劉迪　楊丕山　胡德渝等

[摘要] 目的 在動(dòng)物體內(nèi)檢驗(yàn)鹽酸米諾環(huán)素脂質(zhì)體控釋凝膠的生物相容性及其對(duì)牙周炎動(dòng)物模型的修復(fù)效果。方法 毒性實(shí)驗(yàn)：用質(zhì)量分?jǐn)?shù)2%鹽酸米諾環(huán)素脂質(zhì)體控釋凝膠溶液給SD大鼠灌胃，觀察長(zhǎng)期應(yīng)用該制劑有無(wú)全身不良反應(yīng)及其反應(yīng)程度。牙周炎動(dòng)物模型實(shí)驗(yàn)：將實(shí)驗(yàn)性牙周炎建模成功的SD大鼠分為3 組，A組為派麗奧組，B組為實(shí)驗(yàn)藥物組，C組為陰性對(duì)照組；A、B組每周牙周袋內(nèi)給藥1次，連續(xù)56 d，C組給予生理鹽水；分別在給藥7、14、28、56 d后測(cè)量各組動(dòng)物的牙周探診深度（PD）和牙齦指數(shù)（GI），并進(jìn)行組織學(xué)觀察，計(jì)算單核細(xì)胞和破骨細(xì)胞的數(shù)目。結(jié)果 鹽酸米諾環(huán)素脂質(zhì)體控釋凝膠具有良好的生物相容性；給藥14 d后，PD、GI，以及單核細(xì)胞和破骨細(xì)胞數(shù)目均較其他兩組明顯降低，組織學(xué)觀察可見(jiàn)新骨及部分新纖維形成。結(jié)論 牙周袋內(nèi)使用鹽酸米諾環(huán)素脂質(zhì)體控釋凝膠可減輕牙周炎癥，提示該制劑對(duì)改善牙周炎有一定的療效，具有臨床應(yīng)用前景。

[關(guān)鍵詞] 脂質(zhì)體； 鹽酸米諾環(huán)素； 實(shí)驗(yàn)性牙周炎； 動(dòng)物模型

[中圖分類(lèi)號(hào)] R 781.4 [文獻(xiàn)標(biāo)志碼] A [doi] 10.7518/hxkq.2013.06.012

四環(huán)素族藥物是治療牙周病的代表藥物。治療牙周病時(shí)，如果采用全身用藥，具有給藥劑量大，易產(chǎn)生耐藥性等缺點(diǎn)，且局部療效并不令人滿意；隨著小劑量四環(huán)素類(lèi)藥物具有調(diào)節(jié)宿主免疫反應(yīng)這一新的作用機(jī)制的發(fā)現(xiàn)，各國(guó)學(xué)者都在積極探索新的給藥方法或進(jìn)行新劑型的開(kāi)發(fā)，已經(jīng)取得了較大的進(jìn)展。

四環(huán)素類(lèi)藥物局部給藥的重要進(jìn)展是控、緩釋劑型的應(yīng)用，如四環(huán)素纖維棒、多西環(huán)素凝膠、米諾環(huán)素微球等。這種劑型的優(yōu)點(diǎn)是置入牙周袋內(nèi)后，藥物能緩慢持久地釋放，從而達(dá)到持續(xù)抗菌和有效改善牙周組織的作用，且某些緩釋材料可被局部組織吸收，使用方便；可減少給藥次數(shù)，平均每周給藥1次，提高患者的依從性[1]。任蕾等[2]的研究顯示，米諾環(huán)素對(duì)牙周主要致病菌的抑菌效果較好，其抗菌譜較其他藥物更為理想，可作為牙周炎急性發(fā)作時(shí)的首選藥物。

