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(大連醫(yī)科大學(xué) 1.七年制2008級(jí)；2.七年制2007級(jí)；3.解剖學(xué)教研室；4.七年制2009級(jí)；5.生理學(xué)教研室，遼寧 大連 116044)

基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)

人參皂甙對(duì)腎衰大鼠藍(lán)斑nNOS表達(dá)變化的影響

馬笑1，李光毅2，范凱3，趙承天1，崔雨萌4，趙楠4，徐茵4，黃姍4，付聚紅4，姜春玲5

(大連醫(yī)科大學(xué) 1.七年制2008級(jí)；2.七年制2007級(jí)；3.解剖學(xué)教研室；4.七年制2009級(jí)；5.生理學(xué)教研室，遼寧 大連 116044)

目的探討人參皂甙(GS)對(duì)急性腎衰(ARF)大鼠藍(lán)斑神經(jīng)元型一氧化氮合酶(nNOS)表達(dá)變化的影響。方法選用健康雄性SD大鼠64只，隨機(jī)分為4組：ARF+生理鹽水(NS)組、ARF+GS組、NS+NS組和NS+GS組，每組16只。采用甘油致急性腎衰動(dòng)物模型，利用整體實(shí)驗(yàn)觀察ARF大鼠口服GS(12.5 mg/mL)48 h后血清尿素氮(BUN)、肌酐(Cre)和腎皮質(zhì)勻漿超氧化物歧化酶(SOD)的變化；利用免疫組化方法觀察藍(lán)斑nNOS免疫反應(yīng)活性的變化。結(jié)果ARF+NS組血清BUN和Cre水平顯著升高(P<0.05)，腎小管壞死程度嚴(yán)重，腎皮質(zhì)勻漿SOD水平顯著降低(P<0.05)；與ARF+NS組相比，ARF+GS組血清BUN和Cre水平顯著下降(P<0.05)，腎小管壞死程度明顯減輕，腎皮質(zhì)勻漿SOD水平顯著升高(76.60±1.77 vs 43.57±2.09)U/mgprot(P<0.05)。免疫組化實(shí)驗(yàn)顯示：與NS+NS組相比，ARF+NS組藍(lán)斑nNOS免疫反應(yīng)陽性神經(jīng)元數(shù)目(24.3±3.77 vs 41.5±3.32)及染色強(qiáng)度平均光密度(0.26±0.07 vs 0.50±0.09)顯著降低(P<0.05)；與ARF+NS組相比，ARF+GS組藍(lán)斑nNOS免疫反應(yīng)陽性神經(jīng)元數(shù)目(53.8±4.86 vs 24.3±3.77)顯著增多，染色強(qiáng)度平均光密度(0.45±0.07 vs 0.26±0.07)顯著增強(qiáng)(P<0.05)，且高于NS+NS組 (P<0.05)。結(jié)論口服GS使ARF大鼠的腎功能顯著改善，增強(qiáng)腎組織抗氧化損傷的能力，具有腎保護(hù)作用。同時(shí)使ARF大鼠藍(lán)斑一氧化氮能神經(jīng)元活性增強(qiáng)。

