劉殿辰, 王玲燕， 趙博生

(1.山東理工大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院， 山東 淄博 255091； 2.山東大成農(nóng)化有限公司， 山東 淄博 255009)

渦蟲(chóng)具有強(qiáng)大的再生能力，除咽部和最前端的頭部外，任何大于104個(gè)細(xì)胞的片段都能再生為一個(gè)完整的個(gè)體[1-2]；另外由于其分布廣、取材方便，渦蟲(chóng)已經(jīng)成為研究發(fā)育和再生的模式動(dòng)物[3].渦蟲(chóng)強(qiáng)大的再生能力是基于體內(nèi)存在大量的多功能干細(xì)胞(neoblasts).Neoblasts是1892年Randolph在研究成熟渦蟲(chóng)(Schmidteamediterranea)時(shí)發(fā)現(xiàn)的類似于胚胎細(xì)胞的未分化小細(xì)胞[4]，是渦蟲(chóng)體內(nèi)唯一有多功能分化活性的細(xì)胞[5]，直徑為5～10μm，均勻分散于表皮和肌肉下的實(shí)質(zhì)組織中.2005年Orii等利用抗血清對(duì)neoblasts進(jìn)行了十分清晰的定位，發(fā)現(xiàn)neoblasts在背腹間質(zhì)中呈分散分布，在背部間質(zhì)中沿中線和兩側(cè)線成簇分布[6].

渦蟲(chóng)在再生過(guò)程中，在實(shí)質(zhì)組織中，一定數(shù)量的neoblasts接受上皮組織的應(yīng)激信號(hào)，開(kāi)始增殖，其后代細(xì)胞遷移，并產(chǎn)生胚基；2000年 Newmark和 Alvarado通過(guò)喂食渦蟲(chóng)5-溴脫氧尿嘧啶核苷(5-Bromo-2-deoxyUridine, BrdU)，在渦蟲(chóng)中成功運(yùn)用BrdU摻入實(shí)驗(yàn)[5]，不僅可以檢測(cè)增殖的干細(xì)胞，又可以追蹤干細(xì)胞分化后的命運(yùn)，這為后人研究渦蟲(chóng)的再生提供了很好的分子標(biāo)記工具.然而，由于雙鏈DNA互補(bǔ)配對(duì)的堿基會(huì)阻礙抗體和BrdU亞基的結(jié)合，從而影響了neoblasts的標(biāo)記效率.為了暴露出BrdU的抗原決定簇，渦蟲(chóng)標(biāo)本必須經(jīng)過(guò)強(qiáng)烈的變性，比如濃鹽酸或乙酸和甲醇的混合液處理.這些強(qiáng)烈的化學(xué)處理總會(huì)破壞標(biāo)本的原來(lái)結(jié)構(gòu)，從而使得BrdU染色的敏感程度和效果取決于樣品處理的條件[7].

EdU(5-Ethynyl -2′-deoxyuridine)是一種胸腺嘧啶核苷類似物，能夠在細(xì)胞增殖時(shí)期代替胸腺嘧啶(T)滲入正在復(fù)制的DNA分子中，與BrdU檢測(cè)方法相比，EdU檢測(cè)方法更快速、更靈敏、更準(zhǔn)確.而且EdU染料的分子量只有BrdU抗體的1/500，在細(xì)胞內(nèi)很容易擴(kuò)散，無(wú)需DNA變性(酸解、熱解、酶解等)，可有效避免樣品損傷.本研究基于EdU與Apollo熒光染料的特異性反應(yīng)快速檢測(cè)細(xì)胞DNA復(fù)制活性的機(jī)制，旨在探索EdU能否標(biāo)記渦蟲(chóng)體內(nèi)的neoblasts，為渦蟲(chóng)再生機(jī)制研究和成體干細(xì)胞提供新的分子標(biāo)記物.

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 東亞三角渦蟲(chóng)

東亞三角渦蟲(chóng)(Dugesiajaponica)采集于山東省博山泉河頭，并飼養(yǎng)于滅菌并充氧過(guò)夜的涼開(kāi)水中，每周喂食豬肝一次，試驗(yàn)用渦蟲(chóng)一周前停止喂食.