脂質(zhì)體作為一種藥物載體，其組成和結(jié)構(gòu)與細(xì)胞膜十分相似，滲透力強(qiáng)，能穿透上皮屏障，對(duì)網(wǎng)織內(nèi)皮系統(tǒng)具有趨向性，易被吞噬細(xì)胞攝取而實(shí)現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)給藥，提高了藥物的生物利用度，減少了給藥劑量，可以減輕甚至避免藥物的不良反應(yīng)[3]。本研究通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)檢驗(yàn)一種新型鹽酸米諾環(huán)素脂質(zhì)體控釋凝膠的生物相容性及其對(duì)動(dòng)物牙周損傷模型修復(fù)的效果，為其在牙周病治療中的應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)設(shè)備和材料

無(wú)齲壞及牙周病的5周齡SD大鼠（四川大學(xué)華西動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心）；牙齦卟啉單胞菌ATCC 33277（四川大學(xué)口腔疾病研究國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室）；質(zhì)量分?jǐn)?shù)2%（每克含20 mg鹽酸米諾環(huán)素脂質(zhì)體）鹽酸米諾環(huán)素脂質(zhì)體控釋凝膠（四川大學(xué)華西藥學(xué)院藥劑學(xué)實(shí)驗(yàn)室）；2%（每克含20 mg鹽酸米諾環(huán)素）鹽酸米諾環(huán)素軟膏派麗奧。

1.2 鹽酸米諾環(huán)素脂質(zhì)體控釋凝膠對(duì)大鼠的全身毒

性實(shí)驗(yàn)

健康SD大鼠20只，實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組各10只，雌雄各半。實(shí)驗(yàn)組：2%鹽酸米諾環(huán)素脂質(zhì)體控釋凝膠用雙蒸水配制成2%樣品水溶液；對(duì)照組：雙蒸水；以每天5 mL·kg-1的劑量連續(xù)灌胃，30 d后觀察2組大鼠的體重變化及臨床毒性體征。將灌胃大鼠的肝臟、腎臟組織取出，觀察組織病理學(xué)變化，評(píng)價(jià)其組織相容性。

1.3 鹽酸米諾環(huán)素脂質(zhì)體控釋凝膠對(duì)大鼠實(shí)驗(yàn)性牙

周炎的影響

1.3.1 大鼠實(shí)驗(yàn)性牙周炎模型的建立 選擇雌性SD大鼠建立牙周炎動(dòng)物模型。以10%水合氯醛溶液行腹腔注射麻醉，然后用直徑0.2 mm正畸鋼絲在左上頜第一磨牙靠近牙齦根方做牙頸部結(jié)扎1周，在腭側(cè)近中打結(jié)，結(jié)扎后在齦溝內(nèi)接種牙齦卟啉單胞菌ATCC 33277，配10%葡萄糖水喂食[4]。建模后21 d測(cè)量牙周探診深度（probing depth，PD）、牙齦指數(shù)（gingival index，GI），制作左上頜第一磨牙及牙周組織切片，通過(guò)蘇木精-伊紅（hematine-eosin，HE）染色法處理后，光學(xué)顯微鏡下觀察牙周組織的病理學(xué)變化。

1.3.2 實(shí)驗(yàn)分組及檢測(cè)方法 建模成功的78只大鼠，體重（172.5±10.2）g，將其中的72只大鼠（另外6只因操作不當(dāng)不適于進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)而被排除）按GI、PD值均衡分成3組，給予不同的藥物治療：A組為陽(yáng)性對(duì)照組，使用派麗奧；B組為實(shí)驗(yàn)組，使用2%鹽酸米諾環(huán)素脂質(zhì)體控釋凝膠；C組為陰性對(duì)照組，使用0.9%生理鹽水。每組有24只大鼠，分別觀察7、14、28、56 d，每個(gè)時(shí)間段每組檢查6只大鼠，檢測(cè)牙位為左上頜第一磨牙。每組每周牙周袋內(nèi)給藥1次，用藥前用探針機(jī)械清理牙面，將藥物注入牙周袋內(nèi)。分別在給藥7、14、28、56 d后測(cè)量每只動(dòng)物左上頜第一磨牙的PD和GI，每組分別處死6只動(dòng)物進(jìn)行單核細(xì)胞和破骨細(xì)胞計(jì)數(shù)，并行組織學(xué)觀察。

