周 娜，易自力，蔣建雄

（湖南農(nóng)業(yè)大學(xué) 生物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，湖南 長沙 410128）

芒屬（Miscanthus）為多年生的禾本科C4植物，廣泛分布于中國、日本、朝鮮半島等亞洲東部地區(qū)［1］。芒屬植物的莖稈粗壯，根系發(fā)達，植株生長速度快，易繁殖，抗逆性強［2］。其地上部分也可作飼料、纖維與建筑材料加以利用。此外，還是水土保持植物［3，4］。目前，因其高光效、高生物量、高燃值等特點而被國際上納入具有利用價值和開發(fā)前景的“新經(jīng)濟作物”并投入開發(fā)與研究［5，6］。芒（Miscanthussinensis）是芒屬中的一個廣布種，在我國東北、華北、西南、華中、華南、華東等地區(qū)都有分布，具有極強的適應(yīng)性。同時，芒還是歐美地區(qū)唯一被廣泛種植和研究的三倍體自然雜交種—奇崗（M.xgiganteus）的親本之一，因而備受關(guān)注［7］。其作為未來重要的能源植物，進行品種改良和推廣是首要問題。常規(guī)雜交育種難度大、周期長、效率低［8］，在植物遺傳轉(zhuǎn)化的研究中，快速、有效地從大量轉(zhuǎn)化群體（外植體及種子）中篩選出含有外源目的基因的轉(zhuǎn)化體是成功獲得轉(zhuǎn)基因植株的關(guān)鍵。目前，轉(zhuǎn)化體的篩選是利用抗生素篩選、除草劑篩選、β－葡萄糖苷酸酶（GUS）染色反應(yīng)以及熒光蛋白標記篩選4種方法［9］。但不同植物種類、基因型甚至不同的外植體類型對選擇劑的敏感程度存在很大的差異，因此，對不同的受體系統(tǒng)進行轉(zhuǎn)化時都必須事先確定相應(yīng)選擇劑的有效選擇壓力［10］。在轉(zhuǎn)基因植株的培育過程中，愈傷組織的生長、分化和再生都是非常重要的環(huán)節(jié)［11］，通過不同濃度潮霉素（Hyg）、遺傳霉素重硫酸鹽（G418）以及除草劑（Basta）對芒的胚性愈傷組織的生長、分化以及植株生根的抑制效果，確定臨界的篩選濃度和最佳篩選時長，為進一步利用植物基因工程技術(shù)對芒屬植物進行遺傳改良打下基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料 供試材料為種植于湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)芒屬植物資源圃內(nèi)的芒，編號為A0404，原產(chǎn)地為云南文山。資源圃位于湖南省長沙市東郊，N 28°11′，E 113°02′，海撥80m，土壤為壤土，土壤肥力中等。平均氣溫為18.2℃，1月最冷，平均氣溫4.7℃，7月最熱，平均氣溫29.4℃。全年平均無霜期275d，平均降水量約1 400mm，屬亞熱帶季風(fēng)濕潤氣候區(qū)，溫和濕潤，季節(jié)變化明顯。

1.1.2 培養(yǎng)基 愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基（M1）MS＋4 mg／L 2，4－D；愈傷繼代培養(yǎng)基（M2）MS＋ 2mg／L 2，4－D＋0.5mg／L 6－BA；分化培養(yǎng)基（M3）MS＋2mg／L 6－BA；生根培養(yǎng)基（M4）MS＋ 0.9mg／L NAA＋0.9mg／L IAA＋0.1mg／L IBA。

以上培養(yǎng)基都為固體培養(yǎng)基，添加瓊脂8g／L，蔗糖30g／L，pH 5.8。培養(yǎng)基于121℃高壓蒸汽滅菌20 min，冷卻后保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 方法

1.2.1 愈傷組織的誘導(dǎo) 于晴天上午8∶00～11∶00采處于幼穗穎花原基形成期［12］的健壯幼穗，用70%酒精進行表面消毒，然后用0.1%升汞處理10min，無菌水漂洗5次。無菌剝離幼穗，整穗接種長度為1.0～1.5 cm，接種于M1培養(yǎng)基上誘導(dǎo)胚性愈傷。試驗中除愈傷分化及生根培養(yǎng)階段采用光照培養(yǎng)外，其他階段均為暗培養(yǎng)。光照培養(yǎng)條件為每天光照時間12h，光照強度2 000lx，培養(yǎng)溫度24～27℃。