急性腎功能衰竭；人參皂甙；藍(lán)斑；神經(jīng)元型一氧化氮合酶

急性腎功能衰竭(acute renal failure, ARF)是以急性腎小管壞死為特征的臨床危重病癥，其發(fā)病率每年呈上升趨勢(shì)，死亡率極高。人參皂甙(ginsenoside,GS)是人參的主要藥理活性成分，具有多種生物活性。有文獻(xiàn)報(bào)告口服GS對(duì)糖尿病大鼠腎損傷有保護(hù)作用[1]，另有報(bào)告高血壓腎衰大鼠藍(lán)斑(locus coeruleus，LC)去甲腎上腺素水平顯著增加，神經(jīng)元型一氧化氮合酶(neuronal nitric oxide synthase, nNOS)mRNA表達(dá)明顯下降[2]，提示高血壓腎衰大鼠藍(lán)斑一氧化氮能神經(jīng)元活性降低。本研究組前期研究證實(shí)口服GS可明顯增加ARF大鼠藍(lán)斑酪氨酸羥化酶(tyrosine hydroxylase，TH)的表達(dá)[3]，但甘油致ARF大鼠的模型中，藍(lán)斑的一氧化氮能神經(jīng)元活性是否發(fā)生變化以及ARF大鼠口服GS處置后對(duì)藍(lán)斑的一氧化氮能神經(jīng)元活性有何影響，迄今為止均未見報(bào)告。本研究利用整體實(shí)驗(yàn)和免疫組化方法, 在ARF大鼠口服GS 48 h后, 觀察血清肌酐(Cre)和尿素氮(BUN)水平的變化；腎皮質(zhì)勻漿超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)變化；腎小管壞死程度的變化；藍(lán)斑nNOS免疫反應(yīng)活性變化，旨在探討口服人參皂甙對(duì)急性腎衰大鼠藍(lán)斑nNOS表達(dá)變化的影響。

1 材料和方法

1.1 動(dòng)物分組

選用健康雄性SD大鼠64只，體重180～220 g，由大連醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。室溫飼養(yǎng)，自由進(jìn)食飲水，自然晝夜。

動(dòng)物隨機(jī)均分為4組，每組16只，即實(shí)驗(yàn)給藥組(ARF+GS組)、實(shí)驗(yàn)對(duì)照組(ARF+NS組)、空白對(duì)照組(NS+NS組)和空白給藥組(NS+GS組)，各組動(dòng)物分別給予以下處理：(1)ARF+GS組和ARF+NS組：一側(cè)后肢肌肉注射50%甘油生理鹽水(1 mL/100 g)，制備急性腎衰模型。造模成功后，ARF+GS組每只動(dòng)物即刻給予12.5 mg/mL人參皂甙生理鹽水溶液2 mL口服灌胃，2次/d，間隔6 h，連續(xù)給藥48 h；ARF+NS組即刻給予相同體積的生理鹽水口服灌胃。(2)NS+NS組和NS+GS組：一側(cè)后肢肌肉注射相同劑量的生理鹽水后，即刻給予2 mL生理鹽水或人參皂甙口服灌胃。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑

甘油購自浙江省蘭溪化工總廠，GS購自吉林省宏久生物科技股份有限公司，過氧化氫(H2O2)和SOD測(cè)試盒購自南京建成生物工程研究所，二氨基聯(lián)苯胺(DAB)購自美國Sigma公司，其他免疫組化試劑購自武漢博士德公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

64只健康雄性大鼠均分為4組(n=16)，造模成功，經(jīng)GS或生理鹽水處置48 h后分別進(jìn)行如下處置：每組取10只進(jìn)行整體實(shí)驗(yàn)：(1)取血，測(cè)定血尿素氮(BUN)和肌酐(Cre)的變化；(2)取腎皮質(zhì)，制備10%腎皮質(zhì)勻漿，測(cè)定腎皮質(zhì)勻漿SOD的變化；(3)取腎，切取4 μm厚腎組織石蠟切片進(jìn)行HE染色，觀察腎小管的壞死程度。每組取6只進(jìn)行免疫組化實(shí)驗(yàn)：用4%水合氯醛腹腔注射麻醉，經(jīng)心臟灌流，取腦，于4%多聚甲醛內(nèi)后固定，然后置入含20%蔗糖的磷酸鹽緩沖液中。用振動(dòng)切片機(jī)切取50 μm厚冠狀腦片，按George Paxinos﹠Charles Watson腦立體定位圖譜，用中性紅染色在低倍鏡下挑選以下部位的腦片[前囟后9.68～10.04 mm(Bregma：-9.68～-10.04 mm)]為藍(lán)斑所在部位，進(jìn)行免疫組織化學(xué)實(shí)驗(yàn)。

1.4 藍(lán)斑nNOS免疫組織化學(xué)實(shí)驗(yàn)

