魏 彩，秦宜德，鄭 欣，何曉光，張文曉，楊浩然

(安徽醫(yī)科大學(xué)生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室，安徽 合肥 230032)

卵巢癌是女性生殖器官常見的腫瘤之一，盡管發(fā)病率低于子宮頸癌和子宮體癌而列居第三位，但因卵巢癌致死者，卻占各類婦科腫瘤的首位［1］。目前發(fā)病早期的手術(shù)切除依然是根治卵巢癌的主要方法，但術(shù)后也極易復(fù)發(fā)。雖然手術(shù)方式和化療方案的選擇都有些進(jìn)展，但是卵巢癌的治療并無實(shí)質(zhì)性的突破。順鉑(cisplatin，cis-diaminodichloroplatinum，DDP)是目前臨床上治療卵巢癌的一線化療藥物，因其抗腫瘤效果確切，且新的鉑類抗腫瘤藥物雖然毒副作用略低于順鉑，但價(jià)格昂貴，藥效也不能夠完全替代順鉑等原因，臨床仍將其作為一線藥物［2］。然而順鉑有巨大的腎毒性、耳毒性等毒副作用也是不爭(zhēng)的事實(shí)。那么尋找高效、低毒、價(jià)廉的替代藥物是研究人員面臨的又一新的課題。

乳源生物活性肽是乳蛋白經(jīng)消化酶的作用后釋放的一種肽，機(jī)體可以直接吸收，在免疫、代謝等諸多方面對(duì)生物體有調(diào)節(jié)作用［3－4］。且一些乳源生物活性肽還具有抗癌作用，顯示在癌癥治療方面有廣闊的前景［5－6］。本實(shí)驗(yàn)所用免疫調(diào)節(jié)肽是從牛酪蛋白酶解產(chǎn)物中分離出的六肽(Pro-Gly-Pro-Ile-Pro-Asn，PGPIPN)位于β-酪蛋白的63～68殘基上，是較具代表性的免疫調(diào)節(jié)肽［7－9］。

本實(shí)驗(yàn)室前期研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，PGPIPN可以抑制卵巢癌細(xì)胞SKOV3細(xì)胞的生長(zhǎng)并誘導(dǎo)其凋亡［10］。然而對(duì)PGPIPN是否有抗人卵巢癌細(xì)胞侵襲和遷移的能力，尚未見到資料報(bào)道。本研究旨在探究乳源免疫調(diào)節(jié)肽對(duì)人卵巢癌細(xì)胞侵襲和遷移的作用，并與傳統(tǒng)抗癌藥物－順鉑進(jìn)行比較。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞株 人卵巢癌細(xì)胞株(人卵巢漿液性乳頭狀囊腺癌，SKOV3)，人正常肝細(xì)胞株(LO2)，小鼠永生化成纖維細(xì)胞株(MEFS)由本實(shí)驗(yàn)室留存。

1.1.2 材料、藥品 乳源免疫調(diào)節(jié)肽(PGPIPN)由上海生工公司合成，純度為0.99以上。RPMI 1640細(xì)胞培養(yǎng)基購(gòu)自Gibco-BRL公司，小牛血清購(gòu)自杭州四季青公司，順鉑注射液購(gòu)自江蘇豪森藥業(yè)公司，人工重建基底膜材料Matrigel為BD公司產(chǎn)品，孔徑為8 μm的Transwell小室為Coster公司產(chǎn)品。常規(guī)生物化學(xué)試劑購(gòu)自上海生工生物技術(shù)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 藥品配制 順鉑注射液原藥濃度為5.0 g·L－1，使用前用1 ml的注射器抽取0.1 ml用無血清的培養(yǎng)基稀釋成0.5 g·L－1，剩余藥液4℃冷藏。乳源免疫調(diào)節(jié)肽用無血清的培養(yǎng)基稀釋成1.0 g·L－1，0.22 μm 濾膜過濾，5 ml EP 管分成小包裝，－20℃以便長(zhǎng)期保存。