1.2.2 選擇壓力的確定 篩選劑為遺傳轉(zhuǎn)化研究中常用的 Hyg，濃度分別為30、40、50、60mg／L；G418濃度分別為50、75、100mg／L；Basta濃度分別為2.5、5、10、20、40mg／L，采用過濾滅菌。在培養(yǎng)基溫度降至50℃時，加入已過濾滅菌的篩選劑。

將在M1中生長旺盛的胚性愈傷組織（直徑為2～3mm），分別接種到添加篩選劑的M2、M3培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)。每個處理設(shè)5次重復(fù)，每次重復(fù)接種30塊愈傷組織。生根篩選采用高度3～4cm的生長健壯的無根再生苗接種于M4，每個處理設(shè)5次重復(fù)，每個重復(fù)接種5株。以不含篩選劑的培養(yǎng)基為對照。分別統(tǒng)計不同處理培養(yǎng)10、20、30d以及40d時愈傷組織死亡率、不定芽分化率及生根率。

1.2.3 數(shù)據(jù)分析 愈傷死亡率（%）＝（死亡愈傷數(shù)／接入愈傷數(shù)）×100%；

不定芽分化率（%）＝（出芽愈傷數(shù)／接入愈傷數(shù)）×100%；

生根率（%）＝（長根苗數(shù)／接入苗數(shù)）×100%。

所得數(shù)據(jù)采用DPS軟件Tukey法［13，14］進行方差分析和二因素比較分析（P＝0.05）。

2 結(jié)果與分析

2.1 芒胚性愈傷篩選壓力的確定

Basta，Hyg和G418 3種篩選劑不同的濃度處理對芒愈傷組織致死率的影響具極顯著差異，處理時間對愈傷組織致死率的影響具有極顯著差異，3種篩選劑不同濃度處理與處理時長的互作效應(yīng)也具極顯著差異。隨篩選劑濃度的增加以及篩選時間的延長，上述3種篩選劑對愈傷組織的抑制作用愈加明顯。與對照相比，添加了篩選劑的M2培養(yǎng)基中，愈傷組織體積較小，生長受到明顯抑制。從致死率分析看，Basta的抑制效果較為明顯，在較低的使用濃度下即可使愈傷組織停止生長，甚至死亡。當(dāng)Basta濃度為2.5mg／L培養(yǎng)40d時，愈傷組織的死亡率50.64%（表1）。隨著Basta濃度逐漸升高，愈傷組織的死亡率逐漸上升，當(dāng)濃度達到20mg／L時，愈傷致死率大幅上升，培養(yǎng)40 d后死亡率為96%。但是芒的愈傷組織對Basta的毒害作用反應(yīng)較緩慢，篩選10d才逐漸有變化，愈傷組織由鮮黃色慢慢失去光澤而變成深黃色、棕黃色，最后成褐色或是由鮮黃色逐漸變成蒼白色。相反，愈傷組織對Hyg的毒害作用敏感，30mg／L濃度下篩選培養(yǎng)3d，愈傷組織上出現(xiàn)絲狀血紅色，并隨著時間延長不斷擴大，顏色加深，培養(yǎng)8d顏色呈深褐色。當(dāng)濃度為50mg／L，培養(yǎng)10d，死亡率為86.23%，培養(yǎng)20d死亡率達96.55%。隨著篩選時間的繼續(xù)延長，不同濃度處理愈傷組織的死亡率升高幅度不大；愈傷組織在含G418的培養(yǎng)基上培養(yǎng)5d顏色開始有明顯變化，逐步轉(zhuǎn)變?yōu)樯詈稚籊418濃度為75mg／L時，培養(yǎng)20d后的愈傷死亡率達97.29%，且隨著篩選時間的延長，愈傷死亡率未進一步升高。

表1 不同濃度篩選劑下芒愈傷組織的致死率Table1 Effects of different selecting agents on callus survival rate of M.sinensis

綜合考慮篩選濃度和篩選時間的影響，在以芒的愈傷組織為受體系統(tǒng)進行遺傳轉(zhuǎn)化時，G418的篩選中應(yīng)以75mg／L濃度下篩選20d；Hyg的篩選中應(yīng)以50 mg／L濃度下篩選20d；Basta的篩選以20mg／L篩選40d為最佳組合。

