于西佼 唐開(kāi)亮 杜毅

上皮剩余是成熟牙周膜中唯一的上皮結(jié)構(gòu)，上皮剩余的在牙周組織修復(fù)再生、內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定等方面的可能作用已得更多研究人員的重視[1]，但目前對(duì)上皮剩余的研究仍比較匱乏，本文觀察牙周組織發(fā)育期的上皮剩余細(xì)胞形態(tài)分布，研究該期上皮剩余細(xì)胞的增殖、凋亡及OPN和BSP的表達(dá)。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器 原位細(xì)胞凋亡試劑盒（Roche German）；OPN和BSP多克隆抗體由Larry W.Fisher博士（National Institute of Dental and Craniofacial Research，Maryland，USA）饋贈(zèng)；PCNA和Bcl-2單克隆抗體、SP免疫組化試劑盒、DAB顯色劑（北京中杉）；Tris/HCI（Sigma USA），蛋白酶K（MERK German）；OLYMPUS顯微鏡及照相系統(tǒng)（JAPAN）。

1.2 標(biāo)本制備 取出生后第15、19和25天的BALB/c小鼠12只（山東大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心），引頸處死，解剖分離含下頜第一磨牙區(qū)下頜骨，新鮮配置4%多聚甲醛固定、10%EDTA脫鈣2個(gè)月，近遠(yuǎn)中向5 μm連續(xù)切片。HE染色觀察牙周組織的發(fā)育和上皮剩余的分布和細(xì)胞形態(tài)。

1.3 免疫組化 采用SP免疫組化法對(duì)PCNA、Bcl-2、OPN和BSP表達(dá)進(jìn)行免疫組織定位。常規(guī)石蠟切片水化至水，3%H2O2室溫孵育10 min，PBS沖洗，正常山羊血清室溫孵育20 min，傾去血清，滴加的PCNA、Bcl-2、OPN和BSP抗體（均1:100稀釋?zhuān)?7 ℃溫箱孵育2 h。PBS沖洗，滴加生物素化羊抗小鼠IgG，孵育15 min后滴加辣根酶標(biāo)記鏈霉卵白素，滴加DAB液鏡下顯色，蘇木素復(fù)染3 min，常規(guī)脫水、透明封片。

1.4 細(xì)胞凋亡檢測(cè)采用原位末端標(biāo)記（TdT-mediated-dUTP nick end labeling，TUNEL）法，石蠟切片常規(guī)脫蠟水化至水，按照細(xì)胞凋亡原位檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)操作，常規(guī)脫水封片，鏡下觀察照相。以PBS液代替TUNEL反應(yīng)液作陰性對(duì)照。凋亡細(xì)胞陽(yáng)性表達(dá)位于細(xì)胞核，為覆蓋整個(gè)細(xì)胞核的棕黃色或褐色著色。

2 結(jié)果

2.1 HE染色 上皮剩余細(xì)胞靠近牙骨質(zhì)表面呈簇狀分布，主要分布于牙頸部和根分叉，簇內(nèi)細(xì)胞數(shù)量不等，排列無(wú)規(guī)則，相互重疊，部分細(xì)胞界限不清，胞核不規(guī)則呈較強(qiáng)的嗜蘇木精染色（圖1）。

2.2 TUNEL檢測(cè)細(xì)胞凋亡 小鼠出生后第19天，牙槽骨形成活躍，可見(jiàn)較多新生成骨細(xì)胞，牙周膜主纖維斜形埋入頜骨內(nèi)。TUNEL結(jié)果顯示，牙周膜中可見(jiàn)較均勻分布的凋亡陽(yáng)性表達(dá)的成纖維細(xì)胞（圖2）部分成骨細(xì)胞呈凋亡陽(yáng)性表達(dá)，可見(jiàn)觀察到凋亡小體存在。牙根根分叉處的牙周膜牙骨質(zhì)側(cè)可見(jiàn)較多的ERM，部分呈TUNEL陽(yáng)性表達(dá)（圖3）。