1.1.2 儀器

德國(guó)Leica公司生產(chǎn)的激光共聚焦掃描顯微鏡，日本尼康公司生產(chǎn)的顯微操作系統(tǒng)，上海天平儀器廠生產(chǎn)的電子分析天平FA1004，上海醫(yī)療器械五廠生產(chǎn)的電熱恒溫水浴鍋HHS，江蘇金壇國(guó)勝儀器廠生產(chǎn)的石英自動(dòng)雙重純水蒸餾器1810-B等.

1.1.3 試劑

EdU試劑盒購(gòu)自于廣州市銳博生物科技有限公司，其它試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純.

1.2 方法

1.2.1 渦蟲(chóng)的選取及注射

選取大小適中(長(zhǎng)約5 mm)的渦蟲(chóng)約30條，將選好的渦蟲(chóng)置于冰上冷凍麻醉.將EdU試劑盒中的試劑A用PBS溶解，稀釋濃度為0.5 mg/mL.將冷凍麻醉好的渦蟲(chóng)置于顯微注射系統(tǒng)下注射，每條渦蟲(chóng)注射0.6μL.然后將注射好的渦蟲(chóng)輕輕地轉(zhuǎn)移到干凈的培養(yǎng)皿中培養(yǎng)12 h.

1.2.2 渦蟲(chóng)的固定

將注射后培養(yǎng)12 h的渦蟲(chóng)切割為頭、中部和尾部，頭端沿眼點(diǎn)后緣切割，尾端沿咽部后緣切割，將切割好的渦蟲(chóng)中部轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)皿中繼續(xù)培養(yǎng)，然后分別于3 h、6 h和12 h取出10條用2%的鹽酸殺死并用多聚甲醛固定2 h.

1.2.3 染色

用PBS清洗渦蟲(chóng)3次，每次10 min，加入100μL滲透劑(0.5%TritonX-100的PBS)脫色搖床孵育10min，PBS清洗2次..根據(jù)EdU產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)配制1×Apollo染色反應(yīng)液(現(xiàn)用現(xiàn)配)，加入100μL染色反應(yīng)液避光、室溫孵育30min，棄染色反應(yīng)液，加入滲透劑(0.5%TritonX-100的PBS)清洗3次，每次10 min，加入甲醇清洗2次，每次5 min，棄甲醇，PBS清洗.

1.2.4激光共聚焦掃描顯微鏡觀察拍照

選用波長(zhǎng)550 nm的激光激發(fā)Apollo染料，掃描拍照，并用Leica TCS圖像分析軟件對(duì)照片進(jìn)行數(shù)據(jù)分析.

2 結(jié)果與分析

2.1 細(xì)胞形態(tài)與分布的觀察

激光共聚焦掃描顯微鏡觀察顯示：EdU陽(yáng)性細(xì)胞個(gè)體較小，呈球形或近球形，除頭部前端和尾部末端未見(jiàn)分布外，主要分布在頭部后端、中部和尾部前端，而且呈現(xiàn)在背腹間質(zhì)中呈分散分布，背部間質(zhì)中沿中線和兩側(cè)線成簇分布(圖1).EdU陽(yáng)性細(xì)胞特點(diǎn)和分布結(jié)果與Orii等[6]用BrdU標(biāo)記的neoblasts的研究結(jié)果完全吻合，因此，可以確定EdU已對(duì)neoblasts成功標(biāo)記.

圖1 Edu標(biāo)記的neoblasts在再生12h渦蟲(chóng)體內(nèi)的分布圖

2.2 渦蟲(chóng)再生初期neoblasts數(shù)量變化分析

為了確定渦蟲(chóng)再生初期neoblasts的數(shù)量變化和EdU的標(biāo)記效果，分別對(duì)再生3 h、6 h和12 h的渦蟲(chóng)中部EdU陽(yáng)性信號(hào)熒光相對(duì)強(qiáng)度進(jìn)行采集，并進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果表明：在渦蟲(chóng)再生的初期，隨著neoblasts的分裂和數(shù)量的增多，熒光相對(duì)強(qiáng)度逐漸增強(qiáng)，再生12 h達(dá)到最大值(圖2)，這與neoblasts在再生過(guò)程中的細(xì)胞行為和細(xì)胞狀態(tài)相一致.

