李友軍，羅孝勇，郭向榮

(湖南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院分子細(xì)胞實(shí)驗(yàn)室，中國(guó)長(zhǎng)沙 410081)

為闡明Rac 蛋白的激活，表現(xiàn)強(qiáng)烈的時(shí)空調(diào)控，即在細(xì)胞前沿(leading edge)處于激活狀態(tài)(GTPbound)，而在細(xì)胞尾部或兩側(cè)，大多處于失活狀態(tài)(GDP-bound)，作者提出了在細(xì)胞前沿，當(dāng)整合素α4 的胞內(nèi)區(qū)域磷酸化，抑制其與paxillin 結(jié)合時(shí)，可形成paxillin-GIT1-PIX-PAK 的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，從而保證Rac 僅在細(xì)胞前沿局部化激活的構(gòu)想［1-4］.以免疫印跡、熒光雙定位試驗(yàn)，確認(rèn)細(xì)胞前沿該信號(hào)分子復(fù)合物的存在;以Rac蛋白激活試驗(yàn)驗(yàn)證了在纖粘蛋白fibronectin 刺激下，整合素α4 誘導(dǎo)的該信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路可導(dǎo)致Rac 的激活.

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)試劑及材料

大腸桿菌E.coli DH5α，CHO 細(xì)胞系本實(shí)驗(yàn)室保種;載體EGFP-N1 為本實(shí)驗(yàn)室提供;EcoRⅠ和SaIⅠ限制性?xún)?nèi)切酶，TaqDNA 聚合酶等，均購(gòu)于Fermentas;單抗購(gòu)于BD Biosciences，轉(zhuǎn)染試劑X-tremeGENE HP 購(gòu)于Roche，DMEM 培養(yǎng)基購(gòu)于Invitrogen，細(xì)胞培養(yǎng)皿購(gòu)于Corning，PVDF 膜為Millipore 產(chǎn)品.

1.2 分子克隆及載體構(gòu)建

根據(jù)EcoRⅠ和SaIⅠ酶切位點(diǎn)設(shè)計(jì)引物:GIT1 5'(CGGAATTCTGATGTCCCGAAAGGGG)GIT1 3'端引物(GCGTCGACTGTCACTGCTTCTTCTC)，以GIT1-ECFP(Addgene)為模板進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，反應(yīng)條件為:94 ℃變性6 min;94 ℃30 s，56 ℃30 s，72 ℃90 s，反應(yīng)30 個(gè)循環(huán);72 ℃延伸8 min.所得PCR 產(chǎn)物為2 386 bp.經(jīng)純化后，用CLONEJET 技術(shù)將PCR 產(chǎn)物克隆入pJET1.2/平端載體，轉(zhuǎn)化DH5α 大腸桿菌，挑取單克隆，提取質(zhì)粒后經(jīng)EcoRⅠ和SaIⅠ雙酶切檢測(cè)，得到陽(yáng)性克隆.限制性?xún)?nèi)切酶EcoRⅠ和SaIⅠ將目的DNA 片斷從pJET1.2/平端載體和GIT1 連接好的質(zhì)粒中切下，連接EGFP-N1 載體(經(jīng)EcoRⅠ和SaIⅠ酶切并純化)，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，提取質(zhì)粒經(jīng)EcoRⅠ和SaIⅠ雙酶切檢測(cè)，得到陽(yáng)性克隆，由上海生工公司測(cè)序證實(shí).

1.3 細(xì)胞轉(zhuǎn)染

將pEGFP-paxillin，pEGFP-GIT1 分別轉(zhuǎn)染CHO 細(xì)胞，根據(jù)選用的Roche 轉(zhuǎn)染試劑的要求比例以及預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，m(選用質(zhì)粒)∶V(轉(zhuǎn)染試劑)為1 μg∶1 μL 的比例，計(jì)算每張蓋玻片上的面積，復(fù)合物各組分所需要的量分別為:質(zhì)粒DNA:0.5 μg;轉(zhuǎn)染試劑:0.5 μL;轉(zhuǎn)染混合物總體積(無(wú)血清的培養(yǎng)液溶解):100 μL.依次加入無(wú)血清培養(yǎng)液、DNA、轉(zhuǎn)染試劑，三者充分混勻.室溫條件下孵育30 min.孵育完成后，去除蓋玻片上原有的培養(yǎng)液(但避免蓋玻片干燥)，蓋玻片置于2 mL 培養(yǎng)皿中，再將轉(zhuǎn)染混合物加到蓋玻片，做好標(biāo)記，37 ℃恒溫、5%CO2(體積分?jǐn)?shù))、濕度適宜條件下培養(yǎng)4 h 后吸掉原溶液，加入新鮮的含血清的完全培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)24～36 h.