2 結(jié)果

2.1 鹽酸米諾環(huán)素脂質(zhì)體控釋凝膠的全身毒性

連續(xù)灌胃30 d后，對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組的體重相對(duì)增長(zhǎng)率分別為27%和29%，2組的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。實(shí)驗(yàn)組大鼠的肝臟、腎臟組織切片正常，未發(fā)現(xiàn)結(jié)構(gòu)破壞和毒性物質(zhì)沉積，提示該藥物在機(jī)體內(nèi)無(wú)毒性作用。

2.2 建模效果評(píng)價(jià)

建模21 d，分別觀察78只大鼠左上頜第一磨牙，共計(jì)78顆牙。肉眼觀察可見(jiàn)：牙齦紅腫，第一、二磨牙間牙齦乳頭紅腫。GI分級(jí)平均為3，探及牙周袋；PD均值為1.59 mm。處死6只大鼠，觀察牙周組織的病理學(xué)變化，結(jié)果見(jiàn)圖 1：牙齦組織有大量單核細(xì)胞浸潤(rùn)，結(jié)合上皮根向增殖，形成牙周袋；牙周袋內(nèi)上皮糜爛，可見(jiàn)細(xì)菌團(tuán)塊；牙周纖維有大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，細(xì)胞變性水腫，纖維排列紊亂，甚至斷裂；有較多破骨細(xì)胞及吸收陷窩，牙槽嵴頂有明顯吸收。

2.3 GI和PD測(cè)量結(jié)果

不同觀察時(shí)間3組大鼠左上頜第一磨牙GI和PD的測(cè)量結(jié)果見(jiàn)表1。給藥7 d時(shí)，A、B組大鼠左上頜第一磨牙的GI與基線相比較均降低，B組較A組更為明顯；A、B組的PD與基線相比，其差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。給藥14 d時(shí)，與C組比較，A、B組的GI均有明顯降低；A組和C組PD的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而B(niǎo)組的PD明顯低于A、C組（P<0.05）。給藥28 d和56 d時(shí)，A、B組的GI、PD均有明顯降低，2組PD均明顯低于C組（P<0.05），其中B組的PD降低更明顯，與A組比較其差異亦有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。

2.4 組織學(xué)觀察結(jié)果

2.4.1 單核細(xì)胞和破骨細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果 選擇包埋較好的3個(gè)蠟塊，每個(gè)蠟塊選取1張包含3個(gè)磨牙在內(nèi)的組織切片，在顯微鏡下連續(xù)攝取4張矩形數(shù)碼照片，手工選出單核細(xì)胞及破骨細(xì)胞并計(jì)數(shù)，其結(jié)果見(jiàn)表2。給藥7 d時(shí)，A、B組單核細(xì)胞和破骨細(xì)胞數(shù)目與C組相比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），A、B組間也無(wú)明顯差別（P>0.05）。給藥14、28、56 d時(shí)，A、B組單核細(xì)胞和破骨細(xì)胞數(shù)量均明顯低于C組（P<

0.05），B組單核細(xì)胞和破骨細(xì)胞數(shù)量減少得更明顯，與A組比較也有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P<0.05）。

