吳 強(qiáng)， 林 靜， 彭 俊， 李 杰， 付曉東， 曹銘輝△

(中山大學(xué)孫逸仙紀(jì)念醫(yī)院1麻醉科，2手術(shù)室，廣東 廣州510120;3中山大學(xué)中山醫(yī)學(xué)院生理學(xué)教研室，廣東 廣州510080)

雌激素具有延緩動(dòng)脈粥樣硬化進(jìn)程的作用［1］， 其心血管效應(yīng)主要是通過(guò)作用于血管內(nèi)皮來(lái)實(shí)現(xiàn)的［2］，但確切的內(nèi)皮性機(jī)制尚不完全明了。近年來(lái)發(fā)現(xiàn)硫化氫(hydrogen sulfide，H2S)在心血管系統(tǒng)中具有非常重要的生物學(xué)功能，具有舒張血管、降低血壓、減少動(dòng)脈粥樣硬化斑塊面積等作用［3-5］，這些作用都與血管內(nèi)皮功能密切相關(guān)。因此我們推測(cè)H2S可能參與到雌激素抗動(dòng)脈粥樣硬化的過(guò)程中。本研究探討在17β-雌二醇(17β-estradiol，E2)的抗動(dòng)脈粥樣硬化過(guò)程中H2S 的作用以及可能的機(jī)制。

材 料 和 方 法

1 材料

E2和內(nèi)源性H2S 生成酶抑制劑炔丙基甘氨酸(DL-propargylglycine，PPG)購(gòu)自Sigma，胱硫醚γ-裂解酶(cystathionine γ-lyase，CSE)兔抗人抗體購(gòu)自Proteintech，雌激素受體(estrogen receptor，ER)激動(dòng)劑丙基吡唑三醇(propylpyrazole triol，PPT;α 亞型激動(dòng)劑)和二芳基丙腈(diarylpropionitrile，DPN;β 亞型激動(dòng)劑)和雌激素受體拮抗劑ICI 182780(ICI)購(gòu)自Tocris Cookson，DMEM、胎牛血清購(gòu)自Invitrogen，其它試劑為國(guó)產(chǎn)分析純。

2 方法

2.1 細(xì)胞實(shí)驗(yàn)

2.1.1 細(xì)胞培養(yǎng) 人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(human umbilical vein endothelial cells，HUVECs)根據(jù)文獻(xiàn)方法培養(yǎng)［6］。使用含10%胎牛血、1 ×105U/L 青霉素和100 mg/L 鏈霉素的DMEM 培養(yǎng)液培養(yǎng)HUVECs，置于37 ℃、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。分組后，分別按每孔2 mL、1 ×108cells/L 細(xì)胞濃度接種于6 孔板上。在處理前，先將HUVECs 在含有去除類固醇的胎牛血清的DMEM 中培養(yǎng)24 h。

2.1.2 實(shí)驗(yàn)步驟 (1)將培養(yǎng)好的HUVECs 分為6組:0、5、10、15、30 和60 min 組，使用10 nmol/L 的E2作用相對(duì)應(yīng)的時(shí)間后，測(cè)定培養(yǎng)液中H2S 的濃度，用Western blotting 測(cè)定細(xì)胞中CSE 的蛋白表達(dá)水平。(2)將培養(yǎng)好的HUVECs 分為5 組:0、1、10、100 和1 000 nmol/L組，分別用對(duì)應(yīng)的E2濃度作用5 min后，測(cè)定培養(yǎng)液中H2S 的濃度。(3)將培養(yǎng)好的HUVECs 分為7 組:control、E2、PPT、DPN、E2+ICI、PPT+ICI 和DPN +ICI 組，分別用E2(10 nmol/L)、PPT(10 nmol/L)、DPN(10 nmol/L)、E2(10 nmol/L)+ICI(100 nmol/L)、PPT(10 nmol/L)+ICI(100 nmol/L)和DPN(10 nmol/L)+ICI(100 nmol/L)處理5 min后，測(cè)定培養(yǎng)液中H2S 的濃度。

