周文萍，向 丹，胡亞軍，李志芳，陳保冬，*

(1.中國農(nóng)業(yè)大學農(nóng)學與生物技術(shù)學院，北京 100193;2.中國科學院生態(tài)環(huán)境研究中心，北京 100085)

草地生態(tài)系統(tǒng)是陸地上最重要、分布最廣的生態(tài)類型之一。在我國，草地面積占國土面積的41.7%，約4億hm2［1］。20世紀以來，環(huán)境變化和人類活動干擾導致草地退化日益嚴重。在華北地區(qū)，退化草地面積超過草地總面積的2/3［2］。不合理放牧是導致草地退化的一個重要原因［3-4］，放牧行為直接影響到草地生物量及物種多樣性，間接改變草地生態(tài)系統(tǒng)物質(zhì)與能量的分配模式，最終引起生態(tài)系統(tǒng)內(nèi)部生物群落結(jié)構(gòu)和功能的變化［5］。不同放牧強度干擾對草地生態(tài)系統(tǒng)會產(chǎn)生不同的影響，多數(shù)研究表明過度放牧導致草地生態(tài)系統(tǒng)植被蓋度和生物量下降、群落結(jié)構(gòu)趨于簡化，土壤容重、含水量、有機質(zhì)以及氮、磷、鉀等營養(yǎng)元素含量降低［6］，而中度放牧可能降低具有競爭能力的優(yōu)勢物種的多度，增加亞優(yōu)勢物種的多度，間接增加土壤種子庫的物種多樣性，提高植物物種多樣性和豐富度指數(shù)［7］。在我國，牧區(qū)缺乏統(tǒng)一、規(guī)范的管理，過度放牧情況嚴重，很多草地由于過度放牧嚴重退化。作為一種人工保護退化草地自然恢復的措施，圍封可以有效恢復植物群落的結(jié)構(gòu)和生產(chǎn)力，增加土壤有機質(zhì)、氮、磷等養(yǎng)分含量［8-9］。此外，也有研究發(fā)現(xiàn)，封育草地由于所受外界干擾較少，少數(shù)優(yōu)勢物種會迅速占據(jù)生態(tài)位而導致物種多樣性指數(shù)較低［4］。放牧強度與草地生物多樣性響應(yīng)機制一直是草地生態(tài)學的一個研究熱點。

叢枝菌根(AM)真菌是一種廣泛分布，可與大部分陸生高等植物共生的一類土壤真菌［10］。AM真菌侵染植物根系建成共生體系，宿主植物為菌根真菌提供能量物質(zhì)，而作為回報AM真菌則幫助宿主植物吸收各種礦質(zhì)養(yǎng)分，并增強植物的抗逆性。研究表明，菌根真菌的多樣性影響到生態(tài)系統(tǒng)的物種多樣性，AM真菌群落的變化會導致植物群落組成的改變［11-13］。在草地生態(tài)系統(tǒng)中，AM真菌是不可忽視的組成部分，對于退化草原的生態(tài)恢復具有潛在的重要作用［14］。

以往有關(guān)草地生態(tài)恢復的研究多側(cè)重于考察植被演替［15-16］，而忽略了地下功能微生物群落的變化。事實上，生態(tài)系統(tǒng)是由地上和地下兩個部分組成的一個有機整體［17］，通過很多直接或間接的相互作用將這兩部分緊密聯(lián)系在一起。地下生態(tài)系統(tǒng)是土壤生物群落及其生存環(huán)境共同組成的動態(tài)平衡系統(tǒng)［18］，結(jié)構(gòu)上包含土壤基質(zhì)、地下水循環(huán)系統(tǒng)及土壤生物系統(tǒng)，研究內(nèi)容側(cè)重于土壤生物與環(huán)境間的相互作用機制。土壤生態(tài)系統(tǒng)可以提供必要的水循環(huán)、生物化學循環(huán)和能量流，擁有豐富的、可以維持生態(tài)系統(tǒng)功能的生物多樣性，并且能匯集土壤中的根系、礦質(zhì)營養(yǎng)及枯枝落葉形成巨大的碳匯和養(yǎng)分庫［19］。顯而易見，生態(tài)系統(tǒng)的恢復不只是地上部植被的恢復，客觀上還應(yīng)包括地下部分土壤肥力和功能微生物類群的恢復。研究表明，植被恢復情況可以直接影響土壤微生物群落的恢復過程［20］，而土壤微生物群落也能直接驅(qū)動植物群落的改變［21］。認識草地恢復過程中植物和土壤關(guān)鍵功能微生物類群的協(xié)同演替規(guī)律，可為科學評價草地生態(tài)恢復效果及探索有效生態(tài)恢復途徑提供理論依據(jù)。

本研究以不同放牧強度試驗草地為研究對象，調(diào)查了圍封14a后草地植物群落多樣性，并應(yīng)用第二代高通量測序技術(shù)454測序法分析了植物根際土壤中AM真菌群落的組成情況，探討退化草地生態(tài)恢復過程中植物群落及其共生AM真菌的協(xié)同演替規(guī)律，期望為草地生態(tài)系統(tǒng)的恢復與重建提供理論依據(jù)。

1 調(diào)查樣地與研究方法

1.1 樣地與樣品采集

1.1.1 研究區(qū)域自然概況

研究區(qū)域位于內(nèi)蒙古科爾沁沙地中國科學院奈曼沙漠化研究站附近(42°56′N，120°42′E)，海拔358 m，具有明顯的溫帶大陸性半干旱氣候特點。年平均氣溫6.0—6.5℃，年平均降水量366 mm，降水主要集中在6—8月，年均蒸發(fā)量1972.8 mm。

