魏美榮　李國菊　張達　顏世果　戚向敏

[摘要] 目的 研究不同濃度角質細胞生長因子（KGF）對口腔黏膜上皮細胞凋亡的作用，為探討KGF在口腔黏膜病發(fā)生發(fā)展中的作用提供依據(jù)。方法 將不同濃度的KGF（對照組0 ng·mL-1，實驗1組5 ng·mL-1，實驗2組25 ng·mL-1，實驗3組50 ng·mL-1）分別加入體外培養(yǎng)的口腔黏膜上皮細胞，培養(yǎng)12、24、48 h后，倒置顯微鏡下觀察其對細胞形態(tài)的影響，并用流式細胞儀檢測細胞凋亡情況，熒光實時定量檢測細胞凋亡相關基因Bcl-2、Bax mRNA的表達水平。結果 1）實驗組較對照組細胞貼壁明顯，且48 h時實驗3組細胞核仁明顯。2）培養(yǎng)48 h時，4組之間的細胞凋亡率、Bcl-2 mRNA、Bax mRNA表達均有統(tǒng)計學差異，隨著KGF濃度的增加，細胞凋亡率和Bax mRNA表達逐漸降低，Bcl-2 mRNA表達逐漸升高（P<0.05）。結論 KGF可通過上調Bcl-2 mRNA和下調Bax mRNA的表達抑制上皮細胞的凋亡。

[關鍵詞] 角質細胞生長因子； 細胞凋亡； 口腔黏膜上皮細胞

[中圖分類號] R 783.5 [文獻標志碼] A [doi] 10.7518/hxkq.2013.06.005

細胞凋亡與口腔疾病的發(fā)生密切相關[1]。角質細胞生長因子（keratinocyte growth factor，KGF）為堿性成纖維細胞生長因子家族的一員，由間質細胞分泌，通過旁分泌的途徑作用于上皮細胞。在本課題組前期的研究中，發(fā)現(xiàn)KGF與口腔黏膜上皮細胞的增殖和凋亡密切相關[2]，KGF在口腔黏膜上皮的顆粒層及棘層上皮細胞的表達水平較高。本研究將不同濃度的KGF作用于培養(yǎng)的人口腔黏膜上皮細胞，檢測其對口腔黏膜上皮細胞凋亡相關基因Bcl-2、Bax mRNA表達水平的影響，探討其在口腔黏膜病的發(fā)生、發(fā)展及治療中的作用。

1 材料和方法

1.1 細胞來源

人口腔黏膜上皮細胞系由山東省口腔生物醫(yī)學重點實驗室提供，來源于日本早稻田大學，取第3～10代的細胞用于實驗。

1.2 主要儀器和試劑

改良無血清培養(yǎng)基D-KSFM（GIBICO公司，美國），Annexin V-FITC凋亡檢測試劑盒（中國Best-Bio公司），SYBR Premix Ex TapTM[寶生物工程（大連）有限公司]，KGF（Prospec公司，美國），熒光定量聚合酶鏈反應（polymerase chain reaction，PCR）儀ABI7500（Bio-Rad公司，美國），流式細胞儀 EPICS XL（Beckman公司，美國）。

1.3 口腔黏膜上皮細胞的培養(yǎng)及鑒定

從液氮中取出細胞凍存管后，迅速放入到37 ℃水浴中，輕振蕩使其快速解凍。在紫外燈照射30～

40 min并通風10 min的超凈臺中，將凍存管內細胞懸液移入離心管后加入5～10 mL含10%胎牛血清及1%雙抗的培養(yǎng)液。離心800 r·min-1 8 min。去除上清后加入培養(yǎng)液吹打成細胞懸液，接種。在37 ℃、5%

CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。復蘇第2天更換培養(yǎng)液，每3天換液1次，待細胞生長到覆蓋瓶底壁80%時傳代。

口腔黏膜上皮細胞體積較小，貼壁生長，呈扁平的卵圓形或多角形如鋪路石狀。熒光角蛋白免疫組化標記陽性。

1.4 口腔黏膜上皮細胞分組

取對數(shù)期口腔黏膜上皮細胞進行傳代培養(yǎng)，待細胞密度達到70%～80%融合時，加入D-KSFM培養(yǎng)24 h，去除原培養(yǎng)液，根據(jù)實驗分組分別加入含不同濃度KGF（實驗1組5 ng·mL-1，實驗2組25 ng·mL-1，實驗3組50 ng·mL-1）的D-KSFM，對照組加入等體積無菌PBS（0 ng·mL-1KGF）。