2.1.3 H2S 的測(cè)定 參照文獻(xiàn)［7］，采用敏感硫電極法實(shí)時(shí)測(cè)量血漿或組織的H2S 濃度。血清測(cè)H2S 濃度測(cè)定原理:血清中的H2S 通常有氣體(1/3)和NaHS (2/3)2 種形式存在，加入抗氧化液后，H2S 和NaHS 與NaOH 反應(yīng)生成S2-，通過(guò)敏感硫電極測(cè)定血清中的S2-，從而間接反映H2S 的濃度。在每次實(shí)驗(yàn)前用新鮮準(zhǔn)備的Na2S·9H2O 溶液定標(biāo)(終濃度分別為0、2、4、8 和10 μmol/L)并制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。將H2S 傳感器的探頭浸在組織或血漿溶液10 ～15 min，記錄平臺(tái)期的電流輸出。然后根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸分析計(jì)算出H2S 的濃度。

2.1.4 Western blotting 檢測(cè) 用冰冷的PBS 洗細(xì)胞3 次，加入適量細(xì)胞裂解液，4 ℃靜置30 min，12 000 r/min 離心30 min，取上清，BCA 法測(cè)定樣品的蛋白含量?？偟鞍子肧DS-PAGE 分離后，轉(zhuǎn)移到PVDF 膜上。5%的脫脂奶粉溶液封閉1 h，加入CSE 抗體(1∶2 000)4 ℃孵育過(guò)夜，TBST 緩沖液沖洗3 次，加入相應(yīng)Ⅱ抗，室溫孵育1 h，TBST 緩沖液沖洗3 次。經(jīng)ECL 顯色后，用ImageJ 1.35 軟件分析蛋白的相對(duì)表達(dá)。

2.2 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)

2.2.1 實(shí)驗(yàn)步驟 6 周齡具有C57BL/6 背景的同源ApoE–/–雌性小鼠購(gòu)自美國(guó)Jackson Laboratory，飼養(yǎng)于中山大學(xué)動(dòng)物中心。高脂飲食喂養(yǎng)到8 周齡時(shí)，小鼠在麻醉下行雙側(cè)卵巢切除術(shù)(ovariectomy，OVX)，術(shù)后恢復(fù)1 周。實(shí)驗(yàn)分為3 組，每組動(dòng)物5 ～7 只:OVX、OVX + E2和OVX + E2+ PPG ，后2 組實(shí)驗(yàn)大鼠皮下埋植E2緩釋劑0.25 mg，PPG(37.5 mg·kg-1·d-1)用生理鹽水溶解后腹腔內(nèi)注射。E2和PPG 的用量參照文獻(xiàn)中使用的劑量［8-9］。繼續(xù)高脂飲食喂養(yǎng)8 周后，收集眶周靜脈叢的血液行H2S測(cè)定。

2.2.2 主動(dòng)脈粥樣硬化的評(píng)估 主動(dòng)脈粥樣硬化的評(píng)估方法參照文獻(xiàn)［8-9］。處理8 周后，小鼠放血處死。分離心臟、動(dòng)脈和子宮。心臟和動(dòng)脈用PBS 處理后用4%甲醛固定12 h，OCT(optimal cutting temperature)包埋后行連續(xù)冰凍切片(6 μm)。為了衡量動(dòng)脈粥樣硬化的程度，取三尖瓣區(qū)切片10 ～12 張行油紅O 復(fù)合蘇木素染色。圖像用Leica Qwin 軟件處理分析。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean ±SD)表示，多組均數(shù)間比較采用ANOVA 方差分析，組間進(jìn)一步兩兩比較采用LSD 法，使用SPSS 16.0 軟件進(jìn)行分析。以P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 E2 促進(jìn)內(nèi)皮源性H2S 釋放的時(shí)間效應(yīng)和濃度效應(yīng)

用10 nmol/L E2處理HUVECs 可以導(dǎo)致H2S 釋放快速增加，5 ～10 min 達(dá)到最高峰，30 min 后回到基線水平(圖1A)，顯示E2促進(jìn)H2S 釋放的效應(yīng)具有時(shí)間依賴性;在此期間CSE 總表達(dá)沒(méi)有變化(圖1B)。同時(shí)，E2促進(jìn)H2S 釋放具有濃度效應(yīng)，但濃度達(dá)到10 nmol/L E2后即達(dá)峰值，以后再增加濃度，其促進(jìn)H2S 釋放的效應(yīng)不再增強(qiáng)，見(jiàn)圖2。

Figure 1. Effects of 10 nmol/L E2 treatment for different time on H2S release (A)and CSE expression (B)of HUVECs. Mean±SD. n=3. * P ＜0.05，＊＊P ＜0.01 vs 0 min.圖1 E2 促進(jìn)內(nèi)皮源性H2S 釋放的時(shí)間效應(yīng)

