邵洪澤,程榮華,石春軍,呼延含蓉,黃海楠,許 堯,毛文智,胡桂學(xué)

(1. 吉林農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物科技學(xué)院,長(zhǎng)春 130118；2. 吉林省畜牧獸醫(yī)科學(xué)研究院,長(zhǎng)春 130062；3. 前郭縣動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心,吉林 松原 131100)

羊傳染性膿皰病毒是痘病毒科副痘病毒屬的雙股DNA病毒,主要危害3～6月齡羔羊,易引起急性、 高度接觸性、 嗜皮性的人獸共患病----羊傳染性膿皰病. 該病毒通過(guò)直接接觸傳染,在感染動(dòng)物的口腔、 唇、 舌、 鼻孔周?chē)?乳房等部位的皮膚與黏膜形成丘疹、 膿皰、 潰瘍和疣狀痂皮[1]， 常呈群發(fā)性流行,如吉林省主要養(yǎng)羊區(qū)的發(fā)病率為10%～20%,最高為80%,病死率約為10%[2],對(duì)人獸健康均構(gòu)成嚴(yán)重威脅[3-4].

羊傳染性膿皰病毒的基因組中部區(qū)域(ORFs009-111)較保守,主要包括與病毒在細(xì)胞中復(fù)制和病毒粒子在細(xì)胞漿中裝配成熟的相關(guān)基因[5],與痘病毒相關(guān)基因的同源性較高,具有較多同源性蛋白質(zhì). 其中F1L基因(ORF059)長(zhǎng)為1 011 bp,編碼39 000蛋白,該基因位于病毒基因組物理圖譜的中央,是一個(gè)完整的開(kāi)放閱讀框高度保守. 39 000蛋白在病毒成熟過(guò)程中作用較大[6]， 是病毒主要的肝素結(jié)合蛋白,具有肝素結(jié)合活性[7],可與大多數(shù)哺乳動(dòng)物細(xì)胞表面表達(dá)的硫酸乙酰肝素(heparan sulfate,HS)受體結(jié)合,因此該蛋白在病毒吸附和侵入過(guò)程中作用較大. 在可溶性肝素存在的條件下,F1L蛋白將與GAGs結(jié)合,從而影響病毒吸附宿主,抑制病毒感染[8]. Gallina等[9]研究表明,F1L編碼蛋白能刺激機(jī)體中和抗體的產(chǎn)生,并誘導(dǎo)體液與細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答. 此外,F1L基因可作為目的基因用于體外重組表達(dá)39 000蛋白,為ORFV亞單位疫苗的研制提供標(biāo)準(zhǔn)抗原. 本文選擇表達(dá)該蛋白的F1L為目的基因,并研究其同源性,將有利于選擇不同毒株間保守的免疫原基因作為新型疫苗研制的目的基因,為新型疫苗的研制提供理論依據(jù).

1 材料與方法

1.1 病毒與菌株

羊傳染性膿皰病毒JLSY04株,由吉林省畜牧獸醫(yī)科學(xué)研究院分離、 凍干保存；E.coli感受態(tài)細(xì)胞JM109由吉林省畜牧獸醫(yī)科學(xué)研究院提供， 于-70 ℃保存.

1.2 細(xì) 胞

無(wú)菌采取健康犢牛睪丸,按文獻(xiàn)[10]方法消化,制作犢牛睪丸細(xì)胞.

1.3 試 劑

Mini BEST病毒DNA提取試劑盒購(gòu)自日本Takara公司；DL2 000 DNA Marker購(gòu)自北京鼎國(guó)生物工程有限公司；2×GC緩沖溶液Ⅰ(加Mg2+)， dNTP 混合液(2.5 mmol)，PfuDNA聚合酶41.675 nkat/μL， pMD18-T載體， 凝膠回收試劑盒， 小量質(zhì)粒提取試劑盒， 限制性?xún)?nèi)切酶Hind Ⅲ/EcoR Ⅰ和MEM購(gòu)自大連寶生物工程有限公司.

1.4 F1L基因的克隆

1.4.1 病毒的培養(yǎng) 將病毒1MOI接種于生長(zhǎng)良好、 已長(zhǎng)成單層的牛睪丸細(xì)胞內(nèi),37 ℃孵育1 h后,用維持液繼續(xù)培養(yǎng),觀察細(xì)胞變化. 待細(xì)胞病變70%～80%時(shí),收毒,反復(fù)凍融3次,-70 ℃保存?zhèn)溆?

1.4.2 病毒DNA的提取及PCR擴(kuò)增 用Mini BEST病毒DNA 提取試劑盒提取病毒基因組DNA,按照試劑盒說(shuō)明書(shū)操作. 用分光光度計(jì)檢測(cè)提取的病毒基因組DNA,-70 ℃保存?zhèn)溆?