1.2.2 細(xì)胞培養(yǎng) 細(xì)胞株 SKOV3、LO2和 MEFS均用RPMI 1640培養(yǎng)液培養(yǎng)，待生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)期后用2.5 g·L－1胰蛋白酶消化傳代，進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.3 Transwell小室侵襲實(shí)驗(yàn) 將 Matrigel用不含小牛血清的培養(yǎng)液以1∶4稀釋，取60 μl滴入Transwell小室底部膜，輕輕搖晃使其將底膜覆蓋完全，在無菌環(huán)境中使其自然風(fēng)干。接著加入含2 g·L－1BSA的無血清RPMI 1640培養(yǎng)液40 μl潤(rùn)濕20 min。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，消化、離心后加入不含小牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基。細(xì)胞計(jì)數(shù)使每毫升約3×105個(gè)，取200 μl懸液加入細(xì)胞小室的上室，下室加入500 μl含小牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液，下層培養(yǎng)液和小室間避免有氣泡產(chǎn)生，并觀察Transwell小室膜的完好性。每組3個(gè)復(fù)孔，培養(yǎng)，分別于24、30、36 h時(shí)取出上室，并輕輕擦去小室內(nèi)側(cè)細(xì)胞，甲醛固定2 min，蘇木精染色10 min，水洗，伊紅染色10秒，水洗，剪下底層膜，于載玻片上用中性樹脂固定，顯微鏡下觀察細(xì)胞侵襲率，選定最佳培養(yǎng)時(shí)間。正式實(shí)驗(yàn)時(shí)，同樣取200 μl細(xì)胞懸液分別加在24孔Transwell小室的上室，設(shè)定好PGPIPN組、順鉑做陽性對(duì)照組加入不同濃度的藥物，并在空白對(duì)照組再加入與藥物同體積的不含小牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液，培養(yǎng)。于最佳培養(yǎng)時(shí)間時(shí)取出，與之前實(shí)驗(yàn)一樣，最后用顯微鏡觀察，選5個(gè)視野計(jì)數(shù)、拍照。

侵襲抑制率/%=(1－實(shí)驗(yàn)組侵襲細(xì)胞數(shù)/對(duì)照組侵襲細(xì)胞數(shù))×100%

1.2.4 細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn) 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞按每孔5×104個(gè)細(xì)胞數(shù)加入12孔培養(yǎng)板中，過夜，待細(xì)胞完全貼壁后，用200 μl的移液器槍頭，在12孔培養(yǎng)板每孔的中央在縱軸方向劃線。用PBS洗細(xì)胞2次，去除刮起的漂浮細(xì)胞，加入含或不含藥物的無血清培養(yǎng)基，放入培養(yǎng)箱培養(yǎng)，在0、12、24 h分別于倒置相差顯微鏡下觀察并拍照。實(shí)驗(yàn)用Photoshop 7.0軟件對(duì)細(xì)胞的遷移距離進(jìn)行測(cè)量，分別測(cè)5條線的寬度，取其平均值。實(shí)驗(yàn)設(shè)無用藥對(duì)照組和各種不同濃度PGPIPN的實(shí)驗(yàn)組，以及順鉑做陽性對(duì)照組，每組5個(gè)復(fù)孔。

遷移抑制率/%=(1－實(shí)驗(yàn)組遷移距離/對(duì)照組遷移距離)×100%

1.2.5 克隆形成實(shí)驗(yàn) 細(xì)胞生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)期時(shí)，以2.5 g·L－1胰蛋白酶消化、制備含體積分?jǐn)?shù)為0.1的小牛血清的單細(xì)胞懸液，細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)活細(xì)胞數(shù)。調(diào)整細(xì)胞密度，使每孔500 μl，分別接種每孔1 500、1 000、750、500、250、100 個(gè)細(xì)胞于 12 孔培養(yǎng)板中。十字搖勻，每個(gè)濃度設(shè)5個(gè)平行樣本，隔2 d換新鮮含藥培養(yǎng)液，培養(yǎng)10 d，計(jì)數(shù)克隆形成率。繼續(xù)培養(yǎng)至12 d觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況。選取最佳細(xì)胞個(gè)數(shù)，繼續(xù)PGPIPN組以及順鉑做陽性對(duì)照組的同樣的實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，選取培養(yǎng)后的細(xì)胞計(jì)數(shù)＞30個(gè)細(xì)胞的克隆，計(jì)算克隆抑制率。