4組大鼠腦片分別用0.01 mol/L PBS振蕩漂洗2次，10 min/次。0.3%H2O2孵育1 h，后用0.01 mol/L PBS振蕩漂洗3次，10 min/次。2% BSA孵育1 h。加nNOS一抗(1∶100)，4℃孵育過夜。用0.01 mol/L PBS漂洗3次，10 min/次。2% BSA孵育1 h。生物素化的二抗室溫孵育1 h，用0.01 mol/L PBS漂洗3次，10 min/次。SABC孵育2 h后，0.01 mol/L PBS漂洗3次，10 min/次。DAB顯色，二甲苯透明，中性樹膠封片。光鏡(Olympus A.H-B-L萬用顯微鏡，日本)下觀察并攝片。

1.5 圖像分析

用Image Pro Plus Image Analysis System對(duì)藍(lán)斑nNOS免疫反應(yīng)陽性神經(jīng)元個(gè)數(shù)和平均光密度進(jìn)行測(cè)定。選取4組大鼠, 每組各6只，每只實(shí)驗(yàn)動(dòng)物取3張腦片，每例標(biāo)本在20倍鏡下定位，鎖定測(cè)量框，對(duì)測(cè)量框內(nèi)藍(lán)斑nNOS免疫反應(yīng)陽性神經(jīng)元個(gè)數(shù)和平均光密度進(jìn)行測(cè)定。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié) 果

2.1 GS對(duì)ARF大鼠腎功能變化的影響

ARF+NS組大鼠血清BUN和Cre升高，明顯高于空白對(duì)照組(NS+NS組)。與ARF+NS組相比，ARF+GS組血清BUN 和Cre明顯下降(P<0.05)，與NS+NS組相比差異無顯著性意義(P>0.05)。見圖1。

圖1 急性腎功能衰竭大鼠口服人參皂甙處置48 h后血清BUN(A)和Cre(B)的變化

2.2 GS對(duì)ARF大鼠腎小管壞死程度的影響

HE染色結(jié)果顯示，與NS+NS組相比，ARF+NS組大鼠腎小管壞死嚴(yán)重，上皮細(xì)胞崩解、碎裂，細(xì)胞核脫落，細(xì)胞碎片阻塞管腔，腔內(nèi)出現(xiàn)管型。與ARF+NS組相比，ARF+GS組腎小管壞死數(shù)目明顯減少，壞死程度明顯減輕。

2.3 GS對(duì)ARF大鼠腎皮質(zhì)勻漿SOD變化的影響

ARF+NS組腎皮質(zhì)勻漿SOD明顯低于NS+NS組(P<0.05)。與ARF+NS組相比，ARF+GS組腎皮質(zhì)勻漿SOD明顯升高(P<0.05)，與NS+NS組相比無明顯差異(P>0.05)。見表1。

2.4 GS對(duì)ARF大鼠藍(lán)斑nNOS免疫反應(yīng)活性變化的影響

NS+NS組大鼠藍(lán)斑內(nèi)nNOS免疫反應(yīng)陽性神經(jīng)元分布見圖2C。與NS+NS組大鼠相比，ARF+NS組大鼠藍(lán)斑內(nèi)nNOS免疫反應(yīng)陽性神經(jīng)元數(shù)目明顯減少，免疫染色強(qiáng)度明顯減弱(表2，P<0.05)，但輪廓清晰(圖2A)。與ARF+NS組相比，ARF+GS組大鼠藍(lán)斑內(nèi)nNOS免疫反應(yīng)陽性神經(jīng)元數(shù)目增多，染色強(qiáng)度增強(qiáng) (圖2B), 均明顯高于ARF+NS組(表2，P<0.05)；而且也明顯高于NS+NS組(表2，P<0.05)。

表1急性腎功能衰竭大鼠口服GS處置48 h后血清SOD的變化

組別 腎皮質(zhì)勻漿SOD(U/mgprot)ARF+NS43．57±2．09ARF+GS76．60±1．771)NS+NS72．12±0．781)NS+GS69．60±0．61

1)與ARF+NS組比較，P<0.05

圖2 急性腎功能衰竭大鼠口服GS處置48 h后藍(lán)斑nNOS免疫反應(yīng)活性的變化(DAB 染色 10×20)