1.4 免疫熒光檢測(cè)相關(guān)蛋白的相互作用

轉(zhuǎn)染良好，則應(yīng)立即除去培養(yǎng)液，用PBS 洗1～2 次;加入含40 g/L 多聚甲醛的PBS 緩沖液，暗室中固定5 min;用PBS 緩沖液洗滌兩次，再向每張蓋玻片上分別加入500 μL 含10 g/L 牛血清蛋白(Bovine Serum Albumin，BSA)的PBS 緩沖液封閉，在室溫條件下封閉孵育1 h 左右;用PBS 漂洗兩次，轉(zhuǎn)染了paxillin-EGFP，GIT1-EGFP 兩組細(xì)胞中分別加入10 mg/L 用含10 g/L BSA 稀釋的Anti-GIT1 和10 g/L BSA 稀釋的Anti-PIX，4 ℃孵育過(guò)夜后，用PBS 洗滌3 次;每張蓋玻片上分別加入100 μL 用超純水按體積比1∶100 稀釋的羊抗鼠標(biāo)記羅丹明，室溫、避光孵育2～3 h，PBS 漂洗3 次;尼康倒置熒光顯微鏡(Eclipse Ti-U)下觀(guān)察、照像.

1.5 免疫印跡檢測(cè)相關(guān)蛋白的相互作用

細(xì)胞傳代3 組CHO 細(xì)胞，24～36 h 后，誘導(dǎo)結(jié)束除去培養(yǎng)液，PBS 沖洗2 次;培養(yǎng)皿加入含蛋白酶抑制劑的細(xì)胞裂解緩沖液，使細(xì)胞充分裂解;低溫條件下，刮下細(xì)胞轉(zhuǎn)移至3 組微量離心管，其中兩組加入Anti-Paxillin，另一組加入Anti-GIT1.抗體孵育完成后，再向每個(gè)離心管中分別加入20 μL Protein A/G PLUS-Agarose 冰上搖晃3 h;孵育完成后離心，棄上清，用細(xì)胞裂解液洗滌4 次;每組離心管中分別加入20 μL 1×的蛋白質(zhì)電泳Loading Buffer 混合物(包含了DTT)，在沸水中煮5～8 min;將樣品保存在4 ℃冰箱;SDS-聚丙烯胺凝膠電泳;電泳結(jié)束后，電轉(zhuǎn)膜，用Bio-rad 凝膠分子成像系統(tǒng)(ChemiDocTM XRS)，選擇合適的曝光時(shí)間，對(duì)PVDF 膜照像.

1.6 Rac 蛋白激活試驗(yàn)

將人的全長(zhǎng)PAK cDNA 基因按正確讀碼框克隆到pEGFP-N2 載體中，轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞篩選陽(yáng)性結(jié)果.將pEGFP-PAK 質(zhì)粒DNA 轉(zhuǎn)染到CHO 細(xì)胞，36 h 后裂解細(xì)胞.以抗EGFP 單抗與Protein A/G PLUSAgarose 免疫沉淀.將培養(yǎng)在fibronectinb(5 mg/L)包被的35 mm 培養(yǎng)皿CHO 細(xì)胞裂解后，與PAK 瓊脂糖珠共孵育，聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜后，以抗Rac 單抗在分子成像系統(tǒng)上直接檢測(cè)Rac 蛋白激活.

2 結(jié)果與分析

2.1 GIT1-EGFP 質(zhì)粒構(gòu)建的結(jié)果分析

本文所用的GIT1 基因和Paxillin 均由美國(guó)Addgene 購(gòu)得.以GIT1-ECFP 質(zhì)粒為模板，引物中加入SalⅠ、EcoRⅠ的酶切位點(diǎn)，對(duì)GIT1 基因進(jìn)行了擴(kuò)增.DNA 電泳后如圖1.

