嚴智文 董河 馮偉 牛澤軍 褚海辰 隋愛華

缺血性腦損傷嚴重危害人類健康。在缺血性腦血管病基礎(chǔ)研究中，建立穩(wěn)定、可靠及操作簡便的動物模型是開展各項研究的基礎(chǔ)。目前公認的Pulsinelli[1]大鼠全腦缺血四血管模型是研究多種缺血性腦疾病經(jīng)典模型之一。由于該方法具有可較好地模擬臨床上因低血壓休克、心肺腦復蘇等造成的全腦缺血性損傷過程及易于大宗實驗等優(yōu)點，因此近年來經(jīng)典的Pulsinelli四動脈結(jié)扎法被許多學者所使用[2-3]。但此模型也存在制備復雜，成功率低，儀器設(shè)備昂貴等缺點。參考此法，在保證模型質(zhì)量的前提下，通過反復實踐和摸索，積累了一些經(jīng)驗。本文旨在設(shè)計一種新型簡捷的制作方法，可顯著提高模型制作的成功率及縮短制作時間。

1 材料與方法

1.1 材料 健康成年雄性Wistar大鼠68只（省動物中心提供，許可證號：slxk20080002），體質(zhì)量250~300 g，隨機分為假手術(shù)組8只，傳統(tǒng)模型組及改良模型組各30只。

1.2 模型制作方法

1.2.1 改良組 大鼠用質(zhì)量分數(shù)10%水合氯醛進行腹腔麻醉（3 ml/kg）[4]，俯臥位固定于操作臺上，消毒后剪開頸后正中皮膚約2 cm，沿正中切口鈍性逐層分離組織直到暴露第1頸椎；后再沿第1頸椎斜向內(nèi)上尋找翼孔；翼孔完全顯露后，插入自制燒灼器燒灼翼孔5~6次，2~3 s/次，造成雙側(cè)椎動脈永久閉塞[5]，后消毒縫合組織。再將大鼠仰臥位固定，消毒后切開頸前區(qū)皮膚2 cm，沿氣管兩側(cè)逐步分離暴露雙側(cè)頸動脈鞘，游離雙側(cè)頸總動脈，后置線系活結(jié)，消毒縫合組織，自由飲食。24 h后將大鼠仰臥位固定于操作臺上，于清醒狀態(tài)下拆開頸部縫合線，提取線結(jié)，同時夾閉雙側(cè)頸總動脈；夾閉10 min后松開動脈夾造成復灌，縫合組織自由飲食。

1.2.2 傳統(tǒng)組 大鼠充分顯露翼孔后，磨鉆仔細地沿翼孔表面逐層打磨骨面，直至完全顯露穿行其中的椎動脈，后接雙極電凝器，在顯微鏡直視下用雙極電凝充分燒灼雙側(cè)椎動脈，造成椎動脈永久閉塞，其余步驟同改良組。

1.2.3 假手術(shù)組 大鼠充分暴露翼孔后不燒灼，大鼠游離頸總動脈后不系線，其余步驟同改良組。

1.3 實驗條件 整個實驗過程中用白熾燈照射使大鼠肛溫保持在（37.0±0.5）℃及每批大鼠缺血及復灌都在同一時間。

1.4 觀察指標與方法

1.4.1 生理指征 雙側(cè)頸總動脈夾閉后1 min內(nèi)出現(xiàn)動物意識喪失，眼球變白，雙側(cè)瞳孔對光反射消失，翻正反射消失，自主呼吸加快。實驗過程中凡不符合上述標準或大鼠出現(xiàn)抽搐及死亡視為失敗。