2.2 芒不定芽再生時篩選壓力的確定

篩選劑對芒不定芽分化的毒性作用比對胚性愈傷更強。方差分析表明，篩選劑濃度對不定芽分化的影響具有極顯著差異。在分化培養(yǎng)基中，對照中的大部分愈傷組織培養(yǎng)10d分化出綠色的芽點。在含有30 mg／L G418分化培養(yǎng)基中，培養(yǎng)20d時才有少量不定芽產(chǎn)生，分化率僅為5.08%。隨著培養(yǎng)時間的延長，一部分芽會逐漸死亡。隨著G418濃度的升高，愈傷組織變得暗淡松軟并失水，最后逐漸褐化死亡（表2）。當(dāng)G418濃度為60mg／L時，基本上無綠色芽點出現(xiàn)，培養(yǎng)20d后愈傷組織全部褐化死亡。Hyg為30mg／L培養(yǎng)10d時分化率為8.67%，芽點生長速度相對較快，培養(yǎng)30d幼苗長2～3cm；濃度為40mg／L時基本無綠色芽點產(chǎn)生，培養(yǎng)20d后愈傷組織全部呈深褐色。隨著Hyg的濃度進一步增大，愈傷組織褐化死亡率更高；Basta濃度為2.5和5mg／L時，愈傷組織培養(yǎng)20d時均有綠色芽點出現(xiàn)，分化率分別為22.97%和16.97%。再生的芽點生長速度較慢、長勢較弱。隨著培養(yǎng)時間的延長，有些分化出的不定芽會逐漸枯黃死去。當(dāng)Basta濃度升至10mg／L時，有個別愈傷組織能分化出少量不定芽，也會隨著培養(yǎng)時間的延長而死亡。當(dāng)濃度達到40mg／L時，所有愈傷組織喪失分化能力。

表2 不同濃度篩選劑下芒不定芽的再生Table2 Effects of concentration of selecting agents on seedling regeneration of M.sinensis

3種篩選劑對不定芽再生影響情況分析，在抗性芽的篩選過程中，G418為50mg／L，Hyg為40mg／L，Basta 10mg／L可完全抑制芒不定芽的分化，且3種篩選劑最佳篩選時間均為20d。

2.3 芒試管苗生根選擇壓力的確定

方差分析表明，Basta，Hyg和G418篩選劑不同濃度的處理對芒植株生根的影響均為極顯著水平差異。對照的生根率為100%，植株生長良好，根系發(fā)達，平均單株根數(shù)為9（表3）。G418濃度為30mg／L時，有部分植株的葉片呈黃綠色，培養(yǎng)20d后生根率為56.0%，平均單株根數(shù)為3.0，但產(chǎn)生的根很短，平均0.3mm，生長緩慢；當(dāng)濃度為40mg／L時，生根率為48.0%，平均單株根數(shù)為3.0，平均根長0.1～0.2 mm，植株葉片枯黃，并且有少量葉片白化；當(dāng)濃度增至50mg／L時，生根率為20.0%，平均單株根數(shù)為2.0，但植株葉片呈枯黑狀，部分整株死亡；濃度為60mg／L時，植株均無根產(chǎn)生，葉片明顯白化，部分植株枯黑死亡；Hyg濃度為30、40mg／L時，均有根生成，生根率分別為24.0%和12.0%，平均單株根數(shù)分別為3.0、2.0，但植株的葉片隨著濃度的升高葉色由綠色向黃色逐漸轉(zhuǎn)變。隨著濃度增至50mg／L時，沒有根生成，部分植株葉片完全失綠呈黑褐色，難以進行正常的光合作用。濃度為60mg／L時，無根生成，植株葉片整體呈黑褐色，并逐漸萎蔫死亡；Basta處理2～3d后，植株均開始出現(xiàn)不同程度的枯黃、白化，濃度為2.5 mg／L時，處理20d時生根率為16.0%，平均單株根數(shù)為0.6，平均根長1mm，植株生長勢極弱，葉片失綠，葉尖白化。隨著濃度增加，植株白化枯黃程度加劇，直至所有植株黃化死亡。

表3 不同濃度篩選劑對芒分化苗生根的抑制效果Table3 Effect of different selecting agents on seedling rooting of M.sinensis

綜合生根情況以及其生長勢，在芒抗性植株的篩選過程中，G418 60mg／L，Hyg 50mg／L、Basta 10 mg／L，培養(yǎng)20d能完全抑制芒植株的生根。

