王麗麗 ，林 婧 ，蔡巧燕 ，詹友知 ，陳達(dá)鑫 ，彭 軍

（1.福建中醫(yī)藥大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合研究院，福建 福州350122；2.福建省中西醫(yī)結(jié)合老年性疾病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建 福州350122）

原發(fā)性肝細(xì)胞癌（Hepatocellular carcinoma，HCC，簡稱肝癌）是最常見的原發(fā)性肝腫瘤，發(fā)病率居全球惡性腫瘤的第5位，病死率居第3位［1］。白花蛇舌草為茜草科植物白花蛇舌草（Hedyotis diffusa Willd，HDW）的全草，其主要化學(xué)成分有熊果酸、免疫多糖、烏索酸、白花蛇舌草素等，具有增強(qiáng)免疫活性、抗氧化和抗腫瘤活性，現(xiàn)廣泛用于治療各種炎癥和腫瘤［2-6］。白花蛇舌草揮發(fā)油主要成分為十六酸，亞油酸，9-十八碳烯酸，龍腦，6，10，14-三甲基-2-十五烷酮，4-乙烯基-2-甲氧基苯酚等［7-8］。目前國內(nèi)外均未見其抗腫瘤活性的相關(guān)報(bào)道。本文對白花蛇舌草揮發(fā)油對肝癌HepG2細(xì)胞活性進(jìn)行了研究，為其臨床應(yīng)用提供依據(jù)。

1 材 料

1.1 材料與細(xì)胞株 白花蛇舌草購自福建中醫(yī)藥大學(xué)國醫(yī)堂；肝癌HepG2細(xì)胞細(xì)胞株均購自上海中科院細(xì)胞庫。

1.2 試劑 DMEM培養(yǎng)基、胰蛋白酶、胎牛血清購自Hyclone公司；MTT購自Sigma公司。

1.3 主要儀器 CO2培養(yǎng)箱（Heal Force），ELX800酶標(biāo)儀（BioTek），IX70熒光倒置相差顯微鏡（Olympus）。

2 方 法

2.1 白花蛇舌草揮發(fā)油的制備 取白花蛇舌草樣品200 g，粉碎成粗粉，過40目篩，稱量200 g，加入2 000 mL水，浸泡10 h，按《中華人民共和國藥典》2005年版附錄揮發(fā)油測定法，回流提取6 h，采用乙醚做吸收溶劑，乙醚用量為5 mL，得揮發(fā)性成分乙醚提取液，加入無水硫酸鈉，得無水揮發(fā)油（0.09%），得到的油用DMSO超聲溶解，配置成200 mg／mL溶液，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2 細(xì)胞培養(yǎng) HepG2細(xì)胞經(jīng)含10%胎牛血清DMEM 培養(yǎng)基（含 100 U／mL青霉素和 100 μg／mL鏈霉素）培養(yǎng)，置37℃，5%CO2培養(yǎng)箱進(jìn)行傳代培養(yǎng)。

2.3 MTT法檢測細(xì)胞活力 取對數(shù)生長期細(xì)胞，進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，HepG2以4×105個／mL接種于96孔板中，接種體積為 100 μL／孔，置 37℃，5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，至細(xì)胞貼壁，且覆蓋率達(dá)60%時，分別加入62.5、125、250、500、1 000 μg／mL 的白花蛇舌草揮發(fā)油，24 h后吸取各孔溶液，每孔加入100 μL的0.5 mg／mL MTT 溶液，37℃培養(yǎng) 4 h。4 h后，小心吸去孔內(nèi)液體。往每孔內(nèi)加入100 μL DMSO，振蕩10 min后，在570 nm處測OD值。計(jì)算細(xì)胞活力，方程如下：

細(xì)胞活力（%）＝［實(shí)驗(yàn)組A值／對照組A值］×100%。

2.4 細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察 人肝癌細(xì)胞HepG2經(jīng)不同濃度的白花蛇舌草揮發(fā)油提取物干預(yù)24 h后，置于倒置顯微鏡下觀察，并拍照。

2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 所有數(shù)據(jù)應(yīng)用Excel 2003和DPS v6.55軟件進(jìn)行分析處理，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用表示，組間比較采用單因素方差分析。

3 結(jié) 果

3.1 白花蛇舌草揮發(fā)油提取物對HepG2細(xì)胞活力的影響 白花蛇舌草揮發(fā)油提取物對肝癌HepG2細(xì)胞生長存在明顯的抑制作用，并且隨濃度的加大而增大，與空白組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。IC50值為 369.3 μg／mL，結(jié)果見圖 1。

圖1 白花蛇舌草揮發(fā)油提取物對HepG2細(xì)胞活力的影響

3.2 白花蛇舌草揮發(fā)油提取物對HepG2細(xì)胞形態(tài)的影響 在倒置顯微鏡下觀察可以看出：對照組的HepG2細(xì)胞生長良好，主要以近圓形和梭型2種形態(tài)存在，核仁清晰，胞質(zhì)均勻，細(xì)胞舒展拉伸。而隨著給藥劑量的增加，懸浮的死細(xì)胞數(shù)量增多，貼壁細(xì)胞數(shù)量則顯著下降，細(xì)胞形態(tài)發(fā)生明顯變化，胞質(zhì)、核仁逐漸固縮，細(xì)胞體積變小，變圓，在顯微鏡下可看到胞內(nèi)空泡變多。結(jié)果表明：白花蛇舌草揮發(fā)油對人肝癌細(xì)胞HepG2的生長有明顯的抑制作用且呈現(xiàn)顯著的劑量依賴性，見圖2。

圖2 白花蛇舌草揮發(fā)油對HepG2細(xì)胞形態(tài)的影響（200×）

4 討 論

肝癌與胃癌、肺癌等其它實(shí)體瘤有明顯的不同，肝功能惡化和肝硬化的合并癥一直是肝癌患者的主要死因之一。因此，在肝癌的治療過程中，必須保護(hù)肝功能和機(jī)體的免疫機(jī)制［9］，但是目前的抗腫瘤藥物的毒副作用大而且容易產(chǎn)生耐藥性，因而治療效果不理想。天然中藥具有療效廣泛，毒副作用相對較小，作用效果明顯等優(yōu)勢［10-12］。揮發(fā)油成分多是小分子物質(zhì)，能被機(jī)體快速吸收，作用廣泛，且多具芳香開竅、引藥上行的功用，在心腦血管系統(tǒng)、中樞神經(jīng)系統(tǒng)、呼吸系統(tǒng)、胃腸道系統(tǒng)、抗菌、抗炎、抗癌、抗病毒、促進(jìn)藥物吸收等多方面都具有功效。

白花蛇舌草為茜草科植物白花蛇舌草的全草，具有增強(qiáng)免疫活性、抗氧化和抗腫瘤活性，現(xiàn)廣泛用于治療各種炎癥和腫瘤［13－14］。其揮發(fā)油主要成分為十六酸，亞油酸，9-十八碳烯酸，龍腦，6，10，14-三甲基-2-十五烷酮，4-乙烯基-2-甲氧基苯酚等。本研究采用白花蛇舌草的揮發(fā)油，探討其對人肝癌HepG2細(xì)胞的影響。研究發(fā)現(xiàn)，白花蛇舌草揮發(fā)油干預(yù)后，人肝癌HepG2細(xì)胞密度明顯減少，細(xì)胞變小，且對HepG2細(xì)胞的細(xì)胞活力也有顯著的抑制作用，并呈現(xiàn)明顯的劑量依賴性，表明白花蛇舌草揮發(fā)油對人肝癌HepG2細(xì)胞有明顯的抑制作用。

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