1.1.2 樣地設(shè)置

調(diào)查樣地原為自由放牧的天然沙質(zhì)草地，面積約60，000 m2，于1992年刺線圍封，在圍封區(qū)布置梯度放牧強度試驗。試驗設(shè)4個處理:重牧區(qū)(HG，6只羊/hm2)、中牧區(qū)(MG，4只羊/hm2)、輕牧區(qū)(LG，2只羊/hm2)及封育區(qū)(CK，不放牧)。各小區(qū)面積相等，為75 m×200 m。每年的放牧時間從6月1日開始，9月20日結(jié)束。梯度放牧強度試驗于1996年結(jié)束，此后圍封進行生態(tài)系統(tǒng)自然恢復。本試驗以封育區(qū)為對照，研究梯度放牧強度處理后長期封育對地上植被和AM真菌群落恢復的影響。

1.1.3 樣品采集

試驗樣品采集于2010年8月，采樣時間距離試驗區(qū)圍封已經(jīng)14a。取樣時在每個試驗小區(qū)的兩端和中間各選擇一塊樣地，樣地面積10 m×10 m，在樣地四個邊角及中心各取一個1 m×1 m的樣方，按照方精云等［22］的草本層植物群落清查方法對各小區(qū)植被組成、蓋度、密度、高度等進行調(diào)查統(tǒng)計，并取0—30 cm土層土壤及植物根樣。每個樣地內(nèi)的土壤過2 mm篩后混勻，取200 g樣品裝袋，植物根系樣品也混勻后裝袋，暫放低溫保溫箱帶回實驗室，保存于-80℃冰箱待用。其余土壤樣品裝袋后帶回實驗室自然風干，進行理化性質(zhì)分析。

1.2 樣品分析

1.2.1 土壤理化性質(zhì)測定

土壤有機質(zhì)采用重鉻酸鉀氧化法［23］，土壤pH值用電位法，土壤速效N用堿解擴散法，土壤速效磷用碳酸氫鈉浸提-鉬銻抗比色法［24］。土壤全N和全C由元素分析儀(Vario ELⅢ，Elementar company，German)測定［25］。

1.2.2 菌根侵染率測定

采用根段染色-鏡檢法［26］，從采集的根樣中挑出細根剪成1 cm根段，用10%KOH透明、2%HCl酸化、0.05%臺盼藍(Trypan Blue)染色-乳酸甘油脫色。將30條經(jīng)染色的根段置于載玻片上在顯微鏡下逐一觀測叢枝、泡囊和菌絲著生狀況，計算菌根侵染率。

1.2.3 菌絲密度測定

臺盼藍染色-鏡檢法［27］，取5 g過2 mm篩土壤樣品放入帶蓋塑料瓶中，加入100 mL水和12 mL3.7%六偏磷酸鈉溶液，劇烈振蕩30 s，靜置2.5 min后過0.05 mm篩，收集篩上過濾物于攪拌器中攪拌20 s，靜置10 s，吸取5 mL濾液抽濾(濾膜孔徑0.22 μm)，臺盼藍染色制片，顯微鏡下觀測，計算菌絲密度。

1.2.4 AM真菌分子鑒定

采用454焦磷酸測序法對AM真菌進行多樣性鑒定。該測序方法對各樣品片段高通量平行測序，稀有物種的序列也不會丟失。454焦磷酸測序有其固定的測序引物，為了保證多個樣品測序同時進行，需要在樣品引物的一端添加識別序列bar-code［28］。本試驗采用巢式PCR，即需要在第二對引物上添加bar-code，添加完bar-code 的前引物序列為:5′-CGTATCGCCTCCCTCGCGCCATCAG(NNNNNNN)TGGAGGG CAGTCTGT C-3′;后引物序列為5′-CTATGCGCCTTGCCAGCCCGCTCAG GTTTCCCGTAAGGCGCC GAA-3′。其中，帶下劃線部分是測序引物，括號內(nèi)為7bp的bar-code，斜體部分是樣品特異性引物NS31/AM1。NS31/AM1是近年來最常用于測定自然土壤AM真菌群落多樣性的引物，其擴增區(qū)域位為SSU rRNA，片段大小約為550 bp，滿足454焦磷酸測序?qū)ζ伍L度的要求。由于該引物具有一定的偏擴性，不利于無梗囊霉科和類球囊霉科AM真菌的擴增［29］，為彌補NS31/AM1偏擴帶來的誤差，選用覆蓋度更廣的AML1/AML2［30］作為第1對引物。該引物能覆蓋除Archaeospora trappei以外的所有已知AM真菌。具體測序步驟如下:

1)DNA提取 取500 mg過2 mm篩的混勻鮮土，按照DNA提取試劑盒說明(Fast DNA spin kit for soil，Bio 101，La Jolla，Calif.)進行操作，提取的DNA溶液貯藏于-20℃冰箱待用。