表2 急性腎功能衰竭大鼠口服GS處置48 h后藍(lán)斑nNOS陽性神經(jīng)元個(gè)數(shù)及染色強(qiáng)度的變化

1) 與NS+NS組比較，P<0.05； 2) 與ARF+NS組比較，P<0.05

3 討 論

肌肉注射甘油致急性腎衰動(dòng)物模型被國內(nèi)外廣泛采用，是研究腎衰藥物治療極好的動(dòng)物模型[4-5]。人參皂甙是人參的活性成分，可通過清除自由基，中和興奮性毒性，發(fā)揮抗氧化、抗炎、抗凋亡和免疫調(diào)節(jié)等作用。有報(bào)告口服GS后腦內(nèi)可檢測(cè)到GS，提示其可通過血腦屏障，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)揮作用[6]。

研究表明氧化應(yīng)激是甘油致ARF的重要病理過程之一[7]。超氧化物歧化酶(SOD)是體內(nèi)重要的抗氧化酶，能反映機(jī)體清除自由基的能力。文獻(xiàn)報(bào)告GS Rb2通過轉(zhuǎn)錄因子AP2激活體內(nèi)抗氧化酶類基因，提高SOD的活性。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)ARF大鼠腎皮質(zhì)勻漿SOD水平明顯降低，ARF大鼠口服GS處置48 h后腎皮質(zhì)勻漿SOD水平明顯升高，表明腎衰大鼠腎皮質(zhì)抗氧化損傷能力明顯降低；GS能提高腎衰大鼠清除自由基的能力，減少氧化損傷對(duì)腎組織破壞作用，提高抗氧化損傷能力，改善腎組織缺血缺氧狀態(tài)，改善腎功能。

NO在血管擴(kuò)張、神經(jīng)傳遞、免疫防御等多種病理生理過程中發(fā)揮重要作用。文獻(xiàn)報(bào)告NO可減輕氨基三乙酸-鐵螯合物(iron-chelate of nitrilotriacetate, Fe-NTA)誘導(dǎo)的大鼠腎氧化應(yīng)激，逆轉(zhuǎn)其病理變化，保護(hù)腎組織結(jié)構(gòu)[8]；給予NOS抑制劑(L-NAME)可加重甘油致ARF大鼠的腎損傷[9]，提示NO在抗氧化損傷方面起重要作用。

藍(lán)斑是腦橋交感神經(jīng)活動(dòng)調(diào)節(jié)的重要整合中樞。在正常生理情況下或血量擴(kuò)張時(shí)，藍(lán)斑可通過腎交感神經(jīng)活動(dòng)以及釋放血管升壓素來調(diào)節(jié)腎臟鈉水排泄[10]，提示藍(lán)斑與腎臟存在某種神經(jīng)纖維交通，參與腎排鈉量變化的調(diào)節(jié)，從而在循環(huán)血量調(diào)節(jié)中發(fā)揮作用。

在腎內(nèi)注射苯酚致腎損傷動(dòng)物模型中，下丘腦后核、室旁核和藍(lán)斑nNOS免疫反應(yīng)活性明顯降低[11]。在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中，nNOS可催化L-精氨酸生成NO[12]，在調(diào)節(jié)中樞神經(jīng)系統(tǒng)功能中發(fā)揮作用。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，ARF大鼠藍(lán)斑nNOS免疫反應(yīng)陽性神經(jīng)元數(shù)目明顯減少，免疫染色強(qiáng)度減弱，表明ARF大鼠藍(lán)斑一氧化氮能神經(jīng)元活性降低。結(jié)果提示氧化應(yīng)激和血流動(dòng)力學(xué)的改變可降低藍(lán)斑一氧化氮能神經(jīng)元的活性。ARF大鼠口服GS后，藍(lán)斑nNOS免疫反應(yīng)陽性神經(jīng)元數(shù)目較實(shí)驗(yàn)對(duì)照組(ARF+NS組)增加，免疫染色強(qiáng)度增強(qiáng)，而且也高于NS+NS組，提示GS能提高ARF大鼠藍(lán)斑一氧化氮能神經(jīng)元活性。