用藥組克隆抑制率/%=1－(用藥組形成的克隆數(shù)/空白對(duì)照組形成的克隆數(shù))×100%

1.2.6 MTT法檢測(cè)PGPIPN的細(xì)胞毒性 用2.5 g·L－1胰蛋白酶消化并收集處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的SKOV3細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度，接種至96孔培養(yǎng)板中，每孔100 μl，置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜。次日，等大部分細(xì)胞貼壁后，每孔分別加入不同濃度的PGPIPN，以順鉑做為陽性對(duì)照，每孔100 μl，每一濃度設(shè)5個(gè)復(fù)孔;空白對(duì)照組加入等體積的培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)24、48、72 h。每孔加入 MTT 液(5.0 g·L－1)20 μl，繼續(xù)培養(yǎng) 4 h，吸棄上清液，每孔加入 DMSO 100 μl，振蕩混勻 10 min，在酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀上于490 nm波長(zhǎng)處檢測(cè)每孔的吸光度(D)值，計(jì)算5個(gè)孔的均值。按以下公式計(jì)算細(xì)胞死亡率(inhibition percentage，IR):

另用正常人肝細(xì)胞LO2，正常小鼠成纖維細(xì)胞MEFS以同樣的方法做為對(duì)照。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 13.0軟件對(duì)結(jié)果進(jìn)行分析，計(jì)量資以±s表示，各組間均數(shù)比較采用配對(duì)資料的t檢驗(yàn)并進(jìn)行分析。

2 結(jié)果

2.1 Transwell法實(shí)驗(yàn)PGPIPN對(duì)SKOV3侵襲能力的影響 不同濃度PGPIPN對(duì)SKOV3侵襲能力的影響，見Fig 1～4。在未加藥時(shí)，接種同種數(shù)量的細(xì)胞(2×105)在24、30、36 h時(shí)穿過小室的情況如下:在24 h時(shí)細(xì)胞穿過小室膜的數(shù)量較少，30 h時(shí)細(xì)胞穿過小室的數(shù)量明顯增多，36 h時(shí)細(xì)胞的數(shù)量雖然有所增加，但已不如前者明顯，說明細(xì)胞已基本全部通過小室膜。所以實(shí)驗(yàn)選取培養(yǎng)30 h作為最佳實(shí)驗(yàn)時(shí)間。結(jié)果可知(Fig 4)，與空白組相比，PGPIPN在 0.1、1、10 mg·L－1時(shí)對(duì)細(xì)胞的侵襲有明顯抑制作用(P＜0.01)，尤其在 10 mg·L－1，抑制率達(dá)到23.78%。但其抑制效果不及同濃度的順鉑組。

2.2 細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)測(cè)定PGPIPN對(duì)SKOV3運(yùn)動(dòng)能力的影響 運(yùn)用細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)不同濃度PGPIPN處理SKOV30、12、24 h后對(duì)細(xì)胞遷移的影響，實(shí)驗(yàn)用Photoshop 7.0軟件對(duì)細(xì)胞的遷移距離進(jìn)行測(cè)量，分別測(cè)5條線的寬度，取其平均值，結(jié)果見Fig 5和Tab 1。根據(jù)結(jié)果，PGPIPN能明顯抑制卵巢癌細(xì)胞的遷移，而且有劑量依賴性。其中在PGPIPN作用24h，與對(duì)照組相比，10mg·L－1的PGPIPN抑制率達(dá)到56.24%，即使在低濃度0.1 mg·L－1時(shí)抑制率也有40.40%，其抑制效果略低于順鉑。

Fig 1 Effect of SKOV3cell migration ability for 24 h in transwell chamber model(×100)

Tab 1 Effect of SKOV3cell migration ability at different time points in cell scratch assay(±s，n=5)

Tab 1 Effect of SKOV3cell migration ability at different time points in cell scratch assay(±s，n=5)

*P＜0.05，＊＊P＜0.01 vs negative control

group Dose/mg·L－1 Migration distance/cm 12 h 24 h Inhibitory percentage/%12 h 24 h Negative control － 1.92 ±0.08 5.05±0.19 － －PGPIPN 0.1 1.69 ±0.08 3.01±0.13 11.98 ±0.66* 40.40 ±1.78＊＊1 1.33 ±0.07 2.53±0.08 30.73 ±1.78＊＊49.90 ±1.92＊＊10 1.03 ±0.06 2.21±0.09 46.35 ±1.91＊＊56.24 ±1.93＊＊Positive control 0.1 1.02 ±0.02 1.81±0.03 41.67 ±2.01＊＊64.16 ±2.06＊＊(DDP) 1 0.70 ±0.02 1.12±0.03 63.54 ±2.23＊＊77.82 ±2.33＊＊

