蘇 玲, 李雨婷, 王再林, 宋 慧, 杜 金, 吳宗翰， 張中北

(吉林農業(yè)大學 生命科學學院, 長春 130118)

糖類物質與蛋白質和核酸均為參與生命活動的生物大分子, 不僅提供能量物質(如糖原和淀粉)與細胞內的支撐物(如纖維素和果膠)[1], 還參與介導炎癥反應的發(fā)生, 影響細胞的生長、 分裂、 分化及細胞間的信號轉導[2]. 由于多糖分子極性大, 利用氣相色譜和核磁共振等不易直接對其進行測定； 且自身無發(fā)光基團, 不能采用紫外吸收光譜和熒光吸收光譜進行檢測； 并受生物體自身內源性多糖的干擾, 因此多糖在生物體內代謝、 細胞中定位以及與細胞的識別位點等方面的研究較少. 文獻[3-4]對多糖進行了熒光標記; 文獻[5]對樹舌(Ganodermaapplanatum)多糖進行了研究. 本文選擇已被證實具有抗腫瘤和調節(jié)機體免疫功能[6-7]的工廠化生產的樹舌靈芝液體深層發(fā)酵浸膏多糖作為實驗材料, 將其進行熒光標記, 旨在示蹤樹舌多糖在細胞中的定位, 為進一步探索其生物活性的作用機制奠定實驗基礎.

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

樹舌液體深層發(fā)酵浸膏水提多糖(GAP)由吉林農業(yè)大學生命科學學院生化研究室制得(由相對分子量分別為4 600,6 600,30 000的3個均一組分組成, 由葡萄糖、 甘露糖、 巖藻糖、 半乳糖和葡萄糖醛酸等單糖組成); 人大腸癌SWWC1116細胞購自吉林省腫瘤研究所; 酪胺和硼氰化鈉(美國Aladdin公司); 異硫氰酸熒光素FITC(美國Sigma公司); RPMI1640(美國Gibco公司); 新生牛血清(蘭州民海生物技術有限公司); 其他試劑均為國產分析純.

BD型流式細胞儀(美國FACS公司); 一體化數(shù)碼熒光顯微鏡(深圳博宇顯微儀器廠); TU-1810紫外可見分光光度計(北京普析通用儀器有限責任公司); 970CRT熒光分光光度計(上海精密科學儀器有限責任公司); 8400紅外光譜儀(日本島津公司); DG5032酶標儀(南京華東電子集團醫(yī)療裝備有限責任公司); xCELLigence RTCA DP全自動實時細胞分析儀(美國Roche公司); VS-840-1超凈工作臺(上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設備廠); Cell240 CO2恒溫培養(yǎng)箱(德國賀利氏公司).

1.2 實驗方法

1.2.1 GAP的熒光標記 參考文獻[8], 對GAP的還原性末端選擇性連接熒光基團(FITC). 稱取200 mg GAP, 充分溶解于7.5 mL 0.2 mol/L的磷酸鹽緩沖液(pH=8.0)后, 加入200 mg酪胺和75 mg硼氰化鈉, 于37 ℃反應96 h, 間或震蕩, 離心收集上清液, 取500 μL上清液過Sephadex G25層析柱(16 mm×20 cm), 蒸餾水洗脫(0.3 mL/min), 收集洗脫液, 測定每管糖含量及紫外吸光值, 繪制胺化多糖(Try-GAP)洗脫曲線. 收集Try-GAP, 紫外分光光度計在190～500 nm掃描, 根據(jù)紫外吸收峰值的變化判斷胺化反應是否成功. Try-GAP與FITC避光室溫反應過夜, 反應產物經體積分數(shù)為75%的乙醇反復沉淀, 所得沉淀經Sephadex G25凝膠柱層析純化, 測定每管糖含量及熒光吸光值, 繪制熒光多糖(FITC-GAP)洗脫曲線.

1.2.2 紅外光譜掃描 分別稱取1 mg GAP、 Tyr-GAP及FITC-GAP與KBr混勻壓片, 紅外光譜儀在4 000～400 cm-1掃描.

1.2.3 熒光取代度測定 參考文獻[9], 將FITC配制成1 μg/mL溶液. 取5支錫箔包裹的試管, 分別加入FITC溶液0.5,1.0,1.5,2.0,2.5 mL, 蒸餾水定容至5.0 mL, 混勻. 以蒸餾水為空白對照, 用熒光分光光度計(激發(fā)波長488 nm, 發(fā)射波長530 nm, 狹縫寬10 nm)測定各管的熒光強度(A). 以FITC質量濃度為橫坐標, 熒光強度(A)為縱坐標, 繪制標準曲線, 并計算回歸方程. 稱取2 mg的FITC-GAP, 蒸餾水定容至10 mL, 取1 mL樣品溶液, 加入3 mL蒸餾水混勻后, 檢測熒光強度(A), 并將其代入回歸方程, 計算GAP的熒光標記效率.