Figure 2. Effects of different concentrations of E2 for 5 min on H2S release of HUVECs. Mean ± SD. n =3. ＊＊P ＜0.01 vs 0 nmol/L.圖2 E2 促進(jìn)內(nèi)皮源性H2S 釋放的濃度效應(yīng)

2 雌激素受體在E2 促進(jìn)內(nèi)皮釋放H2S 過(guò)程中的作用

E2可以促進(jìn)內(nèi)皮釋放H2S，使用ERα 激動(dòng)劑PPT 可誘導(dǎo)出類似的作用，但ERβ 激動(dòng)劑DPN 則無(wú)此作用，顯示ERβ 沒(méi)有參與內(nèi)皮源性H2S 的調(diào)節(jié)。同時(shí)，給予ER 拮抗劑ICI 后，E2和PPT 促進(jìn)內(nèi)皮釋放H2S 的作用消失，證實(shí)它們促進(jìn)內(nèi)皮釋放H2S 的效應(yīng)是通過(guò)ER 特別是ERα 來(lái)實(shí)現(xiàn)的，見(jiàn)圖3。

Figure 3. Effects of E2 and estrogen receptor agonists/antagonist on H2S release of HUVECs.HUVECs were exposed to E2(10 nmol/L)，PPT (10 nmol/L)or DPN (10 nmol/L)for 5 min，in the presence or absence of ER antagonist ICI 182780 (100 nmol/L). Mean ±SD. n=3. ＊＊P ＜0.01 vs control;#P ＜0.05 vs E2 or PPT.圖3 雌激素受體在E2 促進(jìn)內(nèi)皮釋放H2S 過(guò)程中的作用

3 各組小鼠血漿H2S 濃度的變化

同OVX 組相比，OVX+E2組H2S 的血漿濃度明顯上升，而OVX+E2+PPG 組H2S 濃度明顯下降，見(jiàn)圖4。

Figure 4. The plasma H2S level in mice of each group.Mean±SD.n=5. * P ＜0.05 vs OVX;##P ＜0.01 vs OVX+E2.圖4 各組小鼠血漿H2S 濃度

4 動(dòng)脈粥樣硬化的量化分析

油紅O 染色結(jié)果顯示，OVX 組動(dòng)脈粥樣硬化程度較嚴(yán)重，加入E2替代治療后，動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的面積明顯降低;但加入PPG 后，這種改善效應(yīng)被大部分逆轉(zhuǎn)，見(jiàn)圖5。

Figure 5. Aortic root lesion in mice of each group. The image of oil-red O-stained aortic root lesion in ovariectomized(OVX)ApoE - / - mice treated with E2 pellet (0. 25 mg，60-day release)or E2 pellet plus PPG (CSE inhibitor;37. 5 mg·kg -1·d -1). Mice without E2 treatment were received control pellet implantation.Mean±SD. n=5. * P ＜0.01 vs OVX;#P ＜0.05 vs OVX + E2.圖5 各組小鼠動(dòng)脈粥樣硬化的量化分析

討 論

在人和動(dòng)物模型上均發(fā)現(xiàn)E2可以預(yù)防動(dòng)脈粥樣硬化的進(jìn)展，內(nèi)皮功能障礙是動(dòng)脈粥樣硬化的第一步［1，10-11］。絕經(jīng)后婦女血管內(nèi)皮開(kāi)始出現(xiàn)功能失調(diào)，主要表現(xiàn)為內(nèi)皮依賴性血管舒張減弱，雌激素替代療法可改善上述的失調(diào)征象，但其分子機(jī)制尚不明確。盡管內(nèi)皮一氧化氮(nitric oxide，NO)或前列環(huán)素(prostacyclin I2，PGI2)在血管舒張中發(fā)揮重要作用［12-13］，但有研究提示，在內(nèi)皮型一氧化氮合酶(endothelial nitric oxide synthase，eNOS;介導(dǎo)NO 生成)、環(huán)氧合酶-1(介導(dǎo)PGI2生成)雙基因敲除雌性小鼠，內(nèi)皮依賴性血管舒張功能并未受到明顯削弱［14］。此外，采用eNOS 基因敲除小鼠模型，排除內(nèi)皮NO 的作用后，雌激素仍可有效抑制動(dòng)脈粥樣斑塊的形成［15］。這些資料表明，雌激素可能通過(guò)調(diào)控其它信號(hào)分子，改善內(nèi)皮依賴性舒張功能，進(jìn)而發(fā)揮其抗動(dòng)脈粥樣硬化效應(yīng)。