PCR 擴(kuò)增后全長(zhǎng)GIT1 基因?yàn)? 388 bp，經(jīng)拍照檢測(cè)，目的片段大小正確.由于目的基因片段大小已經(jīng)達(dá)到2 000 bp 以上，酶切位點(diǎn)處于近末端的位置，作者使用直接酶切的辦法可能無(wú)法正常地切動(dòng)，經(jīng)數(shù)次嘗試均無(wú)法連接成功，故采用中間載體pJET1.2/平端載體將目的基因環(huán)化，使酶切位點(diǎn)不再處于近末端.該載體具有良好的親和性，并不會(huì)產(chǎn)生不必要的其他DNA 片段.將GIT1 基因與pJET1.2/平端載體連接并轉(zhuǎn)化至平皿，長(zhǎng)出菌落后，菌落PCR 篩選出陽(yáng)性克隆.搖菌，提取質(zhì)粒;將GIT1 基因與pJET1.2/平端載體連接的質(zhì)粒和EGFP-N1 質(zhì)粒用SalⅠ和EcoRⅠ進(jìn)行酶切，酶切產(chǎn)物連接，連接子轉(zhuǎn)化涂板，長(zhǎng)出菌落后，菌落PCR 篩選出陽(yáng)性克隆.搖菌，提取質(zhì)粒;再對(duì)質(zhì)粒進(jìn)行酶切，電泳拍照如圖2.

圖1 PCR 擴(kuò)增后全長(zhǎng)GIT1 基因Fig.1 Full-length human cDNA of GIT1 after PCR amplification

圖2 克隆載體酶切鑒定(EcoRⅠ+SalⅠ)Fig.2 Identification of the enzyme digestion of the expression vector(EcoRⅠ+SalⅠ)

目的基因和載體大小均完全正確，將已經(jīng)構(gòu)建好的pEGFP-GIT1 質(zhì)粒送上海生工公司測(cè)序，測(cè)序結(jié)果完全正確.

2.2 免疫印跡和免疫沉淀檢測(cè)相關(guān)蛋白之間的相互作用結(jié)果

正常CHO 細(xì)胞均含有GIT1、Paxillin、PIX 基因及表達(dá)蛋白，培養(yǎng)3 組細(xì)胞后，作者直接以抗GIT1 的單克隆抗體與細(xì)胞裂解液免疫共沉淀，用抗GIT1 或抗paxillin 和抗PIX 的單抗在分子成像系統(tǒng)上直接檢測(cè)的western blotting 試驗(yàn)表明(圖3)，GIT1 與Paxillin、PIX，在活細(xì)胞中均存在強(qiáng)烈的相互作用，由此作者證實(shí)了在CHO 細(xì)胞中GIT1、Paxillin、PIX 三者可以三元復(fù)合體形式存在于細(xì)胞中.

圖3 GIT1、paxillin、PIX 蛋白相互作用的western blotting 檢測(cè)Fig.3 Western blotting of the interaction between GIT1 and paxillin or PIX

2.3 免疫熒光檢測(cè)蛋白之間相互作用的可以發(fā)生在細(xì)胞前沿

通過(guò)免疫印跡實(shí)驗(yàn)作者證實(shí)了，GIT1 與Paxillin、PIX 在活細(xì)胞中均存在強(qiáng)烈的相互作用，但它們能否以三元復(fù)合體形式存在于細(xì)胞前沿呢?作者利用人纖粘蛋白(Human fibronectin，hFN)誘導(dǎo)CHO 細(xì)胞快速貼壁生長(zhǎng)，細(xì)胞長(zhǎng)勢(shì)良好，將質(zhì)粒pEGFP-GIT1 轉(zhuǎn)染CHO 細(xì)胞，24～36 h 后，熒光顯微鏡下拍照，可以看到轉(zhuǎn)染后偶聯(lián)了綠色熒光蛋白EGFP 的GIT1 蛋白，再分別選用Paxillin 和PIX 的一抗通過(guò)免疫熒光檢測(cè)(圖4).A1轉(zhuǎn)染的為pEGFP-GIT1 質(zhì)粒，A2 為Anti-Paxillin 孵育后的免疫熒光圖片，A3 為A1、A2 的疊加圖片.B1 轉(zhuǎn)染的為GIT1-EGFP 質(zhì)粒，B2 為Anti-PIX 孵育后的免疫熒光圖片，B3 為B1、B2 的疊加圖片.從圖A3 可以明顯看出Paxillin 與GIT1 具有強(qiáng)烈的相互作用，且這種相互作用可以發(fā)生于細(xì)胞前沿或細(xì)胞尾部.同理，通過(guò)圖B3 可看出GIT1 與PIX 的相互作用也可以出現(xiàn)在細(xì)胞前沿、細(xì)胞尾部或細(xì)胞兩側(cè).

圖4 熒光雙定位試驗(yàn)Fig.4 Fluorescent co-localization assay

這表明在細(xì)胞前沿，確實(shí)存在Paxillin 與GIT1，GIT1 與PIX 的相互作用，由此Paxillin-GIT1-PIX 能以三元復(fù)合體形式存在于細(xì)胞前沿.

