潘雪刁，何 冰，王桂香，劉金泳，曹成明，臧林泉，，3

肺癌是世界上發(fā)病率和死亡率最高的惡性腫瘤之一［1］，化學(xué)藥物治療是肺癌綜合治療主要措施之一，然而多數(shù)肺癌患者確診時(shí)已為晚期，預(yù)后較差，常規(guī)以鉑類藥物為基礎(chǔ)的細(xì)胞毒性化療已無(wú)法進(jìn)一步提升晚期肺癌患者的生存率，因此開(kāi)發(fā)新型抗肺癌藥物是當(dāng)前腫瘤界學(xué)者努力探索研究的熱點(diǎn)之一［2-4］。

近年來(lái)興起的腫瘤導(dǎo)向治療，即借助高度特異性的親腫瘤物質(zhì)作為載體攜帶藥物對(duì)腫瘤部位進(jìn)行靶向給藥，穩(wěn)定發(fā)揮殺傷作用，成為腫瘤治療的新途徑［5，6］。小分子多肽是一種理想的抗腫瘤靶向性藥物載體，具有結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，容易制備，對(duì)腫瘤組織穿透力強(qiáng)，無(wú)免疫原性的優(yōu)點(diǎn)。噬菌體展示技術(shù)能夠快速擴(kuò)增、富集所篩選出的正常、腫瘤差異表達(dá)的scfv抗體或多肽配體，已被廣泛應(yīng)用于腫瘤標(biāo)志物的篩選研究中，亦成為腫瘤靶向治療研究的熱點(diǎn)之一［7-10］。本文利用噬菌體隨機(jī)肽庫(kù)篩選技術(shù)，對(duì)肺癌NCI-H1299細(xì)胞進(jìn)行減性篩選，獲得具肺癌靶向性的多肽ZS-5，為肺癌的靶向治療和診斷奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 多肽 FITC標(biāo)記的多肽ZS-5(FITC-ZS-5)由北京中科亞光生物技術(shù)有限公司合成，經(jīng)HPLC純化和質(zhì)譜鑒定，合成多肽純度＞95%。

1.1.2 細(xì)胞株 人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞NCI-H1299和A549、人胚肺細(xì)胞MRC-5和WI-38、人結(jié)腸癌細(xì)胞HT-29、人肝癌細(xì)胞BEL-7402和HepG2、人正常肝細(xì)胞LO2均購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)。

1.1.3 組織切片 肺癌組織和正常肺組織由中山大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院胸科王軍業(yè)副教授提供。

1.1.4 主要試劑 噬菌體隨機(jī)12肽庫(kù)(Ph.D-12TM Phage Display Peptide Library，文庫(kù)滴度為1.5×1016pfu·L－1，復(fù)雜度為2.7 ×109)購(gòu)自 New England Biolabs公司;HRP/anti-M13 antibody購(gòu)自Amersham Biosciences公司;胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)、DMEM、MEM、McCOY's 5A 和 RPMI-1640培養(yǎng)基、購(gòu)自Gibco公司;DAB試劑盒購(gòu)自北京中杉公司;IPTG、X-gal、TMB等購(gòu)自北京鼎國(guó)生物技術(shù)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 噬菌體隨機(jī)12肽庫(kù)的全細(xì)胞減性篩選NCI-H1299細(xì)胞用含10%FBS的DMEM培養(yǎng)液，MRC-5細(xì)胞用含 10%FBS的 MEM培養(yǎng)液，于37℃、0.05 CO2、0.95 O2細(xì)胞培養(yǎng)箱中常規(guī)傳代培養(yǎng)。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，以105個(gè)/皿的密度接種于60 mm×15 mm的培養(yǎng)皿中，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，吸去NCI-H1299細(xì)胞舊培養(yǎng)液，換為無(wú)血清DMEM培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)2 h，再加入0.5%BSA 37℃封閉1 h后，加入滴度約為1.5×1011pfu的噬菌體肽庫(kù)，37℃ 孵育1 h，棄上清，用0.1%PBST洗6次后，加入pH 2.2的甘氨酸洗脫緩沖液1 ml洗脫，以pH 9.1的Tris-HCl中和。再將洗脫液與MRC-5細(xì)胞進(jìn)行篩選后，獲得第1輪篩選噬菌體，感染宿主菌ER2738，取20 μl測(cè)滴度，擴(kuò)增后取1.5 ×1011pfu 投入下一輪的篩選。第2、3輪篩選中，洗滌液Tween-20濃度分別提高至0.5%、1%，與NCI-H1299細(xì)胞孵育時(shí)間分別減少到45、30 min，洗滌次數(shù)分別增加至8、10次。測(cè)定第3輪篩選所獲得的噬菌體滴度后，在IPTG/X-gal瓊脂平板上隨機(jī)挑取藍(lán)色噬菌斑，制備噬菌體原種用于鑒定。富集率以下列公式計(jì)算:富集率/%=洗脫噬菌體pfu數(shù)/投入噬菌體pfu數(shù)×100%。

