郭 芹， 李慶鵬， 靳 婧， 李偉明， 哈益明

中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所， 農(nóng)業(yè)部農(nóng)產(chǎn)品加工重點實驗室， 北京 100193

抗氰呼吸與果蔬的總呼吸、品質(zhì)劣變、成熟衰老、貯藏壽命、采后生理性病害、采后處理和貯藏技術(shù)密切相關(guān)，其末端氧化酶，即交替氧化酶(alternative oxidase，AOX)，在果蔬生長發(fā)育過程及果蔬對外界刺激的響應(yīng)過程發(fā)揮重要作用，而這些作用又與AOX本身的生理結(jié)構(gòu)有著密切的聯(lián)系[1]。AOX最初是在天南星科植物佛焰花序開花的產(chǎn)熱現(xiàn)象中被發(fā)現(xiàn)，新的研究認(rèn)為抗氰呼吸途徑存在于除細(xì)菌外的整個生物界中，包括真菌、藻類和酵母等[2,3]。在果蔬中，線粒體電子傳遞鏈主要有細(xì)胞色素主路和抗氰交替支路兩條途徑[3,4]，其中抗氰呼吸途徑(交替途徑)是以交替氧化酶為末端氧化酶的氰不敏感電子傳遞鏈途徑，從線粒體內(nèi)膜電子傳遞鏈的主呼吸途徑的泛醌(ubiquinone，UQ)處分支，電子不進行跨膜運輸直接傳遞到末端氧化酶，并催化分子氧還原成水，與電子傳遞鏈主路途徑中的復(fù)合體CⅠ、復(fù)合體CⅢ和復(fù)合體CⅣ不同，不產(chǎn)生質(zhì)子電化學(xué)勢能，不能驅(qū)動ATP的合成，只能產(chǎn)生少量的能量(圖1)[5,6]。目前，果蔬抗氰呼吸的調(diào)空機理以及外界脅迫下果蔬交替氧化酶運行的生理學(xué)意義已成為果蔬采后成熟衰老領(lǐng)域的研究熱點。近年來，隨著抗氰呼吸之謎的逐步解開，現(xiàn)對抗氰呼吸運行和功能的了解也越來越多。本文主要是將近年來國內(nèi)外關(guān)于抗氰呼吸末端交替氧化酶的結(jié)構(gòu)、生理功能、抗氰呼吸的運行機制及其在果蔬中研究現(xiàn)狀加以綜述，以期得出對抗氰呼吸在果蔬中的研究有新的認(rèn)識，同時對采取有效方法延緩果蔬成熟、延長貨架期等均具有重要的意義。

圖1 抗氰呼吸途徑在植物線粒體電子傳遞鏈途徑的代謝[4]Fig.1 Cyanide-resistant respiration pathway in plant mitochondrial electron transport chain metabolism[4].AOX：交替氧化酶；CⅠ：NADH-泛醌氧化還原酶；CⅡ：琥珀酸-泛醌氧化還原酶；CⅢ：泛醌-細(xì)胞色素C氧化還原酶；CⅣ：細(xì)胞色素C氧化酶；UQ：泛醌庫

1 AOX的結(jié)構(gòu)及編碼基因

1995年，Siedow等[7]首先提出了AOX蛋白在膜上的結(jié)構(gòu)模型，認(rèn)為AOX是一種膜整合蛋白，有2個跨膜的α-螺旋鑲嵌在線粒體內(nèi)膜，其活性位點包含一個不含血紅素的雙鐵中心[3]。修正模型認(rèn)為AOX是一種膜間蛋白，具有雙鐵活性中心，它的活性位點在長螺旋柱上，但不存在跨膜螺旋結(jié)構(gòu)，不是跨膜蛋白[1]。后來的研究以AOX與核苷酸還原酶(RNR)R2型雙鐵蛋白具有相似的結(jié)構(gòu)和催化作用，提出了AOX的泛醌結(jié)合位點的結(jié)構(gòu)，認(rèn)為AOX是雙鐵羧基蛋白家族中的一員[4]。目前新觀點認(rèn)為AOX是一種定位于線粒體內(nèi)膜中的雙鐵羧基蛋白，所有的雙鐵蛋白都是由4個螺旋束組成，其中第1和第4個螺旋均包含一個保守的E-X-X-H單元，形成了雙鐵中心，并且這些雙鐵蛋白還能夠激活分子氧[1]。隨著對AOX研究的逐步深入，人們對其結(jié)構(gòu)模型的建立有了一個新的認(rèn)識，但在線粒體膜間蛋白的雙鐵中心，AOX的具體存在形式以及作用方式還需要大量的實驗證明。