1.5 F1L基因的序列測(cè)定

使用凝膠回收試劑盒回收目的片段,由于PfuDNA聚合酶擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物為平端,因此要將純化后的PCR產(chǎn)物加poly A尾才能連接到T載體. 取1～7 μL純化的PCR產(chǎn)物,加10×TaqDNA聚合酶緩沖液(含有MgCl2)1 μL,終濃度為0.2 mmol/L的dATP,TaqDNA聚合酶1 μL,再加蒸餾水至10 μL,70 ℃反應(yīng)15～30 min. 取1～2 μL與pMD18-T載體連接,轉(zhuǎn)化至E.coli感受態(tài)細(xì)胞JM109中,涂布平板,37 ℃過(guò)夜培養(yǎng). 挑菌,用小量提取質(zhì)粒試劑盒提取質(zhì)粒,進(jìn)行PCR鑒定的同時(shí)用Hind Ⅲ和EcoRⅠ進(jìn)行酶切鑒定,隨機(jī)挑選2個(gè)鑒定正確的菌由大連寶生物工程有限公司測(cè)序.

1.6 序列分析

用DNAstar軟件將所測(cè)序列與GenBank中具代表性的相應(yīng)片段序列進(jìn)行同源性比較(表1),得到系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù),并比較核苷酸和氨基酸的同源性.

表1 病毒毒株序列比較Table 1 Strain names of the viruses

2 結(jié) 果

2.1 細(xì)胞病變(CPE)

單層牛睪丸細(xì)胞接種病毒18～24 h后變圓、 腫脹,細(xì)胞間質(zhì)增寬,松散并開(kāi)始聚集,呈葡萄串狀,如圖1所示. 由圖1可見(jiàn),接種病毒約24 h后呈現(xiàn)明顯的細(xì)胞病變.

(A) 正常牛睪丸細(xì)胞 (B) 呈葡萄狀細(xì)胞病變圖1 病毒在ST細(xì)胞上形成CPEFig.1 CPE formation of virus on the ST cells

2.2 病毒DNA提取及PCR擴(kuò)增結(jié)果

采用分光光度計(jì)測(cè)得樣品羊傳染性膿皰病毒基因組DNA的質(zhì)量濃度為50 μg/mL. 以提取的羊傳染性膿皰病毒JLSY04株基因組DNA為模板,進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng),擴(kuò)增的目的片段約為1 000 bp,與預(yù)期片段長(zhǎng)度相符,如圖2所示.

2.3 陽(yáng)性質(zhì)粒鑒定結(jié)果

將連接pMD18-T載體的陽(yáng)性質(zhì)粒分別用PCR擴(kuò)增鑒定,同時(shí)用Hind Ⅲ和EcoR Ⅰ進(jìn)行酶切鑒定,均得到約1 000 bp的目的片段,與預(yù)期片段長(zhǎng)度相符,結(jié)果分別如圖3和圖4所示.

2.4 序列測(cè)定結(jié)果及同源性分析

所得序列如下：ATGGATCCACCCGAAATCACGGCCTACATAATCGGGGTTGCCGAAGGCCGCGGGACCAAGGAGGTGTTCCCCACGCTGCCGTACCTGGTGGGCCTCGCCGACGACCCGCCCAAGCCTCAACCCGCACCTAAGCCTGCTCCCTCTCCTGCGCCGGCCCCCGCACCGGCCCCCGCGCCAGCACCCAAGCCATCTCCTCCCGCGCCGCACCCCAAGGGCGACCACGTGCTCAAGGCGGTGGAATGGAAAGACGTTGACTCCAAAGACTACCCGCACTTCTTCACGGACATGTGCAAGTCCACGTGTCCGAAGGAGATGCAGCGCCGCGCGGCACACCACCTCAACCTCTGGGAGAGCATATCGGCCGGCACCGTCTCCACCAAGTACTCCGACGATGACTTCGTCCTGGTGGTCGACAACGACATGACCTTCCGCAAGCCCGAGATGGTAAAGCCGCTCATCGAGGCGATGAGGACGAACGGCTGGTACATGGCGCAGCTCAAGGAGACCTACATGACCGGCGCGCTGGCCACCAACGTCCCCGGCACCGGCGACCCCGAGCTCATGGTCTACCCCGGCGGGTACGACGTCTCGCTAGACGCCTACATCATCAACGTCGGCGGCATGAAGAAGCTCTACGACGCGATCATCAAGGAGGGAGGGCTGCGCAGCGGCCTGCTCACCGAGGTGTTCACGCTGGAGAAGCGGCTCTCTCTGGCGCGCGTGGTGCTCTCCGGCGCCGAGCAGGTGGTCTACCCCGAGTACTACATACAGGTGAAGACGCGGCTAAGCGGCGCGCCCTCCCTGTGGTCGCTGCTCGCCACGTGGCTGGCGCGCTTCTGGCCCGGCGCCATCTACTTCCTCACCACGCCGCTCTTCTCCTTCATGGGGCTCTTCGACGTGGACGTGGTCGACATCTTCATCCTGGCATACCTGCTGGTGCTCGTGCTGCTGCTGCCGAACTCGCGGCTGCTGTGGTTCATCGCCGGGCTGCTGGTCACGGCCATCGTGTGA.