1.5 KGF對細胞形態(tài)的影響

各組細胞培養(yǎng)12、24、48 h后，在倒置顯微鏡下進行細胞形態(tài)學觀察。

1.6 流式細胞儀檢測細胞凋亡率

各組細胞培養(yǎng)48 h后，胰酶消化，收集細胞懸液，用預冷的PBS洗滌細胞2次（2 000 r·min-1，5 min）。用400 μL 1×Annexin V結合液懸浮細胞，濃度為每毫升1×106個細胞；加入5 μL Annexin V-FITC染色液，輕輕混勻后于2～8 ℃避光孵育15 min；加入10 μL PI染液后輕輕混勻，2～8 ℃避光下孵育5 min，1 h內用流式細胞儀進行檢測。右上象限（FITC+/PI+）代表晚期凋亡和壞死細胞，右下象限（FITC+/PI-）代表早期凋亡細胞，左下象限（FITC-/PI-）代表活細胞。

1.7 熒光實時定量檢測細胞凋亡相關基因Bcl-2、BaxmRNA的表達

各組細胞培養(yǎng)12、24、48 h后，收集細胞并提取各組細胞總RNA，經(jīng)RNA濃度及純度檢測后，用逆轉錄試劑盒逆轉錄成cDNA。熒光Real-Time PCR反應體系：SYBR? Premix Ex TaqTM （2×）10 μL，PCR上游引物（10 μm）0.4 μL，PCR 下游引物（10 μm）0.4 μL，ROX Reference Dye Ⅱ（50×）0.4 μL，DNA模版2.0 μL，dH2O 6.8 μL。以GAPDH為內參，用ABI 7500 Real-Time PCR System儀器，在8聯(lián)管中進行Real-Time PCR反應，反應條件：95 ℃預變性10 min，95 ℃變性15 s，60 ℃退火60 s，72 ℃延伸45 s，共40個循環(huán)，72 ℃末次延伸5 min。引物序列見表1。所有反應在ABI7500型實時熒光定量PCR儀上進行，每個樣本檢測均重復3次，取其平均值。存儲熒光信號，繪制擴增曲線，得出各樣本的擴增循環(huán)數(shù)（cycle number，Ct）。采用2-ΔΔCt 法計算LOX-1 mRNA 的相對表達量，ΔCt=目的基因Ct值-內參Ct值，-ΔΔCt=空白對照組ΔCt值-實驗組ΔCt值。

1.8 統(tǒng)計分析

采用SPSS 16.0軟件進行統(tǒng)計，對檢測結果進行單因素方差分析和t檢驗。P<0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 KGF對細胞形態(tài)的影響

各組口腔黏膜上皮細胞在37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12、24、48 h后，倒置顯微鏡下觀察，可見實驗組較對照組細胞遮光性強，細胞貼壁明顯；與其他各組相比，培養(yǎng)48 h時的第3組細胞遮光性明顯增強，且細胞核仁明顯，各組細胞未見明顯的形態(tài)改變。

2.2 細胞凋亡

口腔黏膜上皮細胞培養(yǎng)48 h后，實驗1組、2組、3組及對照組的細胞凋亡率分別為4.63±0.31、2.60±0.26、1.60±0.36、6.60±0.65。統(tǒng)計分析顯示，4組之間的細胞凋亡率均有統(tǒng)計學差異，隨著KGF濃度的增加，細胞凋亡率逐漸降低（P<0.05）。

2.3 Bcl-2 mRNA的表達

不同培養(yǎng)時間各組細胞Bcl-2 mRNA的表達見表2。培養(yǎng)12 h時，實驗1、2組較對照組Bcl-2 mRNA表達無統(tǒng)計學差異，實驗3組Bcl-2 mRNA表達顯著增加（P<0.05）；培養(yǎng)24 h時，3個實驗組較對照組的Bcl-2 mRNA表達均顯著增加（P<0.05），但各實驗組間無統(tǒng)計學差異；培養(yǎng)48 h時，4組之間均有統(tǒng)計學差異，隨著KGF濃度的增加，Bcl-2 mRNA表達逐漸升高（P<0.05）。

2.4 Bax mRNA的表達

不同培養(yǎng)時間各組細胞Bax mRNA的表達見表3。

培養(yǎng)12 h時，實驗1、2組較對照組Bax mRNA表達無統(tǒng)計學差異，實驗3組Bax mRNA表達顯著降低（P<0.05）；培養(yǎng)24、48 h時，4組之間均有統(tǒng)計學差異，隨著KGF濃度的增加，Bax mRNA表達逐漸降低（P<0.05）。