1.4.2 行為學檢測 模型建立7 d后用Morris水迷宮進行大鼠空間定向能力檢測。Morris水迷宮是由圓形水池，自動攝像機及電腦分析系統(tǒng)組成。測試前將水注入池內(nèi)，水深30 cm（即水面高出站臺1 cm，使大鼠看不見站臺），水溫控制在（25±1）℃。T組、I組各隨機選出造模成功的8只大鼠與S組大鼠用于測試。整個測試過程分為兩部分：第1階段為學習階段，第1天訓練先將大鼠放在人工平臺上適應(yīng)1 min，然后讓大鼠自由游泳尋找平臺，120 s內(nèi)未找到平臺者，實驗者將其引至平臺。從第2天起，將大鼠從一個象限的固定位置面向池壁放入水中，讓其進行定向航行尋找平臺。若在120 s內(nèi)未找到平臺，實驗者將大鼠引致平臺停留10 s，記錄尋臺時間，超過120 s按120 s計算。每天上下午固定時間各訓練1次，將兩次尋臺時間的平均值作為當日空間學習測試的成績，共持續(xù)4 d。第2階段為測試階段，即在第5天同一時間撤去平臺，固定位置面向池壁放入大鼠，記錄大鼠第1次跨越平臺的時間即潛伏期，超過120 s按120 s計算。

1.4.3 HE染色 各組大鼠于再灌后相應(yīng)時間取大鼠麻醉后，4%多聚甲醛磷酸鹽緩沖液透心灌注，斷頭后取腦于視交叉后冠狀面1~4 mm之間腦組織，后固定2 h，洗滌4 h，梯度乙醇脫水、二甲苯透明、石蠟包埋。在海馬平面冠狀切片，切片厚5 μm，室溫保存。

1.5 統(tǒng)計學處理 采用SPSS 11.0統(tǒng)計軟件分析，計量資料用（±s）表示，均數(shù)間比較采用單因素方差分析和t檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 大鼠制模成功率、制模時間及儀器費用 在充分預(yù)實驗的基礎(chǔ)上，實驗組大鼠I組大鼠造模成功25只，成功率83%（25/30）；T組大鼠造模成功20只，成功率67%（20/30）；從翼孔完全暴露開始計時，到燒灼椎動脈結(jié)束為止，I組平均燒灼時間約為31 s，T組平均燒灼時間約為612 s，兩組比較差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。T組儀器顯微鏡75萬，磨鉆15萬，電凝器10萬；I組電烙鐵系市場普通電烙鐵，約15元。

2.2 行為學及病理組織學指標判定

2.2.1 Morris水迷宮測試 與S組相比，模型組大鼠學習階段尋臺時間明顯延長，而其記憶測試潛伏期也明顯長于S組，I組與T組比較差異無統(tǒng)計學意義。見表1。

2.2.2 HE染色 海馬組織病理學改變，S組神經(jīng)元結(jié)構(gòu)正常，細胞核圓而規(guī)則，核膜清楚，有明顯的核仁，核膜境界清楚。模型組大量錐體細胞核不規(guī)則并固縮深染，胞漿嗜伊紅，細胞間隙明顯增大，胞漿呈空泡樣變，正常神經(jīng)元數(shù)量顯著減少（圖1）。

表1 各組大鼠Morris水迷宮測試結(jié)果比較（±s） s

表1 各組大鼠Morris水迷宮測試結(jié)果比較（±s） s

*與S組相比，P<0.01；△與前1天時間點相比，P<0.01

組別 第1天 第2天 第3天 第4天 第5天S組 （n=8）106.63±7.7881.38±6.2841.63±6.1925.13±6.0018.63±3.60 T組 （n=8）112.13±6.4590.75±7.42*57.38±6.30*△36.63±6.32*△28.13±5.06*△I組 （n=8）112.75±6.3289.75±6.63*57.13±7.00*△38.13±5.94*△25.75±5.44*△

圖1 各組大鼠海馬區(qū)神經(jīng)元形態(tài)（HE，×200）

3 討論

全腦缺血損傷在臨床實踐中常見，因此全腦缺血再灌注模型的建立是缺血性腦損傷實驗研究的一個重要方法。它比體外或局灶模型能夠更好地模擬臨床中出現(xiàn)的低血壓及心臟驟停等缺血模式，也更符合麻醉手術(shù)中的臨床實際。Pulisinelli等[1]在1979年首先報告了大鼠前腦缺血模型的制備，可在動物清醒狀態(tài)下且不改變?nèi)硌鲃恿W造成大腦缺血而被廣泛重視。1984年Told采用鉆透環(huán)椎翼小孔的方法，充分暴露椎動脈后直視下燒杓椎動脈，其成功率幾乎達100%[6]。