AOX在果蔬中是由核基因編碼的多基因家族，分為兩個亞家族，AOX1和AOX2，編碼蛋白分子質(zhì)量在32～39 kDa之間，一般都具有4個外顯子和3個內(nèi)含子。單子葉和雙子葉植物中都有AOX1家族，但AOX2家族僅存在于雙子葉植物[3]。研究表明，胡蘿卜有4個不同的AOX基因，分別為AOX1基因家族的AOX1a、AOX1b和AOX2基因家族的AOX2a、AOX2b基因，它們在胡蘿卜的生長發(fā)育過程都表達[8]；番茄AOX1a和AOX1b基因在根、葉和果實中表達，而AOX1c基因只在根中表達[2]；荔枝AOX1在根和葉中表達量高，在莖中表達較弱，在果實中表達弱[9]；西瓜AOX2在生長發(fā)育的各個過程都表達，且在果實中表達量較高[10]。葡萄的AOX1a在果實和根中表達，AOX1b在花期表達，AOX2在整個生長發(fā)育過程都表達[11]。這些結(jié)果表明AOX基因隨著果蔬的生長發(fā)育而差異性表達，但在不同果蔬中的數(shù)目、序列信息及功能等還有待進一步研究。

2 AOX的生理功能

AOX在果蔬體內(nèi)可以通過改變自身結(jié)構(gòu)來主動調(diào)節(jié)抗氰呼吸和總呼吸的運行，進一步調(diào)控果蔬細(xì)胞的能量代謝和生理功能，以適應(yīng)外界環(huán)境的改變。早期發(fā)現(xiàn)AOX在天南星科植物佛焰花序開花時能產(chǎn)生大量熱，使花期產(chǎn)生的芳香物質(zhì)快速散發(fā)，從而吸引喜熱的昆蟲前來傳粉[3,6,12]。而在非產(chǎn)熱組織中，AOX的功能以“溢流”假說得到廣泛接受，即當(dāng)主呼吸鏈活性受到抑制或細(xì)胞內(nèi)還原力水平偏高時，電子通過AOX的傳遞可使三羧酸循環(huán)和糖酵解繼續(xù)進行[1,3]。Considine等[13]發(fā)現(xiàn)AOX在采后芒果的呼吸躍變和衰老過程起重要作用，AOX基因和蛋白的表達量隨著芒果的成熟逐漸增加，尤其是呼吸越變后大量表達。研究也發(fā)現(xiàn)抑制AOX基因表達可導(dǎo)致線粒體活性氧的大量積累，活性氧的積累能誘導(dǎo)細(xì)胞的迅速死亡；而過表達AOX基因則可以減少番茄果實貯藏過程活性氧的產(chǎn)生，降低由氧化傷害引起的細(xì)胞凋亡，可能是AOX能有效促使分子氧與還原醌相互作用生成水從而減少活性氧的生成量[14]。

