余涌珠 何冬梅 李江濱 歐嘉文 鄭若洋 陳婉嫦 蔡夢(mèng)珊 林錦瓊

肉桂是樟科植物，樹(shù)皮芳香，可做香料，肉桂的桂皮含有揮發(fā)油，油中主要成分為桂皮醛、少量乙酸桂皮酯，桂皮酸和肉桂醇D1、D2等。肉桂藥用價(jià)值最早載于《神農(nóng)本草藥》，有溫經(jīng)通脈，健脾燥胃，消腫利濕，發(fā)汗解肌之功能[1]，但關(guān)于其抗腫瘤研究少且不夠深入。宮頸癌是全球婦女最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，發(fā)病率居第二位[2]，傳統(tǒng)的放化療治療方法副作用大，目前的研究表明中醫(yī)藥在腫瘤防治中前景廣闊，中藥治療癌癥有高效低毒的優(yōu)點(diǎn)。本次實(shí)驗(yàn)通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)觀察肉桂對(duì)人宮頸癌Hela細(xì)胞生長(zhǎng)的影響。

1 材料與方法

1.1 材料 人宮頸癌Hela細(xì)胞株，由廣東醫(yī)學(xué)院衰老研究所提供。Synergy2多功能酶標(biāo)儀（Biotek），F(xiàn)ACSCanto2流式細(xì)胞儀（美國(guó)BD公司），CO2培養(yǎng)箱（RSBiotech），OLYMPUS XD-101倒置顯微鏡（南京江南永新光學(xué)有限公司），超凈工作臺(tái)（蘇凈集團(tuán)蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司）。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng) 用10%小牛血清DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)Hela細(xì)胞，置于5% CO2，37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.3 藥物配制 取0.5 g肉桂單味中藥顆粒（廣東一方制藥有限公司）加5 ml超純水，高壓滅菌制得濃度為100 mg/ml肉桂水煎液；氟尿嘧啶（5-FU，25 mg/ml，天津金耀氨基酸有限公司）注射液用除菌無(wú)血清培養(yǎng)基稀釋為2.5 mg/ml，備用。

1.4 方法

1.4.1 CCK-8法測(cè)定細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率

1.4.1.1 肉桂抑制腫瘤細(xì)胞增殖的量效作用 采用96孔板，設(shè)高中低3個(gè)劑量肉桂組、5-FU組、對(duì)照組，每組3個(gè)平行孔，每孔加入100μl細(xì)胞懸液（含5×103個(gè)細(xì)胞），待細(xì)胞貼壁完全后，加入5μl藥液，高中低3個(gè)劑量肉桂組終濃度分別為5.0 mg/ml、1.0 mg/ml、0.2 mg/ml的肉桂水煎液，5-FU組終濃度為0.1 mg/ml的5-FU，對(duì)照組加等體積培養(yǎng)液。5% CO2，37 ℃孵育48 h后，按照CCK-8試劑盒說(shuō)明書(shū)操作，酶標(biāo)儀測(cè)吸光值。

1.4.1.2 肉桂抑制腫瘤細(xì)胞增殖的時(shí)效作用 采用96孔板，設(shè)對(duì)照組和肉桂組，每組3個(gè)平行孔，每孔加入100 μl細(xì)胞懸液（含5×103個(gè)細(xì)胞），待細(xì)胞貼壁完全后，加入5 μl藥液，肉桂組終濃度為5.0 mg/ml肉桂水煎液，對(duì)照組加等體積培養(yǎng)液。5% CO2，37 ℃孵育分別12、24、48、72 h后，按照CCK-8試劑盒說(shuō)明書(shū)操作，酶標(biāo)儀測(cè)吸光值。