在實際模型建立過程中發(fā)現(xiàn)，雖然參考了Pulsinelli的經(jīng)典方法，但利用該方法制作模型仍存在一些缺點，主要表現(xiàn)在：（1）為閉塞雙側(cè)椎動脈，需要對大鼠第1頸椎內(nèi)后方的翼孔進行研磨以暴露其中穿行的椎動脈進行燒灼；由于翼孔存在變異（有些大鼠開口較小或存在兩個開口），直接燒灼往往不能完全閉塞椎動脈；且翼孔壁薄研磨，鉆透翼小孔極易傷及椎動脈造成大出血而導致模型制作失敗。（2）椎動脈阻斷方法中，電凝法需要手術(shù)顯微鏡和單極電凝，電流不易控制，過低不能燒灼椎動脈，過高則會可損傷腦干，對動物損傷大，還可能電傷操作者[7]；熱凝固法中需要不斷用酒精燈對針進行加熱，如果燒灼動作太慢，熱能散失，反而燒針會粘破椎動脈，引起動物大量失血死亡。（3）經(jīng)典的Pulsinelli 4 d后分離雙側(cè)頸總動脈，實驗周期長，易造成大鼠缺血缺水死亡。針對上述缺點，我們對傳統(tǒng)的4-VO制作大鼠全腦缺血模型的方法進行了改進。首先，采用自制燒灼器直接插入翼孔反復燒灼，無需研磨骨面，儀器制作簡單且損傷小。其次，自制燒灼器可持續(xù)加熱，熱量恒定，避免了熱能散失而粘破椎動脈。再次，在動物存活24 h后夾閉雙側(cè)頸總動脈，從而避免了主觀因素的影響，縮短模型制作的周期。

實驗證明，大腦區(qū)海馬組織對缺血性損傷十分敏感，尤其是CA1區(qū)神經(jīng)元，因此，在全腦缺血模型中，CA1區(qū)神經(jīng)元成為相對獨立于其他腦區(qū)的理想的實驗觀察對象。本實驗結(jié)果顯示，全腦缺血再灌注后大鼠空間學習記憶能力明顯減退。兩側(cè)海馬組織CA1區(qū)出現(xiàn)不同程度的神經(jīng)元核固縮和神經(jīng)細胞丟失。這些行為學和組織病理學的變化證明我們采用的全腦缺血/再灌注損傷大鼠模型的復制是成功的。傳統(tǒng)組及改良組大鼠均成功復制全腦缺血再灌注模型。相比之下，改良組手術(shù)方法成功率高，縮短制模時間，方法簡便可靠，無需特殊儀器，值得推廣。

[1] Pulsineli W A，Brierley J B.A new model of biateral hemispheric ischemia in the unanesthetized rat[J].Stroke，1979，10（3）：267-272.

[2] 張華，任朝勝.大鼠四血管腦缺血模型建立方法的改進[J].鄭州大學學報：醫(yī)學版，2005，40（1）：115-116.

[3] 潘登，譚軍，孫兆印.葛根素預(yù)處理對大鼠腦缺血再灌注損傷后腦組織鈣含量的影響[J].新鄉(xiāng)醫(yī)學院學報，2008，25（3）：210-221.

[4] 陳玲，陳海濱，吳瑩，等.建立大鼠全腦缺血模型的方法與體會[J].汕頭大學醫(yī)學院學報，2000，13（1）：59-60.

[5] 范圣登，王琛，謝紅.Pulsineli四血管大鼠全腦缺血模型制作的改進[J].蘇州大學學報：醫(yī)學版，2003，23（4）：416-417.

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[7] Pulsineli W A，Buchan A M.The four-vessel occlusion of vertebralarteries and control of collateral circulation[J].Stroke，1988，19（7）：913-914.