2.4.2 組織學(xué)觀察結(jié)果 3組牙齒的組織學(xué)觀察結(jié)果見(jiàn)圖2。給藥7 d時(shí)，A、B組牙周纖維可見(jiàn)炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，有少量破骨細(xì)胞，牙槽骨未見(jiàn)明顯吸收；C組有大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，破骨細(xì)胞活躍。給藥14、28 d時(shí)，A組結(jié)合上皮的位置向冠方移動(dòng)，未見(jiàn)新纖維形成；B組結(jié)合上皮的位置向冠方移動(dòng)，可見(jiàn)少量新纖維生成，未見(jiàn)新骨形成；C組結(jié)合上皮內(nèi)有大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，繼續(xù)向根方增殖，牙槽嵴頂吸收至根尖1/3。給藥56 d時(shí)，A組可見(jiàn)新纖維形成，未見(jiàn)明顯的新骨形成；B組可見(jiàn)大量新纖維形成，并有新生牙槽骨組織形成；C組牙周纖維排列紊亂、有斷裂，牙槽嵴頂繼續(xù)向根方吸收。

3 討論

牙周疾病是危害人類(lèi)牙齒和全身健康的主要口腔疾病。四環(huán)素類(lèi)藥物能夠調(diào)節(jié)宿主免疫反應(yīng)，有效改善各項(xiàng)牙周指數(shù)，提高牙周炎治療的成功率。應(yīng)用脂質(zhì)體作為藥物載體，可使藥物更具滲透力，實(shí)現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)給藥，提高藥物的生物利用度。

采用本課題組研制的鹽酸米諾環(huán)素脂質(zhì)體控釋凝膠新制劑水溶液給SD大鼠灌胃，發(fā)現(xiàn)該制劑對(duì)大鼠體重的增長(zhǎng)無(wú)明顯影響，肝臟、腎臟組織切片正常，未發(fā)現(xiàn)組織細(xì)胞結(jié)構(gòu)破壞和毒性物質(zhì)沉積，提示該制劑在機(jī)體內(nèi)無(wú)長(zhǎng)期毒性作用，具有較好的組織相容性和安全性，初步顯示了良好的應(yīng)用前景。為了進(jìn)一步驗(yàn)證鹽酸米諾環(huán)素脂質(zhì)體控釋凝膠臨床應(yīng)用的可行性，本實(shí)驗(yàn)建立了SD 大鼠牙周炎動(dòng)物模型進(jìn)行研究。牙齦的炎癥和牙周袋形成是牙周炎最重要的病理改變。GI可以反映牙齦炎癥的程度，而PD是牙周病最重要的檢查方法，本實(shí)驗(yàn)中采用GI和PD以及組織學(xué)觀察共同評(píng)價(jià)藥物的作用效果。鹽酸米諾環(huán)素可通過(guò)與膠原酶活化所必須的金屬陽(yáng)離子Ca2+、Zn2+螯合來(lái)抑制中性粒細(xì)胞，并可誘導(dǎo)成熟破骨細(xì)胞的凋亡，抑制破骨細(xì)胞的生成，還可增強(qiáng)Ⅰ型膠原纖維的合成，穩(wěn)定膠原基質(zhì)為成骨細(xì)胞的分化提供重要場(chǎng)所，促進(jìn)成骨[5-7]。通過(guò)組織病理切片觀察單核細(xì)胞及破骨細(xì)胞的數(shù)量變化判定炎癥轉(zhuǎn)歸，以及牙槽嵴改建情況是非?？煽康姆椒?，這樣得到的實(shí)驗(yàn)結(jié)果可信度高。