腎臟含有豐富的壓力感受器和化學(xué)感受器及豐富的傳入神經(jīng)纖維，腎臟感受器的感覺信息可經(jīng)其傳入神經(jīng)纖維傳至中樞，參與循環(huán)血量及其他生理功能的調(diào)節(jié)[13]。研究表明在苯酚所致高血壓腎損傷大鼠模型中，產(chǎn)生的活性氧可刺激中樞和外周交感神經(jīng)活動(dòng)[14]。結(jié)合文獻(xiàn)報(bào)告與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果推測(cè)，在甘油致腎衰大鼠中，活性氧產(chǎn)生增多，一方面可能刺激腎感受器，經(jīng)腎傳入神經(jīng)纖維直接興奮中樞某些核團(tuán)如藍(lán)斑；另一方面通過信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，激活相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子，使藍(lán)斑nNOS表達(dá)下降，NO合成減少。口服GS處置48 h，可通過腎傳入神經(jīng)和激活MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，使藍(lán)斑一氧化氮能神經(jīng)元活性增加，進(jìn)而減少自由基的損傷作用，這可能是GS提高ARF大鼠抗氧化損傷能力，抗急性腎功能衰竭的中樞機(jī)制之一。

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EffectsofginsenosideontheexpressionofnNOSinlocuscoeruleusinacuterenalfailurerats

MAXiao1,LIGuang-yi2,FANKai3,ZHAOCheng-tian1,CUIYu-meng4,ZHAONan4,XUYin4,HUANGShan4,FUJu-hong4,JIANGChun-ling5

(1.Departmentofseven-yearprogram2008; 2.Departmentofseven-yearprogram2007; 3.DepartmentofAnatomy; 4.Departmentofseven-yearprogram2009; 5.DepartmentofPhysiology,DalianMedicalUniversity,Dalian116044,China)

ObjectiveTo investigate the effect of ginsenoside on the expression of nNOS in locus coeruleus in acute renal failure (ARF) rats.MethodsMale SD rats were randomly divided into four groups, that is ARF+NS group, ARF+GS group, NS+NS group and NS+GS group. Glycerol-induced acute renal failure in rat was employed. Blood urea Nitrogen(BUN), creatinine(Cre)in serum, superoxide dismutase (SOD) in renal cortex homogenate were detected by experiment in vivo and the changes of nNOS-IR in locus coeruleus were observed by immunohistochemistry 48 h after gisenoside administrated orally.ResultsIn ARF+NS group,the levels of blood urea nitrogen, creatinine in serum significantly increased (P<0.05), SOD in renal cortex homogenate significantly decreased (P<0.05) and tubular necrosis was more severe, compared with those in NS+NS group. However, in ARF+GS group, the levels of BUN and Cre in serum significantly decreased, but the level of SOD markedly increased (P<0.05) and tubular structures improved markedly. Immunohistochemistry experiment showed an obvious decrease of nNOS-IR in locus coeruleus in ARF+NS group (P<0.05), but the nNOS-IR was enhanced in ARF+GS group (P<0.05), compared with that in ARF+NS group.ConclusionOur results demonstrated that ginsenoside administrated orally significantly improved renal function of glycerol-induced ARF rats and enhanced the effect of antioxidative damages, having a strong renal protective effect against glycerol-induced acute renal failure. Our results also indicated that ginsenoside administrated orally could upregulate the activity of nNOS in locus coeruleus in ARF rats.

acute renal failure; ginsenoside; locus coeruleus; neuronal nitric oxide synthase

10.11724/jdmu.2013.04.05

R363

A

1671-7295(2013)04-0325-05

馬笑，李光毅，范凱，等. 人參皂甙對(duì)腎衰大鼠藍(lán)斑nNOS表達(dá)變化的影響[J].大連醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2013,35(4)：325-329.

遼寧省優(yōu)秀中青年骨干教師基金項(xiàng)目(2007)

馬 笑(1989- )，女，遼寧錦州人，七年制學(xué)生。

姜春玲，博士，教授。E-mail: Chunling_jiang2006@163.com

2013-04-19；

2013-06-25)