圖2 渦蟲(chóng)中部再生3h、6h、12h體內(nèi)neoblasts數(shù)量變化圖譜

3 討論

渦蟲(chóng)具有驚人的再生能力，即使是小到蟲(chóng)體1/279的渦蟲(chóng)組織仍然能夠再生出一個(gè)完整個(gè)體，其再生過(guò)程依賴于體內(nèi)neoblasts的分裂、遷移和分化.neoblasts是渦蟲(chóng)成體內(nèi)唯一具有增殖能力和自我更新能力的體細(xì)胞，也是體內(nèi)唯一能分化為神經(jīng)細(xì)胞、生殖細(xì)胞等近40種細(xì)胞類型的原始細(xì)胞[6-8]，因此，探索渦蟲(chóng)再生過(guò)程中neoblasts快速有效的標(biāo)記方法，已經(jīng)成為再生機(jī)制研究的基礎(chǔ).

目前常用的neoblasts標(biāo)記物BrdU，是一種胸腺嘧啶核苷類似物，可在細(xì)胞分裂的S期代替胸腺嘧啶核苷摻入到正在復(fù)制的DNA分子中去，再利用抗BrdU的抗體通過(guò)免疫組織化學(xué)染色顯示增值的細(xì)胞.但是由于BrdU在染色上存在的缺陷，標(biāo)記渦蟲(chóng)體內(nèi)neoblasts時(shí)，需要對(duì)樣本進(jìn)行強(qiáng)烈的化學(xué)處理，從而影響了敏感程度和標(biāo)記效果[7]，并且，BrdU標(biāo)記步驟繁瑣，需要通過(guò)抗原-抗體反應(yīng)才能顯現(xiàn)標(biāo)記效果.EdU(5-Ethynyl -2′-deoxyuridine)作為另一種胸腺嘧啶核苷類似物，在細(xì)胞增殖時(shí)期能夠代替胸腺嘧啶(T)滲入正在復(fù)制的DNA分子中，與BrdU檢測(cè)方法相比，EdU的熒光染料Apollo的分子只有BrdU抗體的1/500，在組織和細(xì)胞內(nèi)更容易擴(kuò)散，檢測(cè)方法更快速、更靈敏、更準(zhǔn)確，而且無(wú)需進(jìn)行化學(xué)處理，可有效避免樣品損傷，因此，基于EdU與Apollo熒光染料的特異性反應(yīng)快速檢測(cè)渦蟲(chóng)體內(nèi)neoblasts是一種可行有效的方法.

本實(shí)驗(yàn)室通過(guò)注射EdU對(duì)再生渦蟲(chóng)體內(nèi)的neoblasts進(jìn)行標(biāo)記，結(jié)果表明，EdU不僅能夠?qū)eoblasts成功標(biāo)記，而且比傳統(tǒng)標(biāo)記物BrdU更快速、更靈敏、更準(zhǔn)確.另外，通過(guò)對(duì)渦蟲(chóng)中部再生3 h、6 h和12 h的EdU陽(yáng)性信號(hào)的熒光相對(duì)強(qiáng)度分別進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果表明，隨著渦蟲(chóng)再生過(guò)程的進(jìn)行，熒光相對(duì)強(qiáng)度逐漸增強(qiáng)，從而說(shuō)明neoblasts的數(shù)量正在增加，這與再生過(guò)程中neoblasts的細(xì)胞動(dòng)力學(xué)特征相一致.研究結(jié)果為渦蟲(chóng)再生過(guò)程中neoblasts的標(biāo)記提供了又一個(gè)分子標(biāo)記工具，為渦蟲(chóng)再生的機(jī)制研究奠定了基礎(chǔ).

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