M: Marker DL2 000;1: F1L基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物;2: 陰性對(duì)照.圖2 F1L基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳結(jié)果Fig.2 Electrophoresis of F1L amplified products

M: Marker DL2 000;1: F1LPCR擴(kuò)增產(chǎn)物;2: 陰性對(duì)照.圖3 陽(yáng)性質(zhì)粒PCR鑒定電泳結(jié)果Fig.3 Electrophoresis of F1L amplified products

M: Marker DL2 000;1: Hind Ⅲ/EcoR Ⅰ酶切鑒定;M2: Marker DL 15 000.圖4 陽(yáng)性質(zhì)粒的酶切鑒定結(jié)果Fig.4 Identication of the positive plasmid

圖5 F1L基因核苷酸序列同源性比較Fig.5 Phylogenetic tree of F1L from ORFV

測(cè)序結(jié)果表明,鑒定正確的兩個(gè)質(zhì)粒序列完全相同,結(jié)果正確. 將所得羊傳染性膿皰病毒JLSY04株F1L基因的測(cè)序序列與GenBank中相應(yīng)核苷酸序列進(jìn)行同源性比較,結(jié)果如圖5所示. 其中OV/7,OV/20,OV/C2為綿羊分離毒；OV/mi-90,OV/Torino為小羚羊分離毒株；NZ2作為標(biāo)準(zhǔn)毒株. 結(jié)果表明,JLSY04分離株與Jilin株的親緣關(guān)系最近,與OV/Torino株的親緣關(guān)系最遠(yuǎn).

利用DNAstar軟件對(duì)8個(gè)毒株相應(yīng)的F1L基因片段進(jìn)行核苷酸和氨基酸同源性分析,結(jié)果分別如圖6和圖7所示.

1～8分別為JLSY04,Jilin,NZ2,OV/7,OV/20,OV/C2,OV/mi-90,OV/Torino.圖6 F1L基因的核苷酸序列同源性分析Fig.6 Nucleic acids sequence analysis of F1L from ORFV

1～8分別為JLSY04,Jilin,NZ2,OV/7,OV/20,OV/C2,OV/mi-90,OV/Torino.圖7 F1L基因的氨基酸同源性分析Fig.7 Amino acid homology analysis of F1L from ORFV

序列分析結(jié)果表明,JLSY04分離株的F1L基因片段與Jilin株同源性最高,為99.8%,與NZ2株同源性最低,為97.4%.

3 討 論

3.1 基因克隆DNA聚合酶的選擇

本文PCR擴(kuò)增使用的PfuDNA聚合酶具有3′-5′的外切酶活性,能糾正DNA擴(kuò)增過(guò)程中產(chǎn)生的錯(cuò)誤.Pfu是目前已發(fā)現(xiàn)的所有耐高溫DNA聚合酶中出錯(cuò)率最低的聚合酶,熱穩(wěn)定性較好. 利用PfuDNA聚合酶對(duì)羊傳染性膿皰病毒JLSY04株病毒DNA進(jìn)行擴(kuò)增,并對(duì)鑒定正確的隨機(jī)2個(gè)質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序,由序列完全相同可見(jiàn),該酶的重復(fù)性好,擴(kuò)增效率高,錯(cuò)賠率低,較穩(wěn)定.PfuDNA聚合酶擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物為平端,可通過(guò)酶切連接其他載體,若連接T載體,則需加poly A尾.

3.2 序列分析及同源性比較

本文將羊傳染性膿皰病毒JLSY04株F1L基因片段的核苷酸序列與已報(bào)道的羊傳染性膿皰病毒毒株相應(yīng)片段核苷酸序列進(jìn)行了比較,由進(jìn)化樹(shù)可見(jiàn),從不同宿主和不同地區(qū)分離的毒株在遺傳進(jìn)化上的差異較小,這是由于種間和地區(qū)差異所致. 同源性比較結(jié)果表明,JLSY04株與Jilin株同源性最高,為99.4%,與OV/Torino株的同源性最低,為96.0%,即F1L基因在不同感染動(dòng)物分離病毒株間的差異較小. 由于F1L基因編碼的39 000蛋白高度保守,因此,羊傳染性膿皰病毒吉林株JLSY04F1L基因可作為基因工程疫苗的目的基因.

綜上,本文對(duì)羊傳染性膿皰病毒JLSY04株的F1L基因片段進(jìn)行了核苷酸序列測(cè)定,并與多株參考毒株進(jìn)行了同源性比較和分析,為進(jìn)一步對(duì)該病毒的基礎(chǔ)研究和疫苗應(yīng)用提供了理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù).

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