李冠喜，吳小芹，葉建仁

(1. 南京林業(yè)大學(xué)森林資源與環(huán)境學(xué)院，南京 210037； 2. 連云港市農(nóng)業(yè)科學(xué)院， 連云港 222006；3. 江蘇省有害生物入侵預(yù)防與控制重點實驗室， 南京 210037)

多噬伯克霍爾德氏菌WS-FJ9對草甘膦的降解特性

李冠喜1,2,3，吳小芹1,3,*，葉建仁1,3

(1. 南京林業(yè)大學(xué)森林資源與環(huán)境學(xué)院，南京 210037； 2. 連云港市農(nóng)業(yè)科學(xué)院， 連云港 222006；3. 江蘇省有害生物入侵預(yù)防與控制重點實驗室， 南京 210037)

長期或不當(dāng)施用草甘膦會對非靶標(biāo)生物和環(huán)境造成破壞作用。微生物是生物修復(fù)的重要生物資源，利用微生物及其產(chǎn)生的降解酶處理環(huán)境中有機(jī)磷農(nóng)藥的方法，已顯示出良好的應(yīng)用前景，是近年來研究有機(jī)磷農(nóng)藥降解的主要發(fā)展方向。研究分離松樹根際土壤的高效解磷細(xì)菌多噬伯克霍爾德氏菌(Burkholderiamultivorans)WS-FJ9菌株對草甘膦的降解特性及其降解條件的優(yōu)化。采用添加不同濃度草甘膦NA平板接種WS-FJ9菌株觀察其對草甘膦的耐受性；分別以草甘膦為唯一碳源、氮源或磷源，探討WS-FJ9菌株對草甘膦的利用狀況；采用低進(jìn)水量間歇式反應(yīng)器法(FBR)測定了WS-FJ9菌株降解草甘膦動力學(xué)參數(shù)；利用Plackett-Burman(PB)、Central Composite Design(CCD)試驗設(shè)計及響應(yīng)面分析法(RSM)篩選與優(yōu)化影響WS-FJ9菌株降解草甘膦的主要因素。WS-FJ9菌株有效降解草甘膦的最大耐受濃度為0.4%； WS-FJ9菌株在以草甘膦為唯一碳源、氮源或磷源培養(yǎng)基上均能正常生長；WS-FJ9菌株對草甘膦的親和性常數(shù)(Ks值)為65 μL/mL，對草甘膦降解的極限濃度(Smin)為21.9 μL/mL；通過PB試驗，篩選出3個影響菌株降解草甘膦的關(guān)鍵因素為培養(yǎng)溫度、葡萄糖及硫酸銨的加入量，通過CCD設(shè)計及響應(yīng)面法優(yōu)化分析得到影響草甘膦降解率的關(guān)鍵因素的二階模型，確定了WS-FJ9菌株降解草甘膦的最優(yōu)實驗操作條件為：培養(yǎng)溫度27.7℃，葡萄糖和硫酸銨的加入量分別為0.67、0.50 g/L。實驗條件下WS-FJ9菌株對草甘膦的降解率最高為72.83%。

多噬伯克霍爾德氏菌；降解；草甘膦；優(yōu)化

草甘膦(Glyphosate，簡稱GPA)又稱農(nóng)達(dá)，學(xué)名 N-(膦酸甲基)甘氨酸(C3H8NO5P)，是由美國孟山都公司(Monsanto)開發(fā)的一種有機(jī)磷除草劑，具有內(nèi)吸作用，殺草譜廣，主要用于果園、林地、農(nóng)作物、免耕地等進(jìn)行化學(xué)除草。盡管草甘膦具有高效、低毒、低殘留等特點，但長期或不當(dāng)施用對非靶標(biāo)生物和環(huán)境造成的破壞作用不容忽視[1- 2]。近年來對草甘膦安全性的研究已成為焦點。劉攀[3]研究表明土壤環(huán)境中50%—80%的益蟲死于殘留的草甘膦污染。耿德貴等[4]研究發(fā)現(xiàn)草甘膦能明顯地誘發(fā)黃鱔染色體數(shù)目和結(jié)構(gòu)畸變率上升。鄧曉等[5]研究發(fā)現(xiàn)草甘膦對土壤微生物的種群數(shù)量及土壤中細(xì)菌、放線菌和真菌生長速率均具有一定的抑制作用。Daruich等[6]、Fujii等[7]、Dallegrave等[8]分別以鼠類進(jìn)行了草甘膦的毒性試驗，結(jié)果表明，長期接觸草甘膦可導(dǎo)致妊娠期雌鼠后代的大腦產(chǎn)生多功能性變異，導(dǎo)致胎兒的骨骼無法正常發(fā)育。Poulsen等[9]研究表明草甘膦能夠穿透人類胎盤障礙進(jìn)入胎兒室繼而對人類胎兒的發(fā)育造成傷害。