1.4.2 貼壁率實(shí)驗(yàn) 采用48孔板，設(shè)對(duì)照組和肉桂組（終濃度為5.0 mg/ml肉桂水煎液），每組3個(gè)平行孔，每孔加入200 μl細(xì)胞懸液（含1×104個(gè)細(xì)胞），孵育4 h貼壁后，吸去培養(yǎng)液用 PBS洗2遍后，每孔加入200 μl 培養(yǎng)液和20 μl的CCK-8混合液，37 ℃ 5% CO2孵育1 h后，用酶標(biāo)儀測(cè)每孔的吸光值。

1.4.3 對(duì)細(xì)胞遷移能力的影響 采用劃痕實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)分組同上，按參考文獻(xiàn)[3]進(jìn)行。

1.4.4 FCM測(cè)細(xì)胞周期 實(shí)驗(yàn)分組同上，采用PI染色法，將PI染色的單細(xì)胞懸浮液用流式細(xì)胞儀測(cè)試10 000個(gè)細(xì)胞，進(jìn)行細(xì)胞計(jì)量術(shù)分析，用Wincycle 32軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用SPSS 17.0處理，計(jì)量資料以（±s）表示，采用t檢驗(yàn)。計(jì)數(shù)資料采取字2檢驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)圖像采用Image pro plus 6.0分析處理，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 CCK-8法測(cè)定細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率 肉桂對(duì)腫瘤有明顯抑制作用且隨著藥物濃度的增加而增強(qiáng)。作用48 h后，0.2、1.0、5.0 mg/ml肉桂水煎液的抑制率分別為15.40%、24.58%、97.12%，5-FU組為68.41%。5.0 mg/ml肉桂水煎液作用12 h的細(xì)胞增殖抑制率為57.46%，24 h為88.52%，48 h為95.32%，72 h為95.81%。

2.2 貼壁率結(jié)果 Hela細(xì)胞對(duì)照組的貼壁率為100%，肉桂組的貼壁率為48.3%（P<0.05）。

2.3 對(duì)細(xì)胞遷移能力的影響 細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表1。與對(duì)照組相比，肉桂組的Hela細(xì)胞劃痕間隙恢復(fù)緩慢，說(shuō)明腫瘤細(xì)胞遷移能力顯著下降（P<0.05）。

表1 對(duì)Hela細(xì)胞劃痕間隙的影響（±s） μm

表1 對(duì)Hela細(xì)胞劃痕間隙的影響（±s） μm

*與對(duì)照組比較，P<0.05

組別0 h12 h24 h36 h48 h對(duì)照組472.14±28.75363.30±23.17229.57±25.81120.33±17.0060.18±11.18肉桂組478.04±30.19*456.88±23.12*415.49±19.6*391.73±22.22*364.50±20.6*

2.4 FCM檢測(cè)細(xì)胞周期 對(duì)照組相比，肉桂組G1期比例略降低，S期比例明顯降低，G2期明顯增多。表明肉桂使宮頸癌細(xì)胞主要阻滯在G2期，見(jiàn)表2。

表2 腫瘤細(xì)胞周期變化 %

3 討論

肉桂含有多種有效成分，以往實(shí)驗(yàn)已證實(shí)肉桂中的桂皮醛對(duì)人多種腫瘤細(xì)胞具有殺傷作用，肉桂酸對(duì)人肺腺癌細(xì)胞有誘導(dǎo)分化作用，鄰羥基肉桂酸鍺對(duì)小鼠宮頸癌有抑制作用，肉桂提取物可通過(guò)調(diào)節(jié)CD8+T細(xì)胞抑制腫瘤的生長(zhǎng)[4-6]。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明肉桂能顯著抑制宮頸癌細(xì)胞增殖，且該抑制作用具有量效和時(shí)效作用，并能顯著抑制宮頸癌細(xì)胞的貼壁，降低細(xì)胞遷移能力。細(xì)胞周期結(jié)果顯示肉桂組S期比例明顯降低，G2期明顯增多，說(shuō)明肉桂可能通過(guò)抑制染色體復(fù)制，將宮頸癌細(xì)胞阻滯在G2期。

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