2)Nested-PCR 第1次擴增反應(yīng)體系25 μL，包括2 μL DNA模板(10—20 ng/μL，由土壤DNA提取液稀釋得到)、0.3 μL 25 μmol/L 引物(前后引物各 0.3 μL)、2.5 μL 10×Ex Taq Buffer、2 μL 2.5 mmol/L dNTP 混合液(各堿基濃度均為 2.5 mmol/L)、0.3 μL 25 μmol/L BSA、0.5 μL 5 U/μL Ex Taq，以及 17.1 μL dd H2O。反應(yīng)程序為:94℃變性5 min;94℃ 30 s，58℃ 45 s，72℃ 1 min，循環(huán)35次;最后72℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物用1% 瓊脂糖凝膠電泳檢測。第1次擴增產(chǎn)物稀釋十倍作為第2次擴增反應(yīng)的模板，第2次擴增體系為50 μL，包括2 μL DNA 模板(10—20 ng/μL，由第1 次擴增產(chǎn)物稀釋得到)、0.6 μL 25 μmol/L 引物(前后引物各 25 μmol/L)、5.0 μL 10×Ex Taq Buffer、4.0 μL 2.5 mmol/L dNTP 混合液(各堿基濃度均為 2.5 mmol/L)、0.6 μL 5 U/μL Ex Taq，以及37.2 μL dd H2O。反應(yīng)程序與結(jié)果鑒定方法與第1次擴增相同。

3)純化 按照純化試劑盒(QIAEXⅡGel Extraction Kit，QIAGEN Sciences，Maryland)操作說明對第2次擴增產(chǎn)物進行純化，純化產(chǎn)物由NanoDrop 1000測定濃度。各樣品純化后DNA等量(每個樣品DNA含量150 ng)混合，混合液送上海人類基因組研究中心進行454焦磷酸測序。

4)測序結(jié)果分析 454測序得到的序列滿足以下3個條件的用作進一步分析:1)包含正確的bar-code;2)有正確的NS31引物序列;3)片段總長超過160 bp(不包括測序引物及bar-code)。進一步分析需要用到MaarjAM數(shù)據(jù)庫［31］，該數(shù)據(jù)庫包含所有已報道的球囊菌門(Glomeromycota)真菌SSU rRNA序列，以相似度≥90%和片段長度不少于query序列10 bp為條件與該數(shù)據(jù)庫比對篩選出屬于球囊菌門真菌的序列。篩選出的序列以相似度≥97%及片段長度不小于query序列10 bp為條件進一步與MaarjAM數(shù)據(jù)庫比對，相同序列比對結(jié)果即為同一虛擬分類單元(Virtual taxa，VT)。VT是MaarjAM數(shù)據(jù)庫中用以區(qū)別不同AM真菌序列的新的分類方法。與以往形態(tài)學鑒定不同，MaarjAM數(shù)據(jù)庫中AM真菌不以種作為最基本分類單位，而是用不同的VT加以區(qū)分。獲得VT分類后，用MOTHUR［32］軟件(Version 1.23.1)及其在線平臺(http://www.mothur.org)分析AM真菌群落Shannon-Wiener指數(shù)，并對不同處理群落結(jié)構(gòu)差異進行顯著性分析。AM真菌Margalef豐富度指數(shù)及Pielou均勻度指數(shù)計算方法與植物豐富度指數(shù)及均勻度指數(shù)計算方法相同。

1.3 數(shù)據(jù)處理

1.3.1 物種多樣性采用Shannon-Winer指數(shù)(H)表示。

植物物種多樣性指數(shù)計算公式

式中，ni為物種i的個體數(shù)，n為群落中所有物種個體數(shù)之和;

1.3.2 物種豐富度采用Margalef指數(shù)(Ma)表示。

式中，S為物種數(shù)目，N為群落中所有物種個體總數(shù);計算AM真菌物種豐富度時，S為VT數(shù)目，N為群落中所有VT個體總數(shù)。

AM真菌Chao-1 index［33］通過MOTHUR軟件及其在線平臺計算得到，該指數(shù)為AM真菌VT期望值，即AM真菌群落的理論物種豐富度。

1.3.3 物種均勻度采用Pielou均勻度指數(shù)(E)表示。

式中，H為Shannon-Wiener指數(shù)。計算植物物種均勻度時，S為物種數(shù)目;計算AM真菌物種均勻度時，S為VT數(shù)目。

1.4 統(tǒng)計分析

采用aRarefactWin軟件(Version 1.3)對AM真菌進行Rarefaction分析，檢測454測序序列數(shù)的充分性。采用R軟件(Version 1.0)下的Heatmap builder程序?qū)?54測序得到的序列進行處理制作成熱圖，分析群落中不同物種的豐度。

所有試驗數(shù)據(jù)采用Microsoft Excel進行均值和標準差計算并作圖，采用SPSS統(tǒng)計分析軟件(SPSS 17.0)對數(shù)據(jù)進行單因素方差分析，采用鄧肯新復極差法(SSR)多重比較檢驗處理之間的差異顯著性。

2 結(jié)果與分析

2.1 土壤理化性質(zhì)

不同試驗處理小區(qū)土壤理化性質(zhì)見表1。由于研究區(qū)為沙質(zhì)草地，各處理小區(qū)土壤有機質(zhì)及礦質(zhì)養(yǎng)分含量均不高。速效N最高為19.60 mg/kg，速效P最高為2.25 mg/kg。重牧區(qū)速效P含量僅1.00 mg/kg，顯著低于中牧區(qū)和輕牧區(qū)。其余土壤理化性質(zhì)指標在各處理之間差異均不顯著。

表1 不同試驗小區(qū)土壤基本理化性質(zhì)Table 1 The chemo-physical properties of soils from different experimental plots