2.3 免疫組化 牙周膜牙骨質(zhì)側(cè)的上皮剩余細(xì)胞呈PCNA陰性或弱陽(yáng)性表達(dá)（圖4），大量成纖維細(xì)胞呈PCNA陽(yáng)性表達(dá)；上皮剩余細(xì)胞呈Bcl-2陰性表達(dá)，牙周膜牙槽骨側(cè)Bcl-2陽(yáng)性表達(dá)強(qiáng)于牙周膜牙骨質(zhì)側(cè)（圖5）。OPN的免疫組化結(jié)果示，牙骨質(zhì)與牙周膜界面可見(jiàn)較強(qiáng)的棕黃著色，上皮剩余細(xì)胞呈陽(yáng)性表達(dá)（圖6）。未見(jiàn)ERM細(xì)胞陽(yáng)性表達(dá)BSP。

圖1 上皮剩余呈團(tuán)塊狀，與周?chē)衫w維細(xì)胞分界較明顯。（HE×20）(AL牙槽骨,D牙本質(zhì),OB成骨細(xì)胞,PDL牙周膜)

圖2 調(diào)亡陽(yáng)性表達(dá)細(xì)胞（箭頭）和細(xì)胞凋亡小體（*示）（TUNEL×40）

圖3 上皮剩余細(xì)胞呈凋亡陽(yáng)性表達(dá)（TUNEL×40）

圖4 上皮剩余細(xì)胞呈PCNA陰性表達(dá)，牙周膜中散在陽(yáng)性表達(dá)的細(xì)胞（SP×40）

圖5 上皮剩余呈Bcl-2陰性表達(dá)。牙周膜牙槽骨側(cè)Bcl-2陽(yáng)性表達(dá)強(qiáng)于牙周膜牙骨質(zhì)側(cè)（SP×20）

圖6 上皮剩余細(xì)胞陽(yáng)性表達(dá)OPN（SP×20）

3 討論

上皮根鞘（Hertwig’s epithelial root sheath）的誘導(dǎo)功能結(jié)束后，發(fā)生斷裂，部分上皮細(xì)胞離開(kāi)根面，遷入牙周膜，形成上皮剩余。牙周發(fā)育期牙槽骨改建活躍、牙周膜主纖維走向調(diào)整，上皮根鞘斷裂后最終形成上皮剩余，所以上皮根鞘斷裂后所經(jīng)歷的更新或塑形形成上皮剩余也是牙周組織正常發(fā)育的一部分。本研究結(jié)果表明，牙周組織發(fā)育過(guò)程中，上皮剩余細(xì)胞與牙周組織中的成骨細(xì)胞和成纖維細(xì)胞一樣都可觀察到細(xì)胞凋亡。成熟的牙周組織中的上皮剩余細(xì)胞在受到炎癥等信號(hào)刺激后呈現(xiàn)增殖活性，可參與牙源性囊腫的發(fā)生[2]。牙周組織發(fā)育期上皮剩余細(xì)胞可發(fā)生細(xì)胞凋亡，但我們研究結(jié)果未發(fā)現(xiàn)此時(shí)上皮剩余細(xì)胞出現(xiàn)明顯的增殖活性，提示其可能缺乏相關(guān)刺激因素，從而為表現(xiàn)明顯增殖活性。有研究證實(shí)，伴隨牙齒萌出，建合期在咬合力作用下上皮剩余表現(xiàn)出明顯增殖的活性[3]。

細(xì)胞培養(yǎng)證實(shí)上皮剩余細(xì)胞可分泌前列腺素（prostaglandins）和骨吸收因子（bone resorbing factor），從而認(rèn)為上皮剩余可能有抑制骨性結(jié)合，維持牙周膜間隙的作用[4]。Hasegawa等[5]發(fā)現(xiàn)在牙骨質(zhì)修復(fù)中，上皮剩余細(xì)胞表現(xiàn)PCNA活性，其可能參與牙骨質(zhì)的修復(fù)。OPN和BSP都是骨礦化相關(guān)因子，在骨質(zhì)的形成和礦化中發(fā)揮重要作用，這些骨礦化相關(guān)蛋白可能在牙骨質(zhì)的形成中發(fā)揮一定作用，有研究已證實(shí)OPN在牙骨質(zhì)的形成發(fā)揮重要作用[6]。本研究結(jié)果證實(shí)，牙周發(fā)育期的上皮剩余細(xì)胞也表達(dá)OPN，與他們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果相一致。上皮剩余并不是完全無(wú)用的剩余結(jié)構(gòu)，在某些特定時(shí)期或刺激因素下可表現(xiàn)出積極的生物學(xué)性狀，從而發(fā)揮某些生物學(xué)功能，不過(guò)其機(jī)制有待深入研究。

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