3 討論

KGF主要由間質細胞表達，以旁分泌形式作用于上皮細胞，特異性地刺激上皮細胞增生，而對間質細胞及其他細胞無此作用。近年來發(fā)現(xiàn)：KGF不僅可以促進上皮細胞的增殖和分化，并能抑制上皮細胞的凋亡過程[3-4]。在對肺癌的研究中發(fā)現(xiàn)，KGF通過調節(jié)Bcl-2來抑制細胞的凋亡[5]。一切抑制或促進凋亡的基因對細胞凋亡的影響，最終均歸結為Bax與Bcl-2比值的改變[6]。細胞凋亡是Bcl-2蛋白與Bax蛋白共同作用的結果，Bax蛋白具有一個跨膜位點，Bcl-2的編碼區(qū)含有與Bax蛋白高度同源的BH1和BH2結構域，在該區(qū)Bax可與Bcl-2形成異源二聚體或自身形成同源二聚體，是參與細胞凋亡的主要結構基礎。死亡細胞激活Bax，使Bax由細胞漿轉移到了線粒體膜上。當Bax過表達時，Bax在BH1和BH2結構域形成的同源二聚體增多，使Bcl-2受到了抑制，導致細胞凋亡增加；當Bcl-2過度表達時，其與Bax結合，異源二聚體增多，Bax受到抑制，導致細胞凋亡減少，因此Bcl-2與Bax的比例是細胞死亡的敏感性變阻器[7]。在人正?？谇火つぶ校琄GF mRNA主要表達于間質的部分成纖維細胞，少量表達于血管內皮細胞，且主要表達于胞漿中，呈顆粒狀，而在上皮細胞中無表達[8]。重組人角質細胞生長因子作用于KGF受體，可以產生與內源性KGF相同的生物學活性[9]。研究發(fā)現(xiàn)，未經(jīng)治療的口腔黏膜白斑（oral leukoplakia，OLK）組織中，基底膜上Bcl-2蛋白呈弱陽性表達，經(jīng)維A酸治療后，Bcl-2蛋白無表達。在采用雙盲法治療OLK的研究中，Piattelli等[10]發(fā)現(xiàn)局部使用維A酸后，患者的病損面積減小，口腔病損明顯改善，且病損組織中基底層細胞中未檢測到Bcl-2蛋白的表達。另外一項研究發(fā)現(xiàn)：Bax在OLK未惡變的組織中無高頻率表達。Bcl-2家族在OLK的發(fā)生發(fā)展及治療中發(fā)揮了重要作用。在大鼠輻射復合皮膚損傷模型[11]中，傷口周圍注射攜帶KGF基因的減毒沙門氏菌SPK菌株后，炎癥反應減輕，促進了血管新生和肉芽組織形成，提高了皮膚傷口愈合速率。

課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，KGF mRNA及蛋白在正?？谇火つそM、OLK組及口腔鱗癌組中的表達依次增加，且KGF在OLK上皮組織中的表達主要位于棘細胞層、顆粒層及不全角化層的上皮細胞中，而在基底細胞層的表達較弱；對OLK組織中Bcl-2蛋白的檢測發(fā)現(xiàn)，其表達強于其在正常黏膜組織中的表達。綜合以上研究結果，筆者推測，在口腔黏膜組織疾病的發(fā)生發(fā)展過程中，KGF是否通過調節(jié)凋亡相關基因Bcl-2、Bax的表達來調節(jié)上皮細胞的凋亡過程，從而在口腔黏膜病的發(fā)生及發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用。因此，本實驗采用外源性KGF作用于體外培養(yǎng)的口腔黏膜上皮細胞，觀察不同濃度的KGF對培養(yǎng)的口腔黏膜上皮細胞的形態(tài)學影響，同時檢測KGF對培養(yǎng)的上皮細胞凋亡率的改變及對凋亡相關基因Bcl-2、Bax mRNA表達水平的影響。研究發(fā)現(xiàn)：實驗組較對照組細胞遮光性強，培養(yǎng)48 h時實驗3組的細胞核仁明顯；口腔黏膜上皮細胞的凋亡率隨KGF濃度增加逐漸降低；KGF對凋亡相關基因Bcl-2、Bax mRNA的表達影響，在不同時間段、不同濃度時調控程度不同，12 h時實驗3組Bcl-2 mRNA的表達開始上調；48 h時，KGF對Bcl-2、Bax mRNA的表達調控在各組均出現(xiàn)統(tǒng)計學差異，Bcl-2 mRNA隨KGF濃度增加表達增強，Bax mRNA隨KGF濃度增加表達降低。Bax表達降低，Bcl-2表達增加，使Bax與Bcl-2比值發(fā)生改變，異源二聚體增多，Bax受到抑制，從而抑制細胞凋亡。

本實驗結果提示：KGF可以通過上調Bcl-2和下調Bax的表達，使Bax/Bcl-2比值發(fā)生改變，從而影響口腔黏膜上皮細胞的凋亡。

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（本文編輯 李彩）