1.2.4 生物活性穩(wěn)定性 使用含體積分數(shù)為10%的熱滅活新生牛血清RPMI1640完全培養(yǎng)液, 在體積分數(shù)為5%的CO2培養(yǎng)箱中37 ℃貼壁培養(yǎng)人大腸癌細胞SWWC1116. 每2 d用體積分數(shù)為0.25%的胰蛋白酶消化傳代1次. 處于對數(shù)生長期的人大腸癌細胞SWWC1116按每孔5×103個細胞接種于E-Plate多孔培養(yǎng)板中, 將其置于Xcelligence RTCA DP細胞分析儀中, 于37 ℃培養(yǎng)24 h, 每15 min檢測細胞指數(shù)1次, 棄去培養(yǎng)液, 分別加入含有質量濃度為1,2,3,4,5 mg/mL GAP和FITC-GAP的RPMI1640完全培養(yǎng)液, 再用全自動實時細胞分析儀監(jiān)測加藥48 h內各處理組細胞指數(shù)的變化.

1.2.5 流式細胞儀檢測大腸癌細胞SWWC1116中的熒光信號 將人大腸癌細胞SWWC1116接種于RPMI1640完全培養(yǎng)液中, 在體積分數(shù)為5%的CO2培養(yǎng)箱中37 ℃貼壁培養(yǎng), 每2 d胰酶消化傳代, 細胞計數(shù), 在6孔板中每孔接種5×105個細胞, 24 h后, 設立9個實驗組, 每組分別加入含質量濃度為20,100,500 μg/mL的FITC-GAP培養(yǎng)液2 mL, 孵育4,8,12 h, 并以無FITC-GAP培養(yǎng)液2 mL為空白對照組. 收集各組細胞制成單細胞懸液, 洗滌, 固定, 每組按每毫升1×106個細胞計數(shù), 取1 mL細胞懸液, 進行流式分析.

1.2.6 熒光顯微鏡觀察FITC-GAP在人大腸癌細胞SWWC1116中的定位 將人大腸癌細胞SWWC1116接種于RPMI1640完全培養(yǎng)液中, 在體積分數(shù)為5%的CO2培養(yǎng)箱中37 ℃貼壁培養(yǎng), 每2 d 胰酶消化傳代, 細胞計數(shù). 按每孔5×105個細胞接種于放有蓋玻片的6孔板中, 培養(yǎng)24 h, 吸去培養(yǎng)液, 設立4個實驗組, 每組加入含質量濃度100 μg/mL的FITC-GAP的培養(yǎng)液2 mL, 分別孵育2,4,8,12 h. 取出蓋玻片, 洗滌, 固定, 熒光顯微鏡觀察拍照.

2 結果與討論

2.1 GAP熒光標記結果

多糖胺化還原后的洗脫曲線和紫外掃描曲線分別如圖1～圖4所示. 由圖1～圖4可見, 糖峰(490 nm)與蛋白峰(280 nm)重合, Tyr-GAP和GAP在λ=280 nm的光吸收值分別為0.076和0.045. Tyr-GAP經FITC親核加成后, 洗脫曲線的糖峰(490 nm)與FITC熒光峰(450 nm)重合, 表明多糖被熒光標記.

圖1 Tyr-GAP洗脫曲線Fig.1 Elution curves of Tyr-GAP

圖2 FITC-GAP洗脫曲線Fig.2 Elution curves of FITC-GAP

圖3 GAP紫外掃描曲線Fig.3 UV curve of GAP

圖4 Try-GAP紫外掃描曲線Fig.4 UV curve of Tyr-GAP

圖5 FITC的標準曲線Fig.5 Standard curve of FITC

2.2 紅外光譜檢測結果

2.3 熒光取代度結果

圖5為FITC的標準曲線. 由圖5可見, FITC-GAP的熒光強度為34.871, 將其代入回歸方程y=178.1x+14.83(R2=0.992), 可得FITC-GAP的熒光標記效率為0.90%. 實驗結果表明, 熒光標記后每100 μg GAP中含有0.9 μg FITC.

2.4 細胞毒活性

GAP標記前后的細胞毒活性如圖6所示, 其中橫坐標表示時間, 縱坐標表示細胞指數(shù), GAP反映貼壁細胞大小、 細胞數(shù)量、 細胞貼附面積和貼附的緊密程度等細胞整體狀態(tài), 細胞指數(shù)隨貼壁細胞的增多、 貼壁后面積的增大和貼附緊密程度的增加而變大. 實驗結果表明, GAP標記FITC后, 對人大腸癌細胞SWWC1116的細胞毒性與標記前基本一致, 即熒光標記后并未影響GAP的生物活性, 保證了GAP的生物學穩(wěn)定性.