2.2 植物多樣性

各試驗處理小區(qū)單位面積物種數(shù)、植物多樣性指數(shù)、豐富度指數(shù)以及均勻度指數(shù)均無顯著差異(表2)。

2.3 AM真菌多樣性

2.3.1 菌根侵染率和根外菌絲密度

菌根侵染率在不同處理之間無顯著差異(表3)。重牧區(qū)根外菌絲密度最低，為2.41 m/g土，顯著低于輕牧區(qū)(3.58 m/g土)，但和其它各小區(qū)差異不顯著。

表2 不同試驗小區(qū)植物多樣性和豐富度指數(shù)Table 2 Plant diversity and species richness in different experimental plots

表3 不同試驗小區(qū)菌根侵染率和根外菌絲密度Table 3 Infection percentage and hyphal length density of AM fungi

2.3.2 AM真菌總體構(gòu)成

通過454測序從所有土壤樣品共得到60108條有效序列，序列長度160 bp至534 bp，平均長度385 bp。AM真菌序列數(shù)為59382條，約占總有效序列的98.8%，各樣品菌根真菌序列數(shù)不等(1057—9161條)，平均約5830條。所得AM真菌序列以97%相似度與MaarjAM數(shù)據(jù)庫進行比對，最終得到序列總數(shù)為51509條，樣品之間序列數(shù)差異較大，最多為8216條，最少為974條。所有AM真菌序列歸類至4目5科7屬87 VT。球囊霉屬AM真菌有效序列數(shù)最多，共50306條，占總序列數(shù)97.7%。所有球囊霉屬序列歸為73 VT，占VT總數(shù)83.9%。原囊霉屬AM真菌最少，僅有13條序列(占總序列數(shù)0.03%)，1個VT(表4)。

表4 454測序獲得AM真菌序列數(shù)和虛擬分類Table 4 Number of Sequences and VTs of AM fungi from all soil samples by 454 pyrosequencing

2.3.3 物種稀釋曲線

由物種稀釋曲線可見，當序列數(shù)達到2000時，AM真菌VT數(shù)上升幅度已非常緩慢，除輕牧區(qū)序列數(shù)為1633條外，其余各處理序列數(shù)均超過4000條達到平臺期(圖1)，所以本研究AM真菌多樣性結(jié)果基本可以反映取樣區(qū)AM真菌群落的真實情況。

2.3.4 AM真菌多樣性指數(shù)及均勻度指數(shù)

如表5所示，中度放牧區(qū)Shannon-Wiener多樣性指數(shù)和Pielou均勻度指數(shù)均顯著高于封育區(qū)，而Shannon-Wiener多樣性指數(shù)在不同放牧強度小區(qū)之間差異不顯著，Pielou均勻度指數(shù)在中牧區(qū)和重牧區(qū)也較高，與封育區(qū)相比達到顯著差異。中牧區(qū)單位面積物種數(shù)及Margalef豐富度指數(shù)相對較高，但經(jīng)統(tǒng)計分析與其它處理無顯著性差異。

2.3.4 Chao-1物種豐富度

表6給出的是各處理的AM真菌實測VT數(shù)和經(jīng)計算得到的Chao-1物種豐富度(期望物種數(shù))。由表中數(shù)據(jù)可以看出，實測AM真菌VT數(shù)與期望AM真菌物種數(shù)趨勢一致(極顯著正相關(guān)，r=0.92，P＜0.01)，均為重牧區(qū)最多，輕牧區(qū)最少，這從一個方面表明試驗方法的可信度。對各處理平均序列數(shù)進行統(tǒng)計分析，結(jié)果表明，封育區(qū)平均序列數(shù)最多，約6342條，顯著高于輕牧區(qū)(1634條)，但與另兩個處理之間差異不顯著(表6)。

圖1 不同處理AM真菌物種稀釋曲線Fig.1 AMF taxon accumulation curves along the number of sequences obtained from different experimental plots

表5 各處理AM真菌多樣性指數(shù)和豐富度指數(shù)Table 5 Shannon-wiener index and Margalef index in different experimental plots

表6 不同處理實測和理論AM真菌物種數(shù)Table 6 Observed and estimated number of species(VT)of AM fungi in different experimental plots

2.3.5 AM真菌群落結(jié)構(gòu)分析

不同小區(qū)共有及特有的AM真菌VT如圖2所示。所有小區(qū)共有的AM真菌有40個VT，其余不同小區(qū)間共有的VT數(shù)量不一，以封育區(qū)和重牧區(qū)共有的VT數(shù)最多(53個)。封育區(qū)特有的AM真菌VT數(shù)最多(10個)，而輕牧區(qū)最少(2個)。

圖3顯示各處理小區(qū)AM真菌群落的物種組成及豐度信息。封育區(qū)優(yōu)勢VT為VT00130及VT00156，輕牧區(qū)優(yōu)勢VT為VT00130及VT00214，中牧區(qū)優(yōu)勢VT為VT00214及VT00295，重牧區(qū)物種豐度較高的VT較多，有VT00063、VT00130及VT00156等。各小區(qū)優(yōu)勢VT分布相對較集中，且處理之間存在一定的差異，但由Mothur軟件分析不同小區(qū)AM真菌群落差異表明，各小區(qū)之間的群落結(jié)構(gòu)并無顯著性差異。

3 討論

圖2 Venn圖-不同處理特有和共有VT數(shù)量Fig 2 Number of unique and shared VTs among different experimental plots