也有研究表明，AOX途徑的加強可以將超過細(xì)胞需求的底物消耗掉，通過調(diào)控ATP的合成來維持能荷的穩(wěn)定和電子傳遞鏈的正常運行，使果蔬在不同環(huán)境脅迫下穩(wěn)定生長[15,16]。當(dāng)外界脅迫引起細(xì)胞內(nèi)氧壓升高，AOX就會參與形成抗氧化防御體系，保護果蔬細(xì)胞免受氧化損傷，維持正常的能量代謝，提高自身抵御逆境的能力[3]。這些研究都表明，AOX在果蔬生長發(fā)育過程具有清除活性氧、抑制細(xì)胞凋亡、穩(wěn)定生長發(fā)育和增加抵御能力等功能，但其運行的信號調(diào)節(jié)機制和生理學(xué)意義尚不清楚。此外，AOX還與光合作用有關(guān)，強光能降低AOX基因的表達，誘導(dǎo)NAD(P)H的表達，因此調(diào)節(jié)抗氰呼吸途徑運行使光合電子傳遞保持一個較高的水平，能減少脅迫環(huán)境對光系統(tǒng)的損傷，也有利于維持光合代謝的正常運行[15]。因此，了解AOX生理功能，解開AOX與其他物質(zhì)之間的相互作用關(guān)系,闡明它們與果熟成熟衰老的作用機制將是今后研究的重點。

3 抗氰呼吸的運行機制

抗氰呼吸與果蔬的種類、生理過程及功能等密切相關(guān)，在果蔬體內(nèi)的實際運行程度也有很大差異。果蔬體內(nèi)關(guān)于AOX蛋白的調(diào)節(jié)也較為復(fù)雜，諸多因素都可能在各種水平上調(diào)節(jié)抗氰呼吸。除了研究已證明的AOX蛋白的還原狀態(tài)和泛醌庫的還原程度外，近年的研究又發(fā)現(xiàn)了對氧化還原狀態(tài)敏感的巰基/二硫鍵系統(tǒng)的調(diào)節(jié)機制[4,15]，該機制認(rèn)為AOX在果蔬體內(nèi)是單體以二硫鍵連接，形成同型二聚體形式存在，稱為氧化態(tài)AOX(非活性或低活性狀態(tài))，而單體則被認(rèn)為是還原態(tài)AOX(活性或高活性狀態(tài))。果蔬體內(nèi)氧化態(tài)和還原態(tài)之間的相互轉(zhuǎn)化為抗氰呼吸的運行提供了一種快捷的調(diào)控機制。然而對于AOX二硫鍵氧化態(tài)與還原態(tài)在組織體內(nèi)相互轉(zhuǎn)變的運行機制有待研究。

第二種調(diào)節(jié)機制是α-酮酸(尤其是丙酮酸)對AOX活性的刺激[12,14], 這種作用獨立于丙酮酸代謝，直接作用于AOX蛋白，使AOX的構(gòu)象發(fā)生變化而導(dǎo)致活性增加。Carré等[17]用純化的AOX與丙酮酸反應(yīng)也證明了這一觀點，并指出只有在丙酮酸存在的條件下，AOX的活性才能保持穩(wěn)定。

還有研究提出了控制泛醌處流量的調(diào)節(jié)機制。主要通過兩條途徑：一是改變AOX蛋白的數(shù)量來控制從泛醌處溢流到交替途徑的流量，從而進行粗略調(diào)節(jié)，而還原泛醌的水平則反應(yīng)AOX的表達情況；二是通過AOX活性的改變來調(diào)控泛醌庫的氧化還原的平衡、AOX分子內(nèi)二硫鍵的狀態(tài)、激活劑的濃度等因子，從而進行精確調(diào)控。然而AOX活性的調(diào)控相當(dāng)復(fù)雜，因此AOX在不同果蔬中具體的運行調(diào)節(jié)機制仍有待研究。

4 抗氰呼吸對果蔬成熟衰老的作用

在果實呼吸躍變時，以抗氰呼吸為主，躍變過后主要以細(xì)胞色素途徑為主，成熟衰老期間伴隨著總呼吸的加強。抗氰呼吸途徑在果實衰老初期升高，在很多果實切片陳化后發(fā)生的誘導(dǎo)呼吸中也占了很大比例，降低抗氰呼吸途徑所占比例，能降低總呼吸強度，從而延緩果實的衰老。