3 討論與結(jié)論

轉(zhuǎn)基因成為培育芒屬植物新品種最快、最具優(yōu)勢的途徑，與傳統(tǒng)育種技術(shù)相比，轉(zhuǎn)基因技術(shù)所轉(zhuǎn)移的基因不受生物體間親緣關(guān)系的限制，并且所操作和轉(zhuǎn)移的一般是經(jīng)過明確定義的基因，功能清楚，后代表現(xiàn)準確，可定向地獲得優(yōu)良的新品種［15］。國內(nèi)外已有多個研究小組開始從事相關(guān)的研究工作，并有建立芒屬植物遺傳轉(zhuǎn)化體系的研究報道，如易自力等［16］建立的基因槍法介導(dǎo)的南荻（Triarrhenasacchariflora）遺傳轉(zhuǎn)化體系。一般認為，每個愈傷組織起源于同一個細胞，是選擇轉(zhuǎn)化子的良好材料，被廣泛應(yīng)用于遺傳轉(zhuǎn)化［17，18］。遺傳轉(zhuǎn)化中通常需要進行抗生素抗性標記選擇，常用的選擇標記基因有NPTⅡ、HPT、Bar等，分別采用卡那霉素（Kanamycin）和 G418［19］、Hyg和Basta進行轉(zhuǎn)化體的篩選。遺傳轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化率較低，要逐株進行分子鑒定不現(xiàn)實，應(yīng)用抗生素進行轉(zhuǎn)基因個體的初篩，有效地從轉(zhuǎn)化受體材料中篩選出轉(zhuǎn)化子是提高轉(zhuǎn)化效率的一個重要環(huán)節(jié)，因此，事先確定相應(yīng)的篩選劑有效的選擇壓力能提高篩選效率，減少人力財力的浪費。

此次實驗研究表明，75mg／L G418篩選20d、50 mg／L篩選20d、20mg／L Basta篩選40d能有效抑制非轉(zhuǎn)化子愈傷組織的生長，又不至于造成細胞的大量死亡，是芒遺傳轉(zhuǎn)化中抗性愈傷組織篩選較為理想的濃度。易自力等［16］建立的南荻遺傳轉(zhuǎn)化體系中南荻轉(zhuǎn)化子的篩選方案為G418 150mg／L濃度下篩選60 d，Hyg 30mg／L濃度下篩選40d，Basta 20mg／L濃度篩選40d［16］，而 Dean等［20］在農(nóng)桿菌介導(dǎo)芒遺傳轉(zhuǎn)化實驗中轉(zhuǎn)化子的篩選方案為G418 100mg／L篩選20d，與實驗確定篩選濃度以及篩選時間均有一些差別，這可能與受體組織的種類、基因型以及生長狀態(tài)等多方面的因素密切相關(guān)。篩選劑濃度在抗性愈傷組織的分化階段，也存在對非轉(zhuǎn)化愈傷組織的抑制問題，然而，篩選壓力的加入會對轉(zhuǎn)化愈傷組織的生長和分化造成一定的不利影響，如分化時間延長，分化率降低、幼苗生長緩慢甚至死亡等［21］。建立一個非轉(zhuǎn)化愈傷組織的抑制和轉(zhuǎn)化愈傷組織的正常分化的平衡關(guān)系，也是芒抗性愈傷組織分化階段必須考慮的問題。實驗結(jié)果表明，采用50mg／L G418、40mg／L Hyg以及10 mg／L Basta篩選20d，在愈傷組織再生階段既能對非轉(zhuǎn)化愈傷組織有一定的抑制作用，也能保證轉(zhuǎn)化的愈傷組織能正常分化，是芒分化階段較為理想的篩選濃度；在生根階段，用60mg／L G418或50mg／L Hyg或10mg／L Basta培養(yǎng)20d能及時有效的淘汰掉大部分非轉(zhuǎn)化體。

實驗結(jié)果表明，在胚性愈傷組織篩選、不定芽再生以及試管苗生根3個不同培養(yǎng)階段，篩選劑的毒性作用不同。G418的毒性作用對不定芽再生的影響最大，對芒試管苗生根影響次之，對胚性愈傷組織影響最小；Hyg的毒性作用對不定芽再生影響最大，對芒胚性愈傷及試管苗生根的影響次之；Basta的毒性作用對芒不定芽再生以及試管苗生根影響較對胚性愈傷組織影響較大。3種篩選劑中以Basta對芒植株再生各個階段的抑制效果最為明顯，在較低濃度下就能抑制大部分細胞生長，Hyg的抑制效果次之，G418抑制效果相對來說最不明顯。由此可以得出結(jié)論：芒的遺傳轉(zhuǎn)化過程中，Basta為較理想的篩選劑，且不定芽再生階段篩選劑的濃度應(yīng)較其他2個培養(yǎng)階段低，這種篩選策略在其他禾本科植物如玉米［22］、水稻［23］以及甘蔗［24］等的遺傳轉(zhuǎn)化中也有所應(yīng)用。既保證轉(zhuǎn)化的有效性，又降低篩選劑對轉(zhuǎn)化細胞的影響，減小篩選劑對不定芽再生的抑制作用。

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