用于心血管科、神經科、內分泌科、腎臟科等領域。有研究顯示，阿托伐他汀可以通過抑制蛋白激酶C(protein kinase C，PKC)的活化從而對抗高糖誘導的內皮細胞產生的氧化應激反應［11］。瑞舒伐他汀能顯著抑制C-反應蛋白(C-reactive protein，CRP)刺激晚期內皮祖細胞(endothelial outgrowth cells，EOCs)所致的炎癥因子白細胞介素8(interleukin-8，IL-8)和單核細胞趨化蛋白1(monocyte chemoattractant protein-1，MCP-1)以及血管細胞黏附分子1(vascular cell adhesion molecule-1，VCAM-1)和細胞間黏附分子1(intercellular adhesion molecule-1，ICAM-1)的分泌，從而為動脈粥樣硬化的防治提供新的靶點［12］。然而，近年來他汀類藥物的使用特別是強化劑量的他汀治療對糖代謝的影響也引發(fā)了極大的關注［13-17］。但迄今為止，他汀帶來糖尿病風險的機制研究極為匱乏。

他汀類藥物影響糖代謝、降低胰島素敏感性、增加糖尿病發(fā)生風險的具體機制，目前尚不清楚。Nakata 等［18］的研究發(fā)現(xiàn)，阿托伐他汀能夠抑制脂肪細胞的成熟以及GLUT4 的表達，減弱胰島素在脂肪細胞中的作用，從而導致胰島素敏感性的降低。他汀對糖代謝的不良影響也可能與其使體內某些代謝產物的減少有關。輔酶Q10不僅在抗氧化和穩(wěn)定細胞膜方面發(fā)揮重要作用，也參與線粒體的氧化磷酸化，在機體的能量代謝中發(fā)揮重要作用［19］。已有研究表明，某些他汀類藥物能夠顯著降低血漿輔酶Q10的水平［20-23］。而輔酶Q10的降低會抑制線粒體的氧化磷酸化和ATP 的生成。他汀可以抑制甲羥戊酸途徑，不僅阻止了膽固醇的合成，也同樣阻止了體內某些甲羥戊酸代謝產物如類異戊二烯和輔酶Q10的生物合成［24］，從而影響糖代謝和胰島素敏感性。

胰腺β 細胞胰島素的合成和分泌是一個完整有序的過程。目前，對于葡萄糖刺激的胰島素分泌(glucose-stimulated insulin secretion，GSIS)的共識是:胰腺β 細胞屬于電可興奮性細胞，葡萄糖通過GLUT2 進入胰腺β 細胞，被葡萄糖激酶磷酸化代謝生成ATP，從而使ATP 敏感性鉀通道(KATP)關閉，細胞膜去極化，電壓依賴性鈣通道(CaV)開放，鈣離子內流，細胞內鈣離子濃度升高，激活胰島素分泌所需的一系列酶或蛋白，導致胰島素分泌。因此，胰腺β細胞胰島素的分泌受到多種因素、多個環(huán)節(jié)的影響。本研究結果表明辛伐他汀干預48 h 能夠明顯抑制小鼠胰腺β 細胞株MIN6 在基礎葡萄糖水平(2.8 mmol/L)及高糖(16.7 mmol/L)刺激下胰島素的合成和分泌，這種抑制作用呈明顯的劑量依賴性。

本研究對辛伐他汀抑制胰腺β 細胞胰島素分泌的機制進行了探討。ATP 是胰腺β 細胞胰島素分泌的重要調節(jié)物質，胰腺β 細胞內ATP 濃度的下降會抑制KATP通道的關閉，抑制細胞膜去極化，進而抑制CaV通道的開放，最終抑制胰島素的分泌。本實驗結果也證實，中、高濃度的辛伐他汀對小鼠胰腺β 細胞內ATP 的生成具有明顯的抑制作用且呈劑量依賴性。

ATP 敏感性鉀通道(KATP)是一個八聚體，在小鼠胰腺β 細胞中由4 個內向整流鉀通道亞單位Kir6.2 和硫脲類藥物受體亞單位SUR1 組成。KATP通道把胰腺β 細胞內的糖代謝過程和細胞膜的電活動相偶聯(lián)［25］，在胰島素的分泌過程中發(fā)揮重要的調節(jié)作用。KATP通道調控胰島素分泌的活性有賴于Kir6.2 和SUR1 亞單位在基因和蛋白水平上的協(xié)調表達［26］。胰腺β 細胞分泌胰島素是一個相當復雜而精密的過程，CaV在這一過程中起著非常重要的調控作用。在胰腺β 細胞膜上，CaV通道主要包括L型鈣通道和非L 型鈣通道，而以L 型鈣通道為主［27］。

本實驗中，實時熒光定量PCR 結果表明，5 μmol/L 及10 μmol/L 的辛伐他汀干預48 h 后，MIN6細胞Kir6.2 mRNA 表達水平明顯升高，而CaV1.2 及GLUT2 mRNA 表達受到明顯抑制。Western blotting結果進一步證實，辛伐他汀能夠上調Kir6.2 蛋白的表達水平，而下調CaV1. 2 及GLUT2 蛋白的表達。Kir6.2 通道為內向整流鉀通道，在維持胰腺β 細胞膜的靜息電位及胰島素分泌過程中都發(fā)揮著重要作用。當Kir6.2 通道蛋白表達升高時，細胞膜不易去極化，從而影響CaV1.2 通道的開放，胞外鈣離子內流減少，進而抑制胰島素的分泌。CaV1.2 通道蛋白表達的降低也可以減少胞外鈣離子內流，胞漿中鈣離子濃度降低，胰島素分泌減少。GLUT2 蛋白表達的下調，能夠降低胰腺β 細胞對葡萄糖的攝取利用，從而影響胰島素的分泌。

循證醫(yī)學證據(jù)表明，他汀類藥物的抗動脈粥樣硬化作用與其應用劑量有關［28］。因此，該類藥物的臨床應用劑量有日益增加的趨勢。本研究結果提示，2 μmol/L、5 μmol/L 及10 μmol/L 的辛伐他汀干預48 h 均呈現(xiàn)出明顯的胰島素分泌抑制作用?？梢?，在長期大劑量應用辛伐他汀時，可能引起辛伐他汀血藥濃度的明顯升高，此時應注意其對胰腺β 細胞功能的潛在影響。

總之，他汀類藥物對于心血管系統(tǒng)的有益作用是毋庸置疑的，但考慮到他汀治療特別是大劑量他汀強化治療對糖代謝和胰島素敏感性的不利影響，因此在臨床實踐中，應該注意病人血糖的變化，減少他汀對糖代謝不良影響事件的發(fā)生。

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