微生物是生物修復(fù)的重要生物資源，利用微生物及其產(chǎn)生的降解酶處理環(huán)境中有機(jī)磷農(nóng)藥的方法，已顯示出良好的應(yīng)用前景，是近年來研究有機(jī)磷農(nóng)藥降解的主要發(fā)展方向。目前，在我國已有高抗或降解草甘膦的菌株被分離篩選出來[10- 12]，大多屬于假單孢菌屬(Pseudomonas)、節(jié)桿菌屬(Arthrobacter)、腸肝菌科菌(Enterobacteriaceae)、根瘤菌科(Rhizobiaceae)等。多噬伯克霍爾德氏菌(Burkholderiamultivorans)WS-FJ9菌株為本實驗室在前期研究中從松樹根際篩選獲得的1株高效解磷細(xì)菌，前期的研究表明，該菌對哺乳動物安全可靠，具有促進(jìn)植物生長和生物防治的功能。為探討該菌是否具有生物降解農(nóng)藥殘留的功能以及該菌在試驗條件下最大降解率究竟與哪些因素有關(guān)以及這些因素的水平對降解率的影響究竟有多大，為今后深入研究草甘膦降解菌制劑做好前期的準(zhǔn)備工作，本研究采用添加草甘膦的NA平板接種該菌株觀察其對草甘膦的耐受性；分別以草甘膦為唯一碳源、氮源或磷源，探討其對草甘膦的利用狀況；采用低進(jìn)水量間歇式反應(yīng)器法(FBR)測定其降解草甘膦動力學(xué)參數(shù)；在前期對該菌生長特性研究的基礎(chǔ)上，利用Plackett-Burman (PB) 及Central Composite Design (CCD) 試驗設(shè)計對影響其降解草甘膦有關(guān)的8個因素進(jìn)行篩選優(yōu)化。研究結(jié)果可為開發(fā)草甘膦降解菌劑實現(xiàn)農(nóng)藥殘留的生物修復(fù)提供菌種資源和參考依據(jù)，對農(nóng)林業(yè)的可持續(xù)發(fā)展及環(huán)境的保護(hù)具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 供試菌株、草甘膦及降解培養(yǎng)基

供試菌株為多噬伯克霍爾德氏菌(Burkholderiamultivorans)WS-FJ9菌株由本實驗室分離篩選所得，已保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心CCTCC (No. CCTCC M2011435)[13]。供試草甘膦為四川貝爾化工集團(tuán)有限公司生產(chǎn)(含量為30%)。供試降解培養(yǎng)基為唯一磷源(改良蒙金娜有機(jī)磷培養(yǎng)基)、唯一碳源和唯一氮源培養(yǎng)基[12]。

1.2 WS-FJ9菌株對草甘麟的耐受性檢測

將WS-FJ9菌株分別接種于含草甘磷0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%、0.6%、0.7%、0.8%的NA平板上，28℃培養(yǎng)3 d，觀察菌株的生長情況。