2.4 Rac 蛋白的激活實(shí)驗(yàn)

在纖粘蛋白(fibronectin)刺激下，整合素α4 聚集成簇，α4 胞內(nèi)區(qū)域磷酸化而抑制其與Paxillin 結(jié)合時(shí)，Paxillin、GIT1 與PIX、PAK 形成信號(hào)分子復(fù)合物.免疫印跡和免疫熒光已證實(shí)了Paxillin-GIT1-PIX 能以三元復(fù)合體形式存在于細(xì)胞前沿，為確認(rèn)在纖粘蛋白的刺激下，激活的整合素α4 能否誘導(dǎo)Rac 蛋白處于激活狀態(tài)(GTP-bound)，作者將細(xì)胞裂解液與PAK 瓊脂糖珠共孵育.如果Rac 蛋白處于激活狀態(tài)，就能與PAK 蛋白結(jié)合.聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜，以抗Rac 單抗在分子成像系統(tǒng)上直接檢測(cè).結(jié)果表明(圖5)，上樣的兩種蛋白量基本相同，在纖粘蛋白(fibronectin)刺激下，整合素α4 誘導(dǎo)部分Rac 蛋白處于激活狀態(tài)(GTPbound)，而在無(wú)纖粘蛋白刺激的細(xì)胞裂解液中，沒(méi)有檢測(cè)到激活的Rac 蛋白.

圖5 Rac 蛋白激活試驗(yàn)Fig.5 Rac activation assay

3 討論

Nishiya 等［5］的研究開(kāi)啟了整合素通過(guò)調(diào)控Rac 激活而調(diào)控細(xì)胞極性形成的研究領(lǐng)域.細(xì)胞骨架蛋白paxillin 通過(guò)其不同結(jié)構(gòu)域，與整合素和其他粘附分子結(jié)合，是粘附斑轉(zhuǎn)換的關(guān)鍵調(diào)控因素［6］.由于其他整合素，如αIIbβ3、α5β1 等的α 胞內(nèi)區(qū)域通常不與paxillin 結(jié)合，在細(xì)胞尾部、兩側(cè)，由整合素α4 的胞內(nèi)尾部與骨架蛋白paxillin 聯(lián)結(jié)，paxillin 通過(guò)其LD4 結(jié)構(gòu)域與GIT1 結(jié)合，形成α4 的胞內(nèi)區(qū)域-paxillin-GIT1 的信號(hào)分子復(fù)合物［7-8］.GIT1(G protein-coupled receptor kinase-interacting protein 1)為一涉及多個(gè)細(xì)胞過(guò)程且具多蛋白結(jié)合域的基因，常定位于胞質(zhì)復(fù)合物、粘附斑和細(xì)胞前沿［9-10］，可與Arf、Rac 或Cdc42 的下游效應(yīng)分子PAK(P21-activatedkinase)、Rac 的轉(zhuǎn)換因子PIX(PAK-interacting exchange factor)相互作用［11-13］.盡管已經(jīng)證實(shí)，paxillin、GIT1 與PIX 之間存在相互作用，但作者的熒光雙定位和免疫印跡實(shí)驗(yàn)是要驗(yàn)證在CHO 活細(xì)胞中，GIT1 與paxillin 或PIX 不僅存在相互作用，且這種相互作用可以發(fā)生在細(xì)胞前沿.免疫印跡實(shí)驗(yàn)表明，GIT1與Paxillin、PIX 存在強(qiáng)烈的相互作用，熒光雙定位表明這種相互作用主要發(fā)生在細(xì)胞尾部或細(xì)胞前沿.這證實(shí)了在細(xì)胞前沿可以存在paxillin-GIT1-PIX 至Rac 的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路.Rac 蛋白的激活實(shí)驗(yàn)表明，在纖粘蛋白(fibronectin)刺激下，整合素α4 誘導(dǎo)的該信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路可使Rac 蛋白處于激活狀態(tài)(GTP-bound).下一步，作者將采用本實(shí)驗(yàn)室開(kāi)發(fā)的FRET 單分子探針，在confocal 下實(shí)現(xiàn)高時(shí)空分辨率的可視、實(shí)時(shí)、定量地追蹤胞內(nèi)局部、瞬時(shí)的FRET 信號(hào)，以揭示活細(xì)胞中誘導(dǎo)激活的Rac 從失活到激活狀態(tài)的時(shí)空變化圖像［4］.

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