草地圍欄封育是維護草地生態(tài)系統(tǒng)生產(chǎn)力的重要手段，也是牧區(qū)開展退化草地恢復治理的有效途徑之一。大多數(shù)有關(guān)草地恢復的研究主要關(guān)注植物群落、土壤養(yǎng)分，或是土壤生物群落的變化［34-36］，而對生態(tài)系統(tǒng)地上和地下部分的協(xié)同關(guān)系考慮較少。事實上，生態(tài)系統(tǒng)地上部分植物群落和地下微生物群落在物種水平、群落水平及系統(tǒng)水平上均存在互動機制。植物從土壤中吸收水分和養(yǎng)分，并通過根際過程改變土壤環(huán)境，進而影響土壤微生物的種類和數(shù)量［37］;反之，根際微生物種類和數(shù)量的不同也可以改變植物從土壤中獲取營養(yǎng)物質(zhì)的方式和途徑，從而促進或抑制植物的生長［38］。顯然，對于退化草地的生態(tài)恢復過程而言，只有地上植物群落和根際微生物群落均達到穩(wěn)定狀態(tài)才可認為達到了生態(tài)恢復的最終階段。本研究分析了封育14a后不同放牧強度草地植物群落多樣性、土壤理化性質(zhì)及AM真菌的群落多樣性，結(jié)果顯示長期封育使得植物群落和土壤肥力基本恢復到與對照區(qū)一致的水平(表1和表2)。單桂蓮等［16］曾研究過圍封年限對典型草原群落結(jié)構(gòu)及物種多樣性的影響，結(jié)果表明退化草地采用生長季圍封措施后，群落生產(chǎn)力與物種多樣性增加，群落結(jié)構(gòu)和優(yōu)勢物種地位發(fā)生較大改變，在圍封14a的時候達到群落蓋度和密度的最大值。本研究進一步印證以上的研究結(jié)果。另一方面，本研究還發(fā)現(xiàn)AM真菌多樣性在各處理間存在顯著差異，其多樣性指數(shù)和均勻度指數(shù)在中度放牧強度區(qū)最高，且顯著高于對照處理(表5)。該結(jié)果表明不同放牧強度下的草地在封育14a后AM真菌群落的恢復與地上植物群落及土壤肥力的恢復并不一致。換言之，本研究揭示了草地生態(tài)恢復過程中植物和土壤微生物群落恢復過程具有不同步性，土壤微生物群落的演替可能較地上植物群落的演替過程緩慢。454焦磷酸測序法為第2代基因測序技術(shù)，具有簡便、快速、獲取信息量大且花費較少的優(yōu)點，已廣泛應(yīng)用于微生物基因組研究［39］。該方法獲得DNA信息量大，保證了稀有AM真菌的可檢測性，可以較好的反映自然環(huán)境中AM真菌的群落組成，近幾年在AM真菌多樣性研究中也逐步得以應(yīng)用［40］。由454測序所獲得AM真菌序列可以與MarrjAM數(shù)據(jù)庫進行比對，獲得可靠的AM真菌分類結(jié)果。MarrjAM數(shù)據(jù)庫［31］收錄了所有已知球囊霉門的序列及其相關(guān)信息(寄主植物、地理位置等)，并對所有序列進行統(tǒng)一分類和命名。該數(shù)據(jù)庫中不以“種”為最小分類單位，而是統(tǒng)一用虛擬分類單元“VT”表示。本研究中AM真菌序列共歸為88 VT，與形態(tài)學鑒定及其它分子鑒定方法(如克隆文庫)獲得的種類數(shù)相比，檢測到的多樣性更高［41-42］。本試驗各處理AM真菌物種稀釋曲線基本到達平臺期(圖1)，所測物種豐富度趨勢與Chao-1豐富度趨勢一致，因而可反映AM真菌群落的真實情況［43］。在研究樣區(qū)中球囊霉屬AM真菌共有73 VT，占AM真菌VT總數(shù)的83.9%，為優(yōu)勢屬，這與其它研究者所得出的結(jié)論一致［41-42］。

圖3 各處理小區(qū)AM真菌群落物種組成及豐度Fig.3 Composition of AM fungal community and abundance of species in different experimental plots

放牧強度對草地生態(tài)系統(tǒng)各功能單元的影響已有很多研究報道。放牧可以影響土壤碳、氮循環(huán)［44］，隨著放牧強度的增加，土壤有機質(zhì)、總氮、總硫含量顯著降低［45］，地上部植被生物量也有所降低［46］。本試驗中，土壤總碳、總氮、速效氮含量以及地上部植物多樣性與對照處理相比已經(jīng)無顯著差異(表1，表2)，說明長達14a的封育已基本恢復放牧對植被和土壤的影響。有關(guān)放牧強度對AM真菌群落影響的報道也有很多，然而不同研究者得出的結(jié)論不一。Tian等人［41］對不同退化程度草地AM真菌多樣性進行研究，其結(jié)果表明隨著放牧強度的增加AM真菌多樣性急劇降低。Ba等［47］的研究卻顯示中度放牧區(qū)的物種豐富度及均勻度最高，顯著高于其它放牧強度處理。本試驗AM真菌多樣性指數(shù)和均勻度指數(shù)也是在中度放牧強度下最高，與Ba等的研究結(jié)果吻合，也在特定層面驗證了Connell于1978年提出的中度干擾假說［48］。該假說認為對群落實施中等強度的干擾比頻繁干擾和不干擾群落的物種多樣性要高，而在干擾后群落的恢復過程中，恢復中期物種豐富度最大。中度干擾假說幾乎適應(yīng)于所有生態(tài)系統(tǒng)。Sabatier和Molino［49］對圭亞那地區(qū)熱帶雨林的研究與Lindholm等［50］對奧卡萬戈三角洲地區(qū)浮游生物的研究都表明所研究生態(tài)系統(tǒng)的物種豐富度在中度干擾水平下達到頂峰。不過，也有研究表明并不是所有情況下中度干擾處理物種多樣性均達到最高，物種多樣性也可能在干擾處理下沒有相應(yīng)變化或隨著干擾強度增加而降低［51］，這與干擾方式以及干擾的空間、時間條件有密切相關(guān)。在本研究中，AM真菌多樣性對放牧強度的響應(yīng)符合中度干擾假說，而植物群落生物多樣性并沒有表現(xiàn)出同樣的規(guī)律，這很可能是受到特定時間節(jié)點的影響，不同生物類群對環(huán)境擾動的響應(yīng)是不盡一致的。