2.3 細(xì)胞克隆形成實(shí)驗(yàn)測(cè)定PGPIPN對(duì)SKOV3細(xì)胞增殖能力、侵襲性的影響 分別為1 000、750、500、250個(gè)細(xì)胞接種后克隆率分別為12.23%、7.91%、6.29%、4.75%，各組克隆形成率差異均有顯著性(P＜0.05)，見Fig 6。接種每孔100個(gè)細(xì)胞的一組未見明顯的細(xì)胞克隆形成，接種每孔1 500個(gè)細(xì)胞的一組細(xì)胞均已融合，難以分辨形成的克隆，接種每孔1 000個(gè)者克隆形成率最高，所以實(shí)驗(yàn)選取接種每孔1 000個(gè)細(xì)胞。如Fig 7所示為不同濃度的PGPIPN作用于細(xì)胞后克隆形成情況。

2.4 MTT法測(cè)定PGPIPN對(duì)SKOV3細(xì)胞的毒性試驗(yàn) 運(yùn)用MTT法檢測(cè)不同濃度PGPIPN、DDP處理 SKOV3、LO2 、MEFS，24、48、72 h 后對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的影響。PGPIPN在高濃度下對(duì)SKOV3細(xì)胞的生長(zhǎng)具有較強(qiáng)的抑制作用，同時(shí)對(duì)LO2、MEFS細(xì)胞的影響無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。DDP對(duì)SKOV3細(xì)胞的生長(zhǎng)有抑制作用的同時(shí)，對(duì)LO2、MEFS細(xì)胞的影響也較大。如Tab 2所示為不同濃度的PGPIPN、DDP分別對(duì)SKOV3、LO2、MEFS 細(xì)胞生長(zhǎng)的影響。

Fig 2 Effect of SKOV3cell migration ability for 30 h in transwell chamber model(×100)

3 討論

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，人卵巢癌SKOV3細(xì)胞株經(jīng)PGPIPN作用后，其侵襲和轉(zhuǎn)移能力明顯降低，且濃度越高則降低作用越明顯。Transwell法中，30 h時(shí)PGPIPN組的10 mg·L－1抑制率為23.78%，在劃痕試驗(yàn)、細(xì)胞克隆試驗(yàn)中均發(fā)現(xiàn)有明顯的抑制作用。MTT實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，PGPIPN對(duì)SKOV3具有明顯的抑制作用，這與李素萍等［10］的實(shí)驗(yàn)結(jié)果相一致，同時(shí)PGPIPN對(duì)正常人肝細(xì)胞LO2，小鼠永生化成纖維細(xì)胞株MEFS的生長(zhǎng)無抑制作用，且PGPIPN對(duì)LO2的生長(zhǎng)似乎有促進(jìn)作用，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

腫瘤轉(zhuǎn)移包括諸多環(huán)節(jié)，如何穿越生物學(xué)屏障是腫瘤細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移動(dòng)態(tài)過程的關(guān)鍵步驟［11］。

Tab 2The effect of SKOV3cell grow ability in MTT assay(±s，n=5)

Tab 2The effect of SKOV3cell grow ability in MTT assay(±s，n=5)