1.2.2 ELISA法鑒定陽(yáng)性噬菌體克隆 經(jīng)過(guò)3輪減性篩選后，隨機(jī)挑取20個(gè)噬菌體克隆，ELISA法初步鑒定各克隆對(duì)NCI-H1299細(xì)胞的親和力。將NCI-H1299、MRC-5細(xì)胞按1 ×104/孔的密度接種于96孔板中，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，無(wú)血清處理2 h，4%多聚甲醛固定 20 min，用 PBS洗3次;加入 0.1%Triton-X100處理10 min，PBST洗3次;2%PBS-BSA封閉1 h，洗滌后加入各噬菌體克隆，滴度約1012pfu，37℃ 孵育2 h，PBST洗3次;加入 HRP-antiM13抗體(2%PBS-BSA 1∶5 000稀釋)，37℃孵育1 h，PBST洗3次;加入TMB顯色液，室溫避光靜置20 min，用 HCl終止反應(yīng)，在酶標(biāo)儀450 nm處測(cè)吸光度(A)值。以隨機(jī)挑取的噬菌體原庫(kù)藍(lán)斑作為對(duì)照。實(shí)驗(yàn)設(shè)3個(gè)復(fù)孔，重復(fù)6次。親和力以下列公式 計(jì) 算:親 和 力 =［NCI-H1299(OD克?。璒D隨機(jī)對(duì)照克隆)］/［MRC-5(OD克?。璒D隨機(jī)對(duì)照克隆)］。

1.2.3 陽(yáng)性克隆Phage ZS-5的DNA測(cè)序及多肽的合成 擴(kuò)增陽(yáng)性克隆Phage ZS-5并提取質(zhì)粒，由上海英俊生物技術(shù)有限公司進(jìn)行DNA測(cè)序并推導(dǎo)出外源12肽的氨基酸序列，測(cè)序引物為:5'-CCC TCA TAG TTA GCG TAA CG-3'。由北京中科亞光生物技術(shù)有限公司化學(xué)合成該12肽并標(biāo)記FITC，即FITCZS-5。

1.2.4 FITC-ZS-5的細(xì)胞免疫熒光鑒定 取處于生長(zhǎng)對(duì)數(shù)期的 A549、NCI-H1299、MRC-5、WI-38、HT-29、BEL-7402、HepG2 和 LO2 細(xì)胞，以 1 ×104/孔的密度接種于96孔板中，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，無(wú)血清處理1 h后，加入4%多聚甲醛固定20 min，0.1%Triton-X100處理10 min，PBST洗3次;2%PBS-BSA封閉1 h 后，加入 FITC-ZS-5 溶液100 μl，濃度為25 μmol·L－1，4℃孵育過(guò)夜后，PBS洗6次，熒光倒置顯微鏡下觀察并拍照，激發(fā)波長(zhǎng)為490 nm。

1.2.5 FITC-ZS-5的組織免疫熒光鑒定 取肺癌組織和正常肺組織的切片，65℃ 烤片1 h，經(jīng)二甲苯和乙醇脫蠟處理后，以95℃預(yù)熱的0.01 mmol·L－1檸檬酸鈉緩沖液(pH 6.0)加熱20 min修復(fù)抗原，10%BSA封閉1 h后，PBS洗滌3次，加入濃度為25 μmol·L－1的 FITC-ZS-5 溶液 100 μl，4℃ 過(guò)夜，PBS洗6次，熒光倒置顯微鏡下觀察并拍照，激發(fā)波長(zhǎng)為490 nm。