本研究結(jié)果表明，圍欄封育14a后梯度放牧草地植被及土壤肥力恢復到對照小區(qū)同一水平，但AM真菌多樣性在不同處理之間仍存在差異。植被與AM真菌群落恢復程度的不同步性提示我們草地生態(tài)系統(tǒng)的退化和恢復是一個地上地下協(xié)同演進的動態(tài)過程，單一研究某一方面或某一節(jié)點都不能反映整體效應(yīng)。今后的研究應(yīng)該將生態(tài)系統(tǒng)地上與地下視為有機整體，把恢復的動態(tài)過程作為研究重點，探索生態(tài)系統(tǒng)地上和地下部分的協(xié)同演替規(guī)律，從而為退化草地的生態(tài)恢復及合理利用提供堅實的理論基礎(chǔ)。

［1］ Gao S Z，Zhao H，Han Z J，Chang W Q.Grassland tourism and sustainable development of grassland.Journal of Agricultural Sciences，2006，27(3):93-96.

［2］ Ye D Z，Chou J F，Liu J Y，Zhang Z X，Wang Y M，Zhou Z J，Ju H B，Huang Q.Causes of sand-stormy weather in Northern China and contral measures.Acta Geographica Sinica，2000，55(5):513-520.

［3］ Green D R.Rangeland restoration projects in western New South Wales.The Australian Rangeland Journal，1989，11(2):110-116.

［4］ Bouchard V，Tessier M，Digaire F，Vivier J P，Valery L，Gloaguen J C，Lefeuvre J C.Sheep grazing as management tool in Western European saltmarshes.Comptes Rendus Biologies，2003，326(S1):148-157.

［5］ Hou F J，Yang Z Y.Effects of grazing of livestock on grassland.Acta Ecologica Sinica，2006，26(1):244-264.

［6］ Wang Y H，He X Y，Zhou G S.Study on the responses of Leymus chinensis Steppe to grazing in Songnen Plain.Acta Agrestia Sinica，2002，10(1):45-49.

［7］ Watt A S.A comparison of grazed and ungrazed grassland a in east anglian breckland.Journal of Ecology，1981，69(2):499-508.

［8］ Jia X N，Cheng J M，Wan H E.Change of species diversity on typical Stipa bungeana community restoration and succession in the Yunwu Mountain.Acta Prataculturae Sinica，2008，17(4):12-18.

［9］ Cheng J，Gao Y J.Variability of soil nutrient in enclosed grassland of Yunwu Mountain.Acta Agrestia Sinica，2007，15(3):273-277.

［10］ Liu R J，Jiao H，Li Y，Li M，Zhu X C.Research advances in species diversity of arbuscular mycorrhizal fungi.Chinese Journal of Applied Ecology，2009，20(9):2301-2307.

［11］ Moora M，Zobel M.Effect of arbuscular mycorrhiza on inter-and intraspecific competition of two grassland species.Oecologia，1996，108(1):79-84.

［12］ Grime J P，Mackey J M L，Hillier S H，Read D J.Floristic diversity in a model system using experimental microcosms.Nature，1987，328(6129):420-422.

［13］ Van der Heijden M G A，Klironomos J N，Ursic M，Moutoglis P，Streitwolf-Engel R，Boller T，Wiemken A，Sanders I R.Mycorrhizal fungal diversity determines plant biodiversity，ecosystem variability and productivity.Nature，1998，396(6707):69-72.

［14］ Dai Y，Deng B，Yang F Y，Zhang Y W.Research progress on biodiversity of arbuscular mycorrhizal fungi in grassland ecosystem.Grassland and Turf，2007，(6):69-72.

［15］ Wu J B，Bao X Y，Li J，Zhao N X，Gao Y B.Influence of fencing duration on community and population of Stipa grandis in a typical steppe.Acta Agrestia Sinica，2010，18(4):490-495.

［16］ Shan G L，Xu Z，Ning F，Ma Y B，Li L H.Influence of exclosure year on community structure and species diversity on a typical steppe.Acta Prataculturae Sinica，2008，17(6):1-8.

［17］ Wardle D A，Bardgett R D，Klironomos J N，Set?l? H，Van der pttten W H，Wall D H.Ecological linkages between aboveground and belowground biota.Science，2004，304(5677):1629-1633.

［18］ Zhou Q，Ou X K，Zhang Z M.Effects of belowground ecosystem on ecological restoration:a review.Chinese Journal of Ecology，2007，26(9):1445-1453.

［19］ Johnson D W，Todd D E，Tolbert V R.Changes in ecosystem carbon and nitrogen in a loblolly pine plantation over the first 18 years.Soil Science Society of America Journal，2003，67(5):1594-1601.

［20］ Viketoft M，Bengtisson J，Sohlenius B，Berg M P，Petchey O，Huss-Danell K.Long-term effects of plant diversity and composition on soil nematode communities in model grasslands.Ecology，2009，90(1):90-99.