最新的研究表明，內(nèi)源性H2S 為新型的抗動(dòng)脈粥樣硬化信號(hào)分子［16］。作為繼NO 和一氧化碳之后的第3 種新型氣體信號(hào)分子，H2S 存在于多種組織器官，廣泛參與機(jī)體心血管、神經(jīng)、呼吸、消化等系統(tǒng)的多種病理生理過(guò)程［17］。H2S 在血管組織是以L-半胱氨酸為底物經(jīng)CSE 分解代謝而生成。心血管系統(tǒng)中CSE/H2S 的作用，尤其是在血管內(nèi)皮細(xì)胞中的作用，近年來(lái)逐漸被認(rèn)識(shí)。在ApoE-/-小鼠動(dòng)脈粥樣硬化模型中，補(bǔ)充H2S 供體NaHS 可顯著抑制主動(dòng)脈根部粥樣斑塊面積，與此相反，以CSE 抑制劑抑制H2S生成后，可顯著增加斑塊面積［2］。Papapetropoulos等［4］報(bào)道，H2S 可促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、遷移和新生血管形成，這對(duì)于內(nèi)皮的損傷修復(fù)具有重要意義。此外，H2S 尚具有抑制球囊損傷后動(dòng)脈新生內(nèi)膜形成、抑制血管平滑肌細(xì)胞增殖、抑制心肌重構(gòu)等多種心血管效應(yīng)［18］。在這些資料背景下，我們假設(shè):雌激素有可能通過(guò)調(diào)控CSE 表達(dá)和H2S 產(chǎn)生，從而發(fā)揮其改善內(nèi)皮功能和抗動(dòng)脈粥樣硬化的效應(yīng)。

在本實(shí)驗(yàn)中，我們?cè)隗w外培養(yǎng)的HUVECs 觀察到E2可以促進(jìn)H2S 的快速釋放，且具有明顯的時(shí)間效應(yīng)和濃度效應(yīng)。CSE 蛋白表達(dá)增加或CSE 激活均可導(dǎo)致H2S 釋放增加，這涉及到心血管疾病多個(gè)病理生理過(guò)程，例如動(dòng)脈粥樣硬化、心肌缺血、高血壓等［19］。在本研究中，在E2處理的時(shí)效過(guò)程中CSE蛋白表達(dá)沒(méi)有改變，提示H2S 水平的升高可能是由CSE 的激活而非CSE 表達(dá)增加所致。在動(dòng)物模型中，E2可以明顯增加去勢(shì)小鼠血液H2S 的濃度，減少其動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的面積;而加入內(nèi)源性H2S生成酶抑制劑后，E2的上述2 種效應(yīng)明顯減弱，證明在E2抗動(dòng)脈粥樣硬化過(guò)程中H2S 起著重要作用。

雌激素通過(guò)細(xì)胞內(nèi)受體(ERs，包括ERα 和ERβ)或膜雌激素受體(mERs)發(fā)揮生物效應(yīng)，E2誘導(dǎo)H2S 釋放的快時(shí)效效應(yīng)提示其可能通過(guò)核外途徑即mERs 介導(dǎo)。本研究發(fā)現(xiàn)ERα 選擇性激動(dòng)劑PPT(而非ERβ 激動(dòng)劑DPN)可以模擬雌激素的效應(yīng)，提示是存在細(xì)胞膜的ERα 與E2調(diào)節(jié)H2S 釋放相關(guān)，而不是ERβ。

綜上所述，本研究結(jié)果顯示內(nèi)皮源性H2S 是雌激素的靶點(diǎn)，在雌激素抗動(dòng)脈粥樣硬化的過(guò)程中起著重要作用。雌激素是通過(guò)細(xì)胞膜上的ERα 促進(jìn)內(nèi)皮源性H2S 的快速釋放。我們的研究提示H2S 水平下降可能與絕經(jīng)期婦女心血管疾病的病理生理過(guò)程相關(guān)。

［1］ Billon-Galés A，F(xiàn)ontaine C，Douin-Echinard V，et al.Endothelial estrogen receptor-α plays a crucial role in the atheroprotective action of 17β-estradiol in low-density lipoprotein receptor-deficient mice［J］. Circulation，2009，120(25):2567-2576.