1.3 WS-FJ9菌株的唯一碳源、氮源和磷源試驗

將WS-FJ9菌株活化后，用接種環(huán)挑取少量菌體接種于裝有50 mL NB 液體培養(yǎng)基的100 mL三角瓶中，28℃、200 r/min振蕩培養(yǎng)48 h。發(fā)酵液( 4℃，4629×g) 離心5 min，無菌生理鹽水潤洗菌體3次后，無菌生理鹽水調(diào)節(jié)成濃度為1×108cfu/mL的菌懸液。分別將1 mL菌懸液接種于50 mL唯一碳源、唯一氮源和唯一磷源培養(yǎng)基，以不加碳源、氮源、或磷源的培養(yǎng)基為各自空白對照。28℃、200 r/min搖床振蕩培養(yǎng)3 d，離心后上清液采用HWλIOSγ型分光光度計測定600 nm處的吸光度。

1.4 草甘膦降解率的測定

將1 mL菌懸液接種于含50 mL以草甘膦為唯一磷源培養(yǎng)基的100 mL三角瓶中(部分三角瓶中的裝液量按試驗要求進(jìn)行)，28℃、200 r/min搖床振蕩培養(yǎng)3 d后，降解發(fā)酵液轉(zhuǎn)移至50mL離心管中，加入0.5 g無磷活性炭，采用SM- 650D型超聲波細(xì)胞破碎儀進(jìn)行細(xì)胞破碎20 min后離心 (4℃，4629×g) 10 min，取上清液測定無機(jī)磷含量；取5 mL草甘膦降解發(fā)酵液置于凱氏瓶中，加入9 mL的濃硫酸和1 mL高氯酸，用電爐消煮，至消煮液呈現(xiàn)透明，冷卻后調(diào)節(jié)pH值至7.0，再定容至50mL，測定總磷含量。磷含量的測定采用鉬銻抗比色法[14]。草甘膦降解率=(M1-M2)/M1×100%(M1：培養(yǎng)前有機(jī)磷含量；M2：培養(yǎng)后有機(jī)磷含量；有機(jī)磷含量=總磷含量-無機(jī)磷含量)。

1.5 WS-FJ9菌株降解草甘膦動力學(xué)參數(shù)的測定

將WS-FJ9菌株的菌懸液按1%接種量接種到NB液體培養(yǎng)基上28℃、200 r /min振蕩培養(yǎng)3 d后，取2 L發(fā)酵液( 4℃，4629×g) 離心5 min后，菌體用無菌生理鹽水潤洗3次后加入含2 L滅菌的唯一磷源基礎(chǔ)培養(yǎng)基的容器內(nèi)制成生化反應(yīng)器，置于28℃恒溫培養(yǎng)箱中。動力學(xué)參數(shù)測定參照周軍等[15]的方法，采用FBR(低進(jìn)水量間歇式反應(yīng)器)法，草甘膦含量的測定按1.4的方法進(jìn)行，將測定的動力學(xué)參數(shù)用下式計算極限濃度：

式中,Smin為極限濃度(μL/mL)；Ks為細(xì)菌對基質(zhì)的親和性常數(shù)(μL/mL)；ymax為細(xì)菌最大產(chǎn)率系數(shù)(mg/mg)；qmax為最大比基質(zhì)利用速率(d-1)；b為細(xì)菌衰減系數(shù)(d-1)。

1.6 WS-FJ9菌株降解草甘麟PB試驗設(shè)計

選取影響WS-FJ9菌株降解草甘膦的8個因素，采用Plackett-Burman(PB)設(shè)計方案進(jìn)行關(guān)鍵變量的篩選。試驗設(shè)計如表2所示，8個變量分別通過12次實驗進(jìn)行評價分析，每個變量通過兩個水平(低水平-1和高水平+1)來檢測。響應(yīng)值通過降解率來衡量。每個變量的顯著性通過P值和顯著水平確定。

1.7 WS-FJ9菌株降解草甘麟中心復(fù)合試驗及驗證

采用中心復(fù)合試驗設(shè)計(Central Composite Design，CCD)法對由Plackett-Burman篩選出的關(guān)鍵因素進(jìn)行試驗設(shè)計，同時固定其他非關(guān)鍵因素。中心復(fù)合試驗包括含3個關(guān)鍵變量的20組實驗，每個變量包含5個水平(表4)。當(dāng)確定一個關(guān)鍵變量的最優(yōu)水平，可以得到其它兩個變量的等高線圖和三維立體圖，而確定這兩個關(guān)鍵變量的最優(yōu)值?；貧w模型的可信度由決定系數(shù)(R2)進(jìn)行評估。以PB試驗、CCD試驗確定的最佳降解因素，進(jìn)行WS-FJ9菌株降解草甘膦試驗，驗證優(yōu)化方案。