*P＜0.05，＊＊P＜0.01 vs negative control

group Dose/mg·L－1 SKOV3inhibitory percentage/%24 h 48 h 72 h LO2 inhibitory percentage/%24 h 48 h 72 h MEFS inhibitory percentage/%24 h 48 h 72 h Negative control－－－－－－－－－－0.001 3.48 ±2.11 5.47±3.12 8.29 ±3.99 －0.37±0.32 1.78 ±1.31 －1.11 ±0.97 0.57 ±0.50 1.78 ±1.43 1.56 ±1.33 0.01 5.34 ±2.92 8.67±3.29 13.85 ±3.41＊＊ 2.66±2.33 －0.93 ±0.84 1.24 ±1.07 1.34 ±1.22 0.45 ±0.43 1.78 ±1.74 PGPIPN 0.1 10.22±2.61* 13.24 ±3.18＊＊ 20.27±3.37＊＊ 1.23 ±1.39 0.56±0.42 0.23±0.22 1.89±1.54 1.23±1.21 2.56±2.52 1 16.44±2.23＊＊ 23.37±3.19＊＊ 27.54±3.89＊＊ －0.56±0.51 1.22±1.21 －0.56±0.47 1.13±1.11 1.27±1.20 0.34±0.46 10 20.91±2.35＊＊ 30.23±2.67＊＊ 32.36±3.11＊＊ 1.89±1.52 －1.13±1.01 －1.89±1.54 0.23±0.21 1.89±1.57 0.88±0.92 Positive control 0.01 12.23±2.77＊＊ 28.09±2.43＊＊ 32.34±3.31＊＊ 10.28±3.34* 21.03±3.78＊＊ 30.52±3.23＊＊ 9.93±2.89* 23.34±2.37＊＊ 29.89±3.20＊＊(DDP) 0.1 21.13±2.67＊＊ 43.49±3.45＊＊ 48.26±3.56＊＊ 18.56±3.45＊＊41.29±3.06＊＊ 47.53±3.53＊＊22.45±2.33＊＊ 44.34±4.43＊＊ 48.56±3.41＊＊1 33.56±2.93＊＊ 54.23±4.32＊＊ 65.22±3.67＊＊ 31.03±3.30＊＊53.66±3.78＊＊ 65.11±3.57＊＊31.79±2.72＊＊ 49.53±3.79＊＊ 61.23±4.22＊＊10 44.35±3.31＊＊ 64.76±3.76＊＊ 79.89±4.32＊＊ 45.48±3.43＊＊59.57±4.03＊＊ 76.76±3.50＊＊41.76±2.99＊＊ 61.45±3.44＊＊ 78.89±4.57＊＊

其中，細(xì)胞外基質(zhì)(extracellularmatrixc，ECM)是腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移的天然屏障，ECM的降解是腫瘤轉(zhuǎn)移的一個(gè)關(guān)鍵步驟［12］。腫瘤細(xì)胞所具有的遷移性、分泌各種水解酶、黏附性等特點(diǎn)都與ECM密不可分。在腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生并分泌多種水解酶中，包括各種蛋白水解酶，這些水解酶可破壞ECM。另外，腫瘤細(xì)胞的黏附性是與其產(chǎn)生的黏附分子有關(guān)，各種黏附分子皆為細(xì)胞表面的跨膜糖蛋白，能夠與同種或異種黏附分子相結(jié)合并產(chǎn)生一定的生物學(xué)效應(yīng)。因此，PGPIPN抑制癌細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移的可能機(jī)制:PGPIPN作為一種信號(hào)分子與腫瘤細(xì)胞受體結(jié)合，通過影響相關(guān)蛋白質(zhì)或酶的含量和/或活性，從而影響細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移行為，具體機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。

Fig 3 Effect of SKOV3cell migration ability for 36 h in transwell chamber model(×100)

Fig 4 Effect of SKOV3cell migration ability in transwell chamber model

在實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，同濃度的順鉑組對(duì)SKOV3的抑制率均比PGPIPN組的高，同時(shí)也發(fā)現(xiàn)順鉑對(duì)正常

Fig 5 Effect of SKOV3cell migration ability at different time points in cell scratch assay (×100)

Fig 6 Clonogenic effect diagram (×100)

Fig 7 Effect of SKOV3cell colony formation ability in colony experiment

在實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，同濃度的順鉑組對(duì)SKOV3的抑制率均比PGPIPN組的高，同時(shí)也發(fā)現(xiàn)順鉑對(duì)正常細(xì)胞LO2和MEFS同樣具有很高的抑制作用。所以，PGPIPN雖不如順鉑的作用明顯，但是PGPIPN來源于乳，對(duì)抗癌細(xì)胞的同時(shí)，對(duì)正常細(xì)胞無損害也是其一大優(yōu)勢(shì)，這在MTT實(shí)驗(yàn)中可以得到證實(shí);其次，PGPIPN原料來源廣泛，一旦研制出大規(guī)模生產(chǎn)的方法，可以大大降低成本，能夠?yàn)槟[瘤患者減輕經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。

PGPIPN對(duì)卵巢癌細(xì)胞株SKOV3的侵襲和轉(zhuǎn)移的作用在本實(shí)驗(yàn)中得到證實(shí)，加之其他人員的研究結(jié)果可知PGPIPN有望成為抗腫瘤家族中的新成員。同時(shí)，如果大規(guī)模生產(chǎn)的方法能夠早日實(shí)現(xiàn)，那么將會(huì)為腫瘤患者帶來更大的福音。

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