抑菌作用是鹽酸米諾環(huán)素在牙周炎治療中發(fā)揮的主要作用之一。以往的研究[8]發(fā)現(xiàn)，鹽酸米諾環(huán)素對(duì)一系列牙周致病菌包牙齦擬桿菌、中間普雷沃菌、嚙蝕艾肯菌、具核梭桿菌的90%最小抑菌濃度分別為0.1、0.39、0.39、0.78 ?g·mL-1。鹽酸米諾環(huán)素脂質(zhì)體控釋凝膠的有效藥物質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%，可充分發(fā)揮其抑菌作用。本實(shí)驗(yàn)中，陽(yáng)性對(duì)照組選擇2%鹽酸米諾環(huán)素軟膏派麗奧，是目前已經(jīng)廣泛應(yīng)用于臨床的緩釋抗菌藥物[9-10]。緩釋制劑的特點(diǎn)是能提高牙周袋內(nèi)鹽酸米諾環(huán)素的濃度，但藥物釋放速度不恒定，通常在其置入袋內(nèi)2～3 d內(nèi)釋放出80%～90%的鹽酸米諾環(huán)素，隨后釋放速度變慢，藥物濃度明顯下降，牙周袋內(nèi)藥物濃度波動(dòng)較大[8]。在鹽酸米諾環(huán)素控釋脂質(zhì)體前期對(duì)巨噬細(xì)胞作用的研究[11]中發(fā)現(xiàn)，該藥物與派麗奧比較能夠勻速釋放藥物，恒定持續(xù)地抑制腫瘤壞死因子α的產(chǎn)生，發(fā)揮控釋作用；而派麗奧則通過(guò)波動(dòng)性持續(xù)抑制而發(fā)揮緩釋作用。本藥物的控釋作用可使鹽酸米諾環(huán)素在預(yù)定時(shí)間內(nèi)自動(dòng)按某一速度從劑型中以恒定的速度釋放于牙周袋內(nèi)，使牙周袋內(nèi)的藥物濃度在較長(zhǎng)時(shí)間內(nèi)恒定地維持在有效范圍內(nèi)，延長(zhǎng)有效作用時(shí)間[12]。脂質(zhì)體具有控釋作用主要是由于其提供了外源性雙層膜，使角質(zhì)層細(xì)胞間結(jié)構(gòu)改變，脂質(zhì)雙分子層疏水性尾部排列紊亂，藥物可通過(guò)擴(kuò)散和毛細(xì)管作用進(jìn)入細(xì)胞間隙，使角質(zhì)層濕化和水合作用增強(qiáng)；脂質(zhì)體磷脂與角質(zhì)層脂質(zhì)融合后，被細(xì)胞內(nèi)的溶酶體所破壞，使藥物勻速釋放[13]。

本研究中，給藥7 d后，A、B組各項(xiàng)指標(biāo)僅略微下降，與C組相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），這可能是因?yàn)榇笫笱乐芷茐膰?yán)重，給藥時(shí)間短，已破壞的牙周組織還未完全修復(fù)所致。實(shí)驗(yàn)期內(nèi)，實(shí)驗(yàn)藥物組（B組）牙周炎開(kāi)始改善的時(shí)間早于A組，在已經(jīng)觀察的2個(gè)月內(nèi)，實(shí)驗(yàn)藥物顯示出更好的抗炎作用，這跟兩組藥物劑型不同有關(guān)。脂質(zhì)體由磷脂雙分子層包覆水相囊泡構(gòu)成，生物相容性好，對(duì)所載藥物有廣泛的適應(yīng)性，水溶性藥物載入內(nèi)水相，脂溶性藥物溶于脂膜內(nèi)，兩親性藥物可插于脂膜上[14]；磷脂本身是細(xì)胞膜成分，注入體內(nèi)無(wú)毒，生物利用度高，且不引起免疫反應(yīng)；脂質(zhì)體還能保護(hù)所載的藥物，防止體液對(duì)藥物的稀釋和被體內(nèi)的酶分解破壞[15]。本研究證明，2%鹽酸米諾環(huán)素脂質(zhì)體控釋凝膠改善大鼠實(shí)驗(yàn)性牙周炎的效果優(yōu)于派麗奧。

本研究結(jié)果提示：鹽酸米諾環(huán)素脂質(zhì)體控釋凝膠能夠改善牙周組織病變，抑制單核細(xì)胞和破骨細(xì)胞數(shù)量的增加，改善牙齦炎癥和牙周袋深度，并可促進(jìn)新牙周纖維及新骨的生成；這為該凝膠治療牙周病提供了初步的實(shí)驗(yàn)依據(jù)，也證明其具有臨床應(yīng)用前景。

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（本文編輯 吳愛(ài)華）