［21］ Birkhofer K，Wise D H，Scheu S.Subsidy from the detrital food web，but not microhabitat complexity，affects the role of generalist predators in an aboveground herbivore food web.Oikos，2008，117(4):494-500.

［22］ Fang J Y，Wang X P，Shen Z H，Tang Z Y，He J S，Yu D，Jiang Y，Wang Z H，Zheng C Y，Zhu J L，Guo Z D.Methods and protocols for plant community inventory.Biodiversity Science，2009，17(6):533-548.

［23］ Li Y K.Conventional Analysis Methods of Soil Agricultural Chemistry.Beijing:Science Press，1983.

［24］ Olsen S R，Cole C V，Watanabe F S.Estimation of Available Phosphorus in Soils by Extraction with Sodium Bicarbonate.Washington:USDA Circ，1954:939-939.

［25］ Zhen Z，Li Y，Chen H W.Sulphur determination by vario EL Ⅲ elemental analyzers.Electric Power Science and Engineering，2002，(4):43-45.

［26］ Phillips J M，Hayman D S.Improved procedures for clearing roots and staining parasitic and vesicular-arbuscular mycorrhizal fungi for rapid assessment of infection.Transactions of the British Mycological Society，1970，55(1):158-161.

［27］ Jakobsen I，Abbott L K，Robson A D.External hyphae of vesicular-arbuscular mycorrhizal fungi associated with Trifolium subterraneum L.(1)Spread of hyphae and phosphorus inflow into roots.New Phytologist，1992，120(3):371-380.

［28］ Hamady M，Walker J J，Harris J K，Gold N J，Knight R.Error-correcting barcoded primers for pyrosequencing hundreds of samples in multiplex.Nature Methods，2008，5(3):235-237.

［29］ Daniell T J，Husband R，F(xiàn)itter A H，Young W.Molecular diversity of arbuscular mycorrhizal fungi colonising arable crops.FEMS Microbiology Ecology，2001，36(2/3):203-209.

［30］ Lee J，Lee S，Young J P W.Improved PCR primers for the detection and identification of arbuscular mycorrhizal fungi.FEMS Microbiology Ecology，2008，65(2):339-349.

［31］ ?pik M，Vanatoa A，Vanatoa E，Moora M，Davison J，Kalwij J M，Reier ü，Zobel M.The online database MaarjAM reveals global and ecosystemic distribution patterns in arbuscular mycorrhizal fungi(Glomeromycota).New Phytologist，2010，188(1):223-241.

［32］ Schloss P D，Westcott S L，Ryabin T，Hall J R，Hartmann M，Hollister E B，Lesniewski R A，Oakley B B，Parks D H，Robinson C J，Sahl J W，Stres B，Thallinger G G，Van Horn D J，Weber C F.Introducing mothur:open-source，platform-independent，community-supported software for describing and comparing microbial communities.Applied and Environmental Microbiology，2009，75(23):7534-7541.

［33］ Chao A.Nonparametric estimation of the number of classes in a population.Scandinavian Journal of Statistics，1984，11(4):265-270.

［34］ Luo T X，Liu S.Influence of the intermediate grazing disturbance on the biodiversity of grassland ecosystem.Journal of Anhui Agricultural Sciences，2007，35(21):6567-6568.

［35］ Zhao H L，Okuro T，Li Y L，Zuo X A，Zhou R L.Changes of plant community in grazing and restoration processes in Horqin Sand land，Inner Mongolia.Journal of Desert Research，2009，29(2):229-235.

［36］ Cécile V，Stéphane S，Eléonore A，Katja K，Xavier L R.Grassland management history affects the response of the nematode community to changes in above-ground grazing regime.Nematology，2011，13(8):995-1008.

［37］ Hedlund K，Regina I S，Van der Putten W H，Lep? J，Díaz T，Korthals G W，Lavorel S，Brown V K，Gormsen D，Mortimer S R，Barrueco C R，Roy J，Smilauer P，Smilauerová M，Van Dijk C.Plant species diversity，plant biomass and responses of the soil community on abandoned land across Europe:idiosyncracy or above-belowground time lags.Oikos，2003，103(1):45-58.

［38］ Sanon A，Andrianjaka Z N，Prin Y，Bally R，Thioulouse J，Comte G，Duponnois R.Rhizosphere microbiota interfers with plant-plant interactions.Plant and Soil，2009，321(1/2):259-278.

［39］ Warnecke F，Luginbühl P，Ivanova N，Ghassemian M，Richardson T H，Stege J T，Cayouette M，McHardy A C，Djordjevic G，Aboushadi N，Sorek R，Tringe S G，Podar M，Martin H G，Kunin V，Dalevi D，Madejska J，Kirton E，Platt D，Szeto E，Salamov A，Barry K，Mikhailova N，Kyrpides N C，Matson E G，Ottesen E A，Zhang X N，Hernández M，Murillo C，Acosta L G，Rigoutsos I，Tamayo G，Green B D，Chang C，Rubin E M，Mathur E J，Robertson D E，Hugenholtz P，Leadbetter J R.Metagenomic and functional analysis of hindgut microbiota of a woodfeeding higher termite.Nature，2007，450(7169):560-565.

［40］ ?pik M，Metsis M，Daniell T J，Zobel M，Moora M.Large-scale parallel 454 sequencing reveals host ecological group specificity of arbuscular mycorrhizal fungi in a boreonemoral forest.New Phytologist，2009，184(2):424-437.