研究發(fā)現(xiàn)[2,6,18]，抗氰呼吸所占比例與荔枝果實成熟度有關(guān)，未熟荔枝果實中的抗氰呼吸比半熟果和成熟果的高;進入躍變期的蘋果的呼吸作用發(fā)生了由細(xì)胞色素途徑向抗氰呼吸途徑轉(zhuǎn)變的現(xiàn)象;鴨梨、黃冠梨的衰老也與抗氰呼吸所占比例有關(guān)。

對番茄果實的研究發(fā)現(xiàn)，果實對乙烯信號的響應(yīng)并發(fā)生呼吸躍變是由于存在抗氰呼吸，抑制番茄的抗氰呼吸可降低乙烯合成基因及受體基因的表達量，延緩果實的呼吸躍變和成熟衰老[19]。Guo等[20]也發(fā)現(xiàn)抑制抗氰呼吸和AOX基因的表達量，乙烯釋放量和乙烯合成基因的表達量會降低。相反，誘導(dǎo)抗氰呼吸能提高黃瓜葉片耐寒性，辣椒抗高溫和抗旱能力。這些結(jié)果表明AOX參與果實的呼吸躍變和果實的成熟衰老，同時可能還存在其他物質(zhì)與呼吸躍變和果實成熟有關(guān)，如解偶聯(lián)蛋白，與AOX互補共同調(diào)節(jié)呼吸躍變和果實成熟[3]。在采后果實貯藏過程，各種生物和非生物脅迫都可以誘導(dǎo)AOX表達，如：低溫、水楊酸、H2O2、機械傷等，但從分子水平研究以AOX為中心的抗氰呼吸調(diào)控網(wǎng)絡(luò)及它們與果實成熟衰老的關(guān)系，對于采取有效措施調(diào)控果實的成熟衰老具有重要意義。

5 問題與展望

目前對抗氰呼吸途徑AOX結(jié)構(gòu)、生理功能、運行機制以及對果蔬成熟衰老作用方面的研究雖然已經(jīng)取得了一定的成果，特別是已在果蔬中發(fā)現(xiàn)了編碼AOX的基因，使抗氰呼吸在果蔬中的研究進入了分子水平，但還存在許多問題亟待解決，例如果蔬中關(guān)于抗氰呼吸相關(guān)基因的序列信息、數(shù)目、表達特性等問題的研究，抗氰呼吸基因表達與貯藏過程細(xì)胞代謝之間的相互影響尚不清楚，尤其是與調(diào)控果蔬生長及貯藏的氧化還原信號途徑及脅迫應(yīng)答之間的關(guān)聯(lián)，這些問題的研究將有助于闡明抗氰呼吸的在果蔬細(xì)胞內(nèi)的調(diào)控路徑，也為進一步研究脅迫環(huán)境下果蔬的適應(yīng)性調(diào)節(jié)奠定了基礎(chǔ)。已有的研究雖然已經(jīng)打破了AOX在果蔬體內(nèi)只是被動調(diào)節(jié)呼吸鏈電子傳遞的認(rèn)識，但AOX如何在果蔬體內(nèi)主動地調(diào)節(jié)細(xì)胞與能量代謝之間的平衡使果蔬在逆境脅迫下正常發(fā)育還不明確。此外，研究已發(fā)現(xiàn)乙烯生成與AOX的調(diào)節(jié)有關(guān)，但AOX在乙烯合成路徑的作用位點以及乙烯對AOX結(jié)構(gòu)、生理功能及信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的影響也是需要進一步研究的問題。隨著抗氰呼吸途徑末端氧化酶AOX新的研究方向的開展，將有助于闡明它在果蔬體內(nèi)更多的生理功能，以拓展人們對AOX這一功能蛋白的認(rèn)識，也有利于明確以AOX為中心抗氰呼吸的作用網(wǎng)絡(luò)，對采取有效方法調(diào)控果蔬的呼吸代謝具有重要意義，同時也為果蔬的高效、低碳貯運保鮮奠定理論基礎(chǔ)。

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