1.8 數(shù)據(jù)分析與處理

采用Office 2003和Design Expert 8.07(Stat-Ease Inc., Minneapolis, USA)軟件進(jìn)行PB、CCD試驗設(shè)計、數(shù)據(jù)差異顯著性檢驗(Plt;0.05)、回歸分析及圖表繪制。

2 結(jié)果與分析

2.1 WS-FJ9菌株對草甘膦的耐受性

NA平板上草甘膦含量從0.1%增加到0.4%的過程中，菌株的生長狀況沒有明顯的變化，均表現(xiàn)為旺盛生長；草甘膦含量繼續(xù)增加，菌株的長勢逐漸減弱；當(dāng)草甘膦達(dá)到0.8%時，菌株不能生長(表1)。表明多噬伯克霍爾德氏菌(Burkholderiamultivorans)WS-FJ9菌株對草甘麟有一定的耐受能力，當(dāng)草甘膦含量為0.4%時，菌株長勢不減弱，說明菌株對草甘膦耐受的最大濃度為0.4%。

表1 多噬伯克霍爾德氏菌WS-FJ9菌株對草甘麟的耐受性

++++：生長旺盛；+++：生長較好；++：生長；+：生長很少；-：不生長

2.2 WS-FJ9菌株在唯一碳源、氮源和磷源培養(yǎng)基上的生長狀況

圖1 多噬伯克霍爾德氏菌WS-FJ9菌株在以草甘膦為唯一碳源、氮源和磷源培養(yǎng)基上的生長狀況Fig.1 The growth status of strain B.multivorans WS-FJ9 on the medium by glyphosate as the only carbon source, the only nitrogen source and the only phosphorus source

WS-FJ9菌株在以草甘膦為唯一碳源、氮源和磷源培養(yǎng)基上均能正常生長。由圖1可知，菌株在以草甘膦為唯一磷源的培養(yǎng)基上生長最好，唯一碳源培養(yǎng)基次之，唯一氮源培養(yǎng)基最差。因此，在后續(xù)試驗中均采用以草甘膦為唯一磷源的培養(yǎng)基。

2.3 WS-FJ9菌株降解草甘膦的動力學(xué)參數(shù)

反應(yīng)器中草甘膦的濃度始終維持在較低的水平，有利于探明微量有機(jī)物污染生物修復(fù)的機(jī)制。測定結(jié)果如下：Ks=65 μL/mL；ymax=0.31 mg/mg；qmax=1.625 d-1；b=0.127 d-1。把測定結(jié)果代入1.5的公式，經(jīng)計算得到B.multivoransWS-FJ9降解草甘膦的極限濃度(Smin)的值為21.9 μL/mL。表明該菌可應(yīng)用于微量有機(jī)物生物高度凈化技術(shù)，對痕量農(nóng)藥的污染治理具有很好的應(yīng)用潛力。

2.4 WS-FJ9菌株降解草甘麟關(guān)鍵影響因素的篩選

Plackett-Burman試驗設(shè)計及結(jié)果見表2。采用Design Expert 8.07軟件對表3中的降解率數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸分析，得到各影響因素的偏回歸系數(shù)(表3)。由表3可看出，X2(初始pH)、X5(葡萄糖)、X6((NH4)2SO4)表現(xiàn)為負(fù)效應(yīng)，而其它因素表現(xiàn)為正效應(yīng)。因素X1(溫度)、X5(葡萄糖)、X6((NH4)2SO4)為主要影響因子，其貢獻(xiàn)值分別為18.85%、39.09%和29.01%，而其他因素對響應(yīng)值降解率為低值影響。經(jīng)影響因素篩選，得到以降解率為響應(yīng)值的線性回歸方程：Y=35.24+3.54X1-4.07X5-35.07X6，方程中Y為預(yù)測的降解率，Xi為變量。方差分析模型的P值為0.0007，決定系數(shù)(R2)為0.8705，調(diào)整系數(shù)(adjR2)為0.8220，變化系數(shù)(CV)為14.30%，精密度為12.570，表明該數(shù)學(xué)模型能較好的表征實驗的實際情況。