［2］ Xing D，Nozell S，Chen YF，et al. Estrogen and mechanisms of vascular protection［J］. Arterioscler Thromb Vasc Biol，2009，29(3):289-295.

［3］ Yang G，Wu L，Jiang B，et al. H2S as a physiologic vasorelaxant:hypertension in mice with deletion of cystathionine γ-lyase［J］. Science，2008，322(5901):587-590.

［4］ Papapetropoulos A，Pyriochou A，Altaany Z，et al. Hydrogen sulfide is an endogenous stimulator of angiogenesis［J］. Proc Natl Acad Sci U S A，2009，106(51):21972-21977.

［5］ Yang G，Wu L，Wang R. Pro-apoptotic effect of endogenous H2S on human aorta smooth muscle cells［J］. FASEB J，2006，20(3):553-555.

［6］ Fu XD，F(xiàn)lamini M，Sanchez AM，et al. Progestogens regulate endothelial actin cytoskeleton and cell movement via the actin-binding protein moesin［J］. Mol Hum Reprod，2008，14(4):225-234.

［7］ 耿 彬，杜軍保，唐朝樞. 敏感硫電極法在測(cè)定心血管組織細(xì)胞及血漿胱硫醚-γ-裂解酶/硫化氫的應(yīng)用［J］.北京大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版)，2005，37(5):545-548.

［8］ Rayner K，Sun J，Chen YX，et al. Heat shock protein 27 protects against atherogenesis via an estrogen-dependent mechanism:role of selective estrogen receptor beta modulation［J］. Arterioscler Thromb Vasc Biol，2009，29(11):1751-1756.

［9］ Wang Y，Zhao X，Jin H，et al. Role of hydrogen sulfide in the development of atherosclerotic lesions in apolipoprotein E knockout mice［J］. Arterioscler Thromb Vasc Biol，2009，29(2):173-179.

［10］陸 媛，戴順齡，段金虹，等. 雌激素對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化的預(yù)防性治療作用及部分機(jī)制探討［J］. 中國(guó)病理生理雜志，2000，16(10):987.

［11］Torii R，Shiomi M，Ito T，et al. Cholesterol-fed ovariectomized monkeys are good animal models for human atherosclerosis of postmenopausal women［J］. Primates，2003，44(3):247-252.

［12］Kublickiene K，F(xiàn)u XD，Svedas E，et al. Effects in postmenopausal women of estradiol and medroxyprogesterone alone and combined on resistance artery function and endothelial morphology and movement［J］. J Clin Endocrinol Metab，2008，93(5):1874-1883.

［13］Sobrino A，Oviedo PJ，Novella S，et al. Estradiol selectively stimulates endothelial prostacyclin production through estrogen receptor-α［J］. J Mol Endocrinol，2010，44(4):237-246.

［14］Scotland RS，Madhani M，Chauhan S，et al. Investigation of vascular responses in endothelial nitric oxide synthase/cyclooxygenase-1 double-knockout mice:key role for endothelium-derived hyperpolarizing factor in the regulation of blood pressure in vivo［J］. Circulation，2005，111(6):796-803.

［15］Hodgin JB，Knowles JW，Kim HS，et al. Interactions between endothelial nitric oxide synthase and sex hormones in vascular protection in mice［J］. J Clin Invest，2002，109(4):541-548.

［16］ Wang R. Hydrogen sulfide:a new EDRF［J］. Kidney Int，2009，76(7):700-704.

［17］李曉璐，黃 雯，陳 燊，等. 內(nèi)源性硫化氫在糖尿病腎病病理變化中的作用［J］. 中國(guó)病理生理雜志，2009，25(11):2214-2216.

［18］Mishra PK，Tyagi N，Sen U，et al. H2S ameliorates oxidative and proteolytic stresses and protects the heart against adverse remodeling in chronic heart failure［J］. Am J Physiol Heart Circ Physiol，2010，298(2):H451-H456.

［19］Pan LL，Liu XH，Gong QH，et al. Role of cystathionine γ-lyase/hydrogen sulfide pathway in cardiovascular disease:a novel therapeutic strategy?［J］. Antioxid Redox Signal，2012，17(1):106-118.