1.2.6 統(tǒng)計(jì)分析 應(yīng)用SPSS 11.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均以±s表示，組間比較采用t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 與NCI-H1299細(xì)胞特異結(jié)合的噬菌體克隆的富集 在篩選過(guò)程中，每次投入的噬菌體量均為1.5×1011pfu，而回收噬菌體的滴度由第1輪的4.8×103pfu增加到第3輪篩選后的2.5×106pfu，增加了520倍，富集率由第1輪的3.2×10－6增至第3輪篩選后的1.7×10－3，見(jiàn)Tab 1。此結(jié)果表明，經(jīng)過(guò)3輪“吸附-洗脫-擴(kuò)增”減性篩選后，與 NCIH1299細(xì)胞結(jié)合的噬菌體克隆得到有效的富集。

Tab 1 Subtraction biopanning effect on enrichment of phage clones

2.2 與NCI-H1299細(xì)胞特異結(jié)合的噬菌體克隆的鑒定 ELISA結(jié)果顯示，隨機(jī)挑取的20個(gè)噬菌體克隆對(duì)NCI-H1299細(xì)胞有較好的親和力，以5號(hào)克隆效果最為明顯(P＜0.01)，將其命名為 Phage ZS-5，見(jiàn)Fig 1。

Fig 1 Evaluation of the affinity of phage clones toNCI-H1299 cell by cell-ELISA±s，n=6)

2.3 Phage ZS-5的DNA測(cè)序結(jié)果及多肽的合成

由DNA測(cè)序結(jié)果推導(dǎo)出Phage ZS-5所表達(dá)的多肽序列由1個(gè) Ala、2 個(gè) His、1 個(gè) Arg、1 個(gè) Pro、1 個(gè)Ile、2 個(gè) Ser、1 個(gè) Phe、2 個(gè) Leu、1 個(gè) Thr氨基酸組成，把該12肽命名為ZS-5。生物信息學(xué)分析結(jié)果顯示ZS-5多肽序列與美國(guó)國(guó)立生物技術(shù)信息中心GenBank DNA序列數(shù)據(jù)庫(kù)和Swiss-Prot蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)中的已知基因和蛋白無(wú)同源性，國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)也未見(jiàn)報(bào)道，表明篩選到一全新的肺癌細(xì)胞表面相關(guān)抗原的配體。為進(jìn)一步研究 ZS-5對(duì)肺癌細(xì)胞是否具有親和力和特異性，委托北京中科亞光生物技術(shù)有限公司化學(xué)合成 FITC標(biāo)記的 ZS-5，經(jīng) HPLC純化和質(zhì)譜鑒定，F(xiàn)ITC-ZS-5的純度＞95%。

2.4 FITC-ZS-5的細(xì)胞免疫熒光鑒定 與 FITCZS-5孵育過(guò)夜后，熒光倒置顯微鏡下觀察可見(jiàn):肺癌NCI-H1299細(xì)胞(A)綠色熒光最強(qiáng)，A549細(xì)胞(B)也可見(jiàn)綠色熒光，而 WI-38細(xì)胞(C)、MRC-5細(xì)胞(D)、HT-29細(xì)胞(E)、BEL-7402 細(xì)胞(F)、HepG2細(xì)胞(G)、LO2細(xì)胞(H)均未見(jiàn)明顯綠色熒光，見(jiàn)Fig 2。此結(jié)果表明FITC-ZS-5對(duì)肺癌細(xì)胞具有高親和力和特異性。

2.5 FITC-ZS-5的組織免疫熒光鑒定 與FITCZS-5孵育過(guò)夜后，熒光倒置顯微鏡下觀察可見(jiàn):人肺鱗癌組織(A)和人肺腺癌組織(B)呈現(xiàn)綠色熒光，而正常肺組織(C)未見(jiàn)明顯綠色熒光，見(jiàn) Fig 3。此結(jié)果表明FITC-ZS-5對(duì)肺癌組織具有高親和力和特異性。