2.5 WS-FJ9菌株降解草甘麟關(guān)鍵影響因素CCD試驗結(jié)果及效應(yīng)分析

表2 Plackett-Burman試驗設(shè)計及結(jié)果

X1：溫度，-1為24℃，1為28℃；X2：初始pH值，-1為6.0，1為7.0；X3：接種量，-1為1%，1為5%；X4：100 mL三角瓶裝液量，-1為50 mL，1為75 mL；X5：葡萄糖加入量，-1為10 g/L，1為15 g/L；X6：(NH4)2SO4加入量，-1為0.5g/L，1為1 g/L；X7：轉(zhuǎn)速，-1為160 r/min，1為200 r/min；X8：GPA加入量，-1為0.1%，1為0.4%；X9、X10、X11：虛擬因素

表3 偏回歸系數(shù)及影響因子的顯著性分析

表4 中心組合設(shè)計及結(jié)果

表5 降解率優(yōu)化的模型適配和方差分析結(jié)果

2.6 WS-FJ9菌株降解草甘麟的響應(yīng)面分析及驗證

為進(jìn)一步優(yōu)化多噬伯克霍爾德氏菌(B.multivorans)WS-FJ9菌株對草甘麟的降解率，等高線圖和三維立體圖被用于對實驗數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。它們能更直觀的顯示不同變量以及它們的交互作用對響應(yīng)值的影響。等高線的形狀能夠反應(yīng)交互作用是否顯著。橢圓表示交互作用顯著，而非橢圓則相反。等高線圖(圖2，圖3，圖4)清晰的表明，溫度和葡萄糖加入量的交互作用顯著，而溫度和硫酸銨加入量，以及葡萄糖和硫酸銨加入量之間交互作用不顯著。該結(jié)果和表7中的分析結(jié)果一致，表明這些結(jié)果真實反應(yīng)了不同變量之間的相互作用。圖2顯示硫酸銨加入量在最佳值為0.50 g/L條件下，溫度和葡萄糖加入量對降解率的交互影響；圖3顯示葡萄糖加入量在最佳值為9.67 g/L條件下，溫度和硫酸銨加入量對降解率的交互影響；圖4顯示溫度在最佳值為27.7 ℃條件下，硫酸銨和葡萄糖加入量對降解率的交互影響。由設(shè)計軟件得到WS-FJ9菌株降解草甘麟最優(yōu)條件為：固定其他因素，關(guān)鍵因素蒙金娜基礎(chǔ)培養(yǎng)基中葡萄糖和硫酸銨的加入量分別為9.67、0.50 g/L，溫度控制在27.7 ℃，理論計算草甘麟降解率達(dá)72.83%。按照優(yōu)化后的條件，蒙金娜基礎(chǔ)培養(yǎng)基中葡萄糖和硫酸銨的加入量分別為9.67、0.50 g/L，其他成分按基礎(chǔ)配方，草甘麟加入量0.4%，100 mL三角瓶裝液量50 mL，接種量1%，初始pH7.0，轉(zhuǎn)速200 r/min，溫度控制在27.7 ℃。3 d后實測草甘膦降解率為71.98%，與預(yù)測值72.83%較接近，證明了WS-FJ9菌株降解草甘麟優(yōu)化處理時PB和CCD方法聯(lián)用的可行性和準(zhǔn)確性。