圖6 GAP(A)和FITC-GAP(B)的細胞毒活性Fig.6 Cytotoxin activities of GAP (A) and FITC-GAP (B)

2.5 FITC-GAP在人大腸癌細胞SWWC1116中的定位

SWWC1116細胞的熒光信號如圖7所示. 由圖7可見: 各實驗組均檢測到FITC-GAP的熒光信號; 在相同的孵育時間下, 細胞上的熒光強度和被標記細胞數(shù)隨加入FITC-GAP質量濃度的降低而下降； 當FITC-GAP的質量濃度為100,20 μg/mL時, 隨孵育時間的延長, 熒光強度和被標記細胞數(shù)升高; 當FITC-GAP的質量濃度為500 μg/mL時, 熒光強度和被標記細胞數(shù)隨孵育時間的改變不明顯. 表明GAP可與人大腸癌細胞SWWC1116結合, 并受孵育時間及GAP加入質量濃度的影響.

圖7 SWWC1116細胞的熒光信號Fig.7 Fluorescence intensity of SWWC1116

2.6 熒光顯微鏡觀察FITC-GAP在人大腸癌細胞SWWC1116中的定位

SWWC1116細胞的熒光顯微照片如圖8所示. 由圖8可見, 當FITC-GAP與靶細胞SWWC1116作用2 h時, 細胞膜上有少量熒光發(fā)光. 當孵育時間分別為4,8,12 h時, 細胞膜上及細胞核內均檢測到熒光信號. 表明GAP可與人大腸癌細胞SWWC1116的細胞膜結合, 并可轉運至細胞核內.

圖8 SWWC1116細胞的熒光顯微照片F(xiàn)ig.8 Fluorescent microscopic pictures of SWWC1116

綜上, 本文通過對GAP的半縮醛基上引入熒光基團FITC, 使GAP“可視化”, 發(fā)現(xiàn)GAP可與人大腸癌細胞SWWC1116的細胞膜結合并轉運至細胞核, 表明GAP在SWWC1116細胞表面的特異性位點通過載體轉運或細胞胞吞等方式進入胞內.

[1] 郭振楚. 糖類化學 [M]. 北京： 化學工業(yè)出版社, 2005.

[2] Walz G, Aruffo A, Kolanus W, et al. Recognition by ELAM-1 of the Sialyl-Lex Determinant on Myeloid and Tumor Cells [J]. Science, 1990, 23： 1132-1135.

[3] Jackon P. The Use of Polyacrylamide-Gel Electrophoresis for the High-Resolution Separation of Reducing Saccharides Labeled with the Fluorophoresis 8-Aminonaphthalene-l,3,6-trisulfonic Acid [J]. Biochemical Journal, 1990, 270(3): 705-713.

[4] Kbckow A, Amado R, Widmer H M, et al. Separation of 8-Aminonaphthalene-l,3,6-trisulfonic Acid-Labeled Neutral and Sialylated N-Linked Complex Oligosaccharides by Capillary Electrophoresis [J]. J Chromatogaphy A, 1995, 716(1): 241-257.

[5] Usui T, Iwasaki Y, Mizuno T, et al. Isolation and Characterization of Antitumor Activeβ-D-Glucans from the Fruit ofGanodermaapplanatum[J]. Carbohydr Res, 1983, 115(1): 273-280.

[6] Lü Jin-chao. Study on Antitumor Activities of Polysaccarides from Submerged Fermentation of Fugi [D]. Changchun: Jilin Agricultural University, 2010. (呂金超. 真菌液體深層發(fā)酵浸膏多糖抗腫瘤活性研究 [D]. 長春： 吉林農業(yè)大學, 2010.)

[7] LIU Xiao-la. Study on Antitumor Activities of Polysaccarides from Submerged Fermentation ofGanodermaapplanatum(Pers.) Pat [D]. Changchun: Jilin Agricultural University, 2011. (劉曉臘. 樹舌靈芝液體深層發(fā)酵浸膏多糖的抗腫瘤抗腫瘤活性研究 [D]. 長春： 吉林農業(yè)大學, 2011.)

[8] LI Fu-chuan, GENG Mei-yu, LI Ying-xia, et al. Studies on Fluorescent Labeling of Marine Sulfated Polysaccharide 911 [J]. Chemical Journal of Chinese Universities, 2002, 23(9): 1704-1708. (李福川, 耿美玉, 李英霞, 等. 海洋硫酸多糖911的熒光標記研究 [J]. 高等學?；瘜W學報, 2002, 23(9)： 1704-1708.)

[9] Lü Zhi-hua. Studies on Fluorescent Labeling and Pharmacokinetics of Marine Sulfated Polysaccharide PS916 [D]. Qingdao: China Marine University, 2008. (呂志華. 海洋多糖藥物PS916的熒光標記及其藥代動力學研究 [D]. 青島： 中國海洋大學, 2008.)