3 討論

肺癌目前的治療方法主要是手術(shù)、放療和化療，雖然可以增加患者的存活率，但放療和化療都存在較大的毒副作用，而腫瘤靶向性治療既能降低毒副作用、減少用藥量，又可提高藥物的療效。篩選與腫瘤特異性結(jié)合多肽已成為實(shí)現(xiàn)靶向治療腫瘤的熱點(diǎn)之一，并取得了一定的成果。

噬菌體展示技術(shù)是一種有效的藥物靶點(diǎn)篩選工具，它可以將外源蛋白或多肽呈現(xiàn)在噬菌體表面，利用外源蛋白或多肽與待篩選靶分子的特異性親和作用，通過(guò)吸附－洗脫－擴(kuò)增的篩選富集過(guò)程，將表達(dá)與靶分子特異性結(jié)合的外源蛋白或多肽的噬菌體大量富集，然后通過(guò)測(cè)序分析即可得到與靶分子特異性結(jié)合的外源蛋白或多肽，且在不知道受體分子任何結(jié)構(gòu)信息的情況下，對(duì)于納摩爾級(jí)的靶分子亦能篩選出具有高親合力的配體，是一種高效、快捷的篩選體系［11－12］。

以全細(xì)胞作為靶分子是噬菌體展示肽庫(kù)篩選中最為常用的方法，其優(yōu)點(diǎn)是即使不能預(yù)知腫瘤細(xì)胞表面的特異性分子，也能夠獲得與腫瘤細(xì)胞特異性結(jié)合的多肽，因此，本研究以肺癌 NCI-H1299細(xì)胞為靶細(xì)胞，人胚肺細(xì)胞 MRC-5為吸附細(xì)胞，對(duì)噬菌體隨機(jī)12肽庫(kù)進(jìn)行了3輪全細(xì)胞減性篩選。篩選過(guò)程中，我們保持了每輪噬菌體投入量，采用MRC-5為吸附細(xì)胞，逐輪增強(qiáng)洗滌力度，減少與靶細(xì)胞NCI-H1299孵育時(shí)間，以避免篩選到與肺正常細(xì)胞結(jié)合的噬菌體，使陽(yáng)性噬菌體克隆得到有效的富集。我們進(jìn)一步擴(kuò)增經(jīng)ELISA鑒定具有高親和力的陽(yáng)性噬菌體克隆進(jìn)行DNA測(cè)序，生物信息學(xué)分析結(jié)果顯示該多肽序列與美國(guó)國(guó)立生物技術(shù)信息中心(NCBI)GenBank DNA序列數(shù)據(jù)庫(kù)和Swiss-Prot蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)中的已知基因和蛋白無(wú)同源性，國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)均未見(jiàn)報(bào)道，這表明了我們已經(jīng)篩選到新的肺癌表面相關(guān)抗原的配體，我們根據(jù)測(cè)序結(jié)果推導(dǎo)出的氨基酸序列化學(xué)合成該多肽并標(biāo)記FITC，進(jìn)一步鑒定了FITC-ZS-5對(duì)肺癌細(xì)胞、肺癌組織的親和力和特異性，細(xì)胞和組織免疫熒光結(jié)果均顯示多肽ZS-5在肺癌組織中的表達(dá)量明顯高于正常肺組織對(duì)照組，表明其具有明顯的肺癌組織特異性，有望成為肺癌靶向治療的藥物載體，也為進(jìn)一步尋找新的肺癌標(biāo)志物奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)，我們將進(jìn)一步利用該肺癌靶向性多肽為“釣餌”工具，“釣出”位于腫瘤細(xì)胞表面或血清中的腫瘤標(biāo)志物。

Fig 2 Binding specificity of FITC-ZS-5 to lung cancer cells analyzed by immunofluorescence(200×)

Fig 3 Bingding specificity of FITC-ZS-5 to lung cancer tissue analyzed by immuno-fluorescence(100×)

［1］ Jemal A，Bray F，Center M M，et al.Global cancer statistics［J］.CA Cancer J Clin，2011，61(2):69 －90.