［41］ Tian H，Gai J P，Zhang J L，Christie P，Li X L.Arbuscular mycorrhizal fungi in degraded typical steppe of Inner Mongolia.Land Degradation and Development，2009，20(1):41-54.

［42］ Shi Z Y，Zhang L Y，Li X L，F(xiàn)eng G，Tian C Y，Christie P.Diversity of arbuscular mycorrhizal fungi associated with desert ephemerals in plant communities of Junggar Basin，northwest China.Applied Soil Ecology，2007，35(1):10-20.

［43］ Chao A，Colwell R K，Lin C W，Gotelli N J.Sufficient sampling for asymptotic minimum species richness estimators.Ecology，2009，90(4):1125-1133.

［44］ Pi?eiro G，Paruelo J M，Oesterheld M.Potential long-term impacts of livestock introduction on carbon and nitrogen cycling in grasslands of Southern South America.Global Change Biology，2006，12(7):1267-1284.

［45］ Steffens M，K?lbl A，Totsche K U，K?gel-Knabner I.Grazing effects on soil chemical and physical properties in a semiarid steppe of Inner Mongolia(P.R.China).Geoderma，2008，143(1/2):63-72.

［46］ Wan H W，Bai Y F，Sch?nbach P，Gierus M，Taube F.Effects of grazing management system on plant community structure and functioning in a semiarid steppe:scaling from species to community.Plant and Soil，2011，340(1/2):215-226.

［47］ Ba L，Ning J X，Wang D L，F(xiàn)acelli E，F(xiàn)acelli J M，Yang Y N，Zhang L C.The relationship between the diversity of arbuscular mycorrhizal fungi and grazing in a meadow steppe.Plant and Soil，2012，352(1/2):143-156.

［48］ John F F.Intermediate-disturbance hypothesis.Science，1979，204(4399):1344-1345.

［49］ Molino J F，Sabatier D.Tree diversity in tropical rain forests:a validation of the intermediate disturbance hypothesis.Science，2001，294(5547):1702-1704.

［50］ Lindholm M，Hessen D O，Ramberg L.Diversity，dispersal and disturbance:cladoceran species composition in the Okavango Delta.African Zoology，2009，44(1):24-35.

［51］ Haddad N M，Holyoak M，Mata T M，Davies K F，Melbourne B A，Preaton K.Species′traits predict the effects of disturbance and productivity on diversity.Ecology Letters，2008，11(4):348-356.

參考文獻:

［1］ 高生珠，趙宏，韓占軍，常萬琴.草地旅游業(yè)與草地可持續(xù)發(fā)展.農(nóng)業(yè)科學研究，2006，27(3):93-96.

［2］ 葉篤正，丑紀范，劉紀遠，張增祥，王一謀，周自江，鞠洪波，黃簽.關(guān)于我國華北沙塵天氣的成因與治理對策.地理學報，2000，55(5):513-520.

［5］ 侯扶江，楊中藝.放牧對草地的作用.生態(tài)學報，2006，26(1):244-264.

［6］ 王玉輝，何興元，周廣勝.放牧強度對羊草草原的影響.草地學報，2002，10(1):45-49.

［8］ 賈曉妮，程積民，萬惠娥.云霧山本氏針茅草地群落恢復演替過程中的物種多樣性變化動態(tài).草業(yè)學報，2008，17(4):12-18.

［9］ 程杰，高亞軍.云霧山封育草地土壤養(yǎng)分變化特征.草地學報，2007，15(3):273-277.

［10］ 劉潤進，焦惠，李巖，李敏，朱新產(chǎn).叢枝菌根真菌物種多樣性研究進展.應(yīng)用生態(tài)學報，2009，20(9):2301-2307.

［14］ 代艷，鄧波，楊富裕，張?zhí)N薇.草地生態(tài)系統(tǒng)叢枝菌根真菌多樣性研究進展.草原與草坪，2007，(6):69-72.

［15］ 吳建波，包曉影，李潔，趙念席，高玉葆.不同圍封年限對典型草原群落及大針茅種群特征的影響.草地學報，2010，18(4):490-495.

［16］ 單桂蓮，徐柱，寧發(fā)，馬寶玉，李臨杭.圍封年限對典型草原群落結(jié)構(gòu)及物種多樣性的影響.草業(yè)學報，2008，17(6):1-8.

［18］ 周慶，歐曉昆，張志明.地下生態(tài)系統(tǒng)對生態(tài)恢復的影響.生態(tài)學雜志，2007，26(9):1445-1453.

［22］ 方精云，王襄平，沈澤昊，唐志堯，賀金生，于丹，江源，王志恒，鄭成洋，朱江玲，郭兆迪.植物群落清查的主要內(nèi)容、方法和技術(shù)規(guī)范.生物多樣性，2009，17(6):533-548.

［23］ 李酉開.土壤農(nóng)業(yè)化學常規(guī)分析方法.北京:科學出版社，1983.

［25］ 甄志，李宇，陳鴻偉.Vario ELⅢ元素分析儀測硫方法分析.電力科學與工程，2002，(4):43-45.

［34］ 羅天相，劉莎.中度放牧干擾對草地生物多樣性影響的思考.安徽農(nóng)業(yè)科學，2007，35(21):6567-6568.

［35］ 趙哈林，大黑俊哉，李玉霖，左小安，黃剛，周瑞蓮.科爾沁沙質(zhì)草地植物群落的放牧退化及其自然恢復過程.中國沙漠，2009，29(2):229-235.