2.選擇素材。打開Photoshop軟件，點擊“文件——打開”，選擇我們要處理的圖片。此時圖片1的圖層處于鎖定狀態(tài)（如圖2所示）。

3 結(jié)論和討論

近年來，利用微生物的降解功能處理環(huán)境中的草甘膦污染越來越受到人們的重視，將草甘膦降解菌制成生物菌劑用于草甘膦環(huán)境污染的生物修復(fù)已成為國內(nèi)外研究熱點。目前國內(nèi)外已開發(fā)出的一系列處理草甘膦廢水的工業(yè)方法[16- 18]的應(yīng)用都存在一定的局限性，主要是施工量大、設(shè)備成本高、而且處理結(jié)果不理想易造成二次污染等。利用高效降解微生物來降解工業(yè)廢水中的草甘膦具有處理方便、快捷、迅速，成本相對低廉等優(yōu)點。

圖2 溫度和葡萄糖加入量對草甘膦降解率交互影響的三維曲面圖和等高線圖Fig.2 Surface and contour plots of mutual effect for temperature and glucose quantity on the degradation rate of glyphosate

圖3 溫度和硫酸銨加入量對草甘膦降解率交互影響的三維曲面圖和等高線圖Fig.3 Surface and contour plots of mutual effect for temperature and ammonium sulfate quantity on the degradation rate of glyphosate

圖4 葡萄糖和硫酸銨加入量對草甘膦降解率交互影響的三維曲面圖和等高線圖Fig.4 Surface and contour plots of mutual effect for glucose and ammonium sulfate quantity on the degradation rate of glyphosate

本研究采用添加草甘膦的NA平板接種多噬伯克霍爾德氏菌(Burkholderiamultivorans)WS-FJ9菌株，結(jié)果表明該菌對草甘膦具有較高耐受性(耐受濃度達(dá)0.4%)，可以應(yīng)用于高含量草甘膦污染的治理。據(jù)報道，草甘膦在其生產(chǎn)廢水池中的含量在0.1%—1%之間，在長期使用草甘膦地區(qū)的地表水中的含量在0.009%—0.86%之間，不同地區(qū)草甘膦的含量不同是因其還與雨水徑流及水流路徑有關(guān)[19- 21]。因此，該菌可用于草甘膦生產(chǎn)廢水的治理，同時由于該菌在以草甘膦為唯一碳源、唯一氮源或唯一磷源的培養(yǎng)基上均能正常生長，這將有利于在草甘膦污染的治理過程中進(jìn)一步降低成本。

近年研究發(fā)現(xiàn)，許多化學(xué)物質(zhì)即使在很低的濃度下對人體和生態(tài)環(huán)境仍然產(chǎn)生很大的危害，生物高度凈化技術(shù)成為新的研究熱點。該技術(shù)的理論關(guān)鍵點在于生物降解極限濃度(Smin)和基質(zhì)親和性常數(shù)(Ks)[22- 23]，認(rèn)為在低基質(zhì)濃度情況下，降解速率同基質(zhì)的濃度成正比關(guān)系，當(dāng)基質(zhì)濃度降至某一值時，微生物的生長速率與死亡速率達(dá)到了動態(tài)平衡，此時的濃度即為極限濃度(Smin)；在微量化學(xué)物質(zhì)高度凈化過程中，凈化速率主要取決于微生物對基質(zhì)的親和性，Ks越低親和性就越好，凈化速率也就越高，而常量化學(xué)物質(zhì)的一般凈化主要取決于微生物的增殖量[24]。周軍等[15]經(jīng)過試驗測定了苯胺的各降解動力學(xué)參數(shù)，其Smin和Ks值分別為0.025 mg/L和0.077 mg/L。本研究所測定的Smin和Ks值分別為65 μL/mL 和21.9 μL/mL，因此，WS-FJ9菌株可應(yīng)用于痕量污染(農(nóng)田及各種低草甘膦含量污染的水體)的治理，是生物高度凈化技術(shù)中極有應(yīng)用潛力的菌株。