［2］ 虞永峰，陸 舜.表皮生長(zhǎng)因子受體和血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體之外肺癌靶向治療新進(jìn)展［J］.腫瘤，2010，30(8):706－10.

［2］ Yu Y F，Lu S.Targeted therapies for lung cancer beyond anti-epidermal growth factor receptors and anti-vascular endothelial cell growth factor receptors:exploring a new frontier［J］.Tumor，2010，30(8):706 －10.

［3］ 潘 峰，田 靜，張旭超，潘躍銀.舒尼替尼對(duì)EGFR TKI抵抗的A549細(xì)胞株增殖抑制作用及機(jī)制研究［J］.中國(guó)藥理學(xué)通報(bào)，2011，27(8):1121－5.

［3］ Pan F，Tian J，Zhang X C，Pan Y Y.Inhibitory effect of sunitinib on EGFR TKI-resistant human non-small cell lung cancer cell line A549 and its mechanism ［J］.Chin Pharmacol Bull，2011，27(8):1121－5.

［4］ 張 濤，單 利，張東明.分子靶向藥物應(yīng)用于非小細(xì)胞肺癌維持治療的研究進(jìn)展［J］.中國(guó)肺癌雜志，2010，13(11):1070－3.

［4］ Zhang T，Shan L，Zhang D M.Advances of molecular targeted drugs used in maintenance therapy of non-small cell lung cancer［J］.Chin J Lung Cancer，2010，13(11):1070 －3.

［5］ 王 健，王秀問(wèn)，王亞偉，等.奧曲肽紫杉醇偶聯(lián)物靶向治療小細(xì)胞肺癌的實(shí)驗(yàn)研究［J］.山東大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版)，2011，49(3):27－32.

［5］ Wang J，Wang X W，Wang Y W，et al.Paclitaxel-octreotide conjugates inhibit growth of human small cell lung cancer cells［J］.J Shandong Univ(Health Sci)，2011，49(3):27－32.

［6］ 張曉艷，孫立新，容 雁，等.功能性單克隆抗體40E11靶向治療肺癌的實(shí)驗(yàn)研究［J］.中華腫瘤防治雜志，2012，19(6):401－5.

［6］ Zhang X Y，Sun L X，Rong Y，et al.Targeting therapy of lung cancer using functional monoclonal antibody 40E11［J］.Chin J Cancer Prev Treat，2012，19(6):401 －5.

［7］ Goenaga A L，Zhou Y，Legay C，et al.Identification and characterization of tumor antigens by using antibody phage display and intrabody strategies［J］.Mol Immunol，2007，44(15):3777 －88.

［8］ Elayadi A N，Samli K N，Prudkin L，et al.A peptide selected by biopanning identifies the integrin alphavbeta6 as a prognostic biomarker for nonsmall cell lung cancer［J］.Cancer Res，2007，67(12):5889－95.

［9］ Sergeeva A，Kolonin M G，Molldrem1 J J，et al.Display technologies:application for the discovery of drug and gene delivery agents［J］.Adv Drug Deliv Rev，2006，58(15):1622 －54.

［10］張 旭，彭 健，王順偉，等.噬菌體隨機(jī)肽庫(kù)對(duì)肝癌細(xì)胞特異性結(jié)合短肽的篩選及鑒定［J］.第四軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào)，2008，29(17):1544－7.

［10］ Zhang X，Peng J，Wang S W，et al.Screening and identification of hepatocellular carcinoma cell specific binding peptides using phage display peptide library［J］.J Fourth Mil Med Univ，2008，29(17):1544－7.

［11］ Scott J K，Smith G P.Searching for peptide ligands with an epitope library［J］.Science，1990，249(4967):386 －90.

［12］丁 寧，肖 慧，高 巨，等.晚期糖基化終產(chǎn)物受體胞外段的原核表達(dá)及其相互作用蛋白的篩選［J］.中國(guó)藥理學(xué)通報(bào)，2009，25(4):492 －6.

［12］ Ding N，Xiao H，Gao J，et al.Prokaryotic expression of receptor for advanced glycation end product and screening of its interaction proteins［J］.Chin Pharmacol Bull，2009，25(4):492 － 6.