微生物通過馴化篩選可以增強(qiáng)某一特定功能。湯鳴強(qiáng)等[10]采用培養(yǎng)基中添加不同濃度梯度的草甘膦對從耕作土壤中分離到草甘膦降解菌進(jìn)行馴化培養(yǎng)與篩選，獲得一株對草甘膦具有高耐受性、高降解能力的菌株膠紅酵母RhodotorulamucilaginosaZM- 1 (降解率為85.38%)。本研究所采用的B.multivoransWS-FJ9適應(yīng)能力強(qiáng)，耐受力已達(dá)0.4%草甘膦含量的濃度。如果進(jìn)行定向馴化篩選，相信其對草甘膦的耐受性及降解能力會有較大的提高，這有待于進(jìn)一步研究。另外，本研究采用PB和CCD試驗設(shè)計連用及RSM分析法進(jìn)行了實驗條件優(yōu)化，相對于傳統(tǒng)的單因素實驗和正交實驗，具有試驗次數(shù)少、周期短，求得的回歸方程精度高等優(yōu)點，并能通過圖形分析較直觀地尋求最優(yōu)考察因素值、確定試驗因素及其交互作用在試驗過程中對指標(biāo)響應(yīng)值的影響[25]。

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ThecharacterizationofglyphosatedegradationbyBurkholderiamultivoransWS-FJ9

LI Guanxi1,2,3， WU Xiaoqin1,3,*，YE Jianren1,3

1CollegeofForestResourcesandEnvironmentNanjingForestryUniversity,Nanjing210037,China2LianyungangMunicipalAcademyofAgriculturalSciences,Lianyungang222006,China3JiangsuKeyLaboratoryforPreventionandManagementofInvasiveSpecies,Nanjing210037,China

Long-term or inappropriate use of glyphosate may damage the non-target organisms and environment. Microbes are important biological resources for bioremediation. In recent years, the method of using microbes and its catabolic enzymes to remediate organophosphorus pesticides in the environment has shown a promising potential in application. It is the main direction of research on organophosphorus pesticide degradation. This study aimed to investigate the degradation of glyphosate by an efficient phosphate solubilizing bacteriumBurkholderia.multivoransWS-FJ9 which was isolated from pine rhizosphere. Strain WS-FJ9 was grown on the plates of nutrient agar (NA) with different concentrations of glyphosate to determine the tolerance of strain WS-F19 to glyphosate. Glyphosate can be used by strain WS-FJ9 as the sole sources of carbon, nitrogen and phosphorus, respectively. The degradation dynamical parameters of strain WS-FJ9 on glyphosate were determined using low flooding quantity batch reactor method (FBR). Plackett-Burman (PB) design, central composite design (CCD), and Response Surface Methodology (RSM) were employed to screen and optimize the main factors of strain WS-FJ9 degrading glyphosate. The maximum concentration of tolerance to glyphosate for strain WS-FJ9 to remain efficiently degrading glyphosate was 0.4%. The affinity constant (Ks) of strain WS-FJ9 to glyphosate was 65 μL/mL and the minimal concentration (Smin) of glyphosate degraded by WS-FJ9 was 21.9 μL/mL. Three key factors (cultural temperature，glucose and ammonium sulfate) for the glyphosate degradation by strain WS-FJ9 were selected using PB design. The quadratic model for the three significant factors was established using CCD design and RSM with glyphosate degradation rate as the target response. Under the optimal degradation conditions, the incubation temperature was 27.7℃, and the amount of glucose and ammonium sulfate supplemented were 9.67 g/L and 0.50 g/L, respectively. The degradation rate of glyphosate by strain WS-FJ9 reached 72.83%.

Burkholderiamultivorans; degradation; glyphosate; optimization

國家林業(yè)公益性行業(yè)科研專項(201004061)；江蘇省普通高校研究生科研創(chuàng)新計劃(CXLX11- 0552)；江蘇高校優(yōu)勢學(xué)科建設(shè)工程(PAPD)資助項目

2013- 02- 25;

2013- 07- 08

*通訊作者Corresponding author.E-mail: xqwu@njfu.edu.cn

10.5846/stxb201302250296

李冠喜，吳小芹，葉建仁.多噬伯克霍爾德氏菌WS-FJ9對草甘膦的降解特性.生態(tài)學(xué)報,2013,33(21):6885- 6894.

Li G X， Wu X Q，Ye J R.The characterization of glyphosate degradation byBurkholderiamultivoransWS-FJ9.Acta Ecologica Sinica,2013,33(21):6885- 6894.