馬旭兵，翟萬銀，張嘉敏，朱自嚴(yán)，張紅鋒，常 江

（1．華東師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，上海 200062；2．中國科學(xué)研究院 上海市硅酸鹽研究所高性能與超微結(jié)構(gòu)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 200050；3．上海市血液中心，上海 200051）

0 引 言

心臟瓣膜病是一種致命的嚴(yán)重疾病，自20世紀(jì)60年代臨床上采用戊二醛（Glutaraldehyde，GA）交聯(lián)制備的生物瓣作置換手術(shù)以來，已成功挽救或延長了數(shù)以百萬計(jì)的患者生命［1，2］．該方法制備的生物瓣具有供體來源豐富、方法簡單、免疫原性較低、中心血流通暢、不需終身服用抗凝劑等優(yōu)點(diǎn)［1，2］，但仍存在嚴(yán)重的缺點(diǎn)，如鈣化和GA緩慢釋放所產(chǎn)生的細(xì)胞毒性［1，2］等，限制了其體內(nèi)使用壽命和進(jìn)一步的臨床應(yīng)用［2］．目前研究集中于新交聯(lián)劑或GA交聯(lián)改性的探索，如采用京尼平［3］、槲皮素［4］和碳二亞胺［5］等新型交聯(lián)劑或采用鋁離子［2］、單寧酸［6］和鈦納米涂層［7］等改進(jìn)的GA交聯(lián)方法等處理心臟瓣膜，可部分改善生物瓣膜的性能，但至今尚未見到相關(guān)的臨床應(yīng)用研究．

近年來，我們發(fā)現(xiàn)原花青素（Procyanidins，PC）可通過氫鍵交聯(lián)瓣膜細(xì)胞外基質(zhì)，可有效抑制其鈣化和提高穩(wěn)定性［8，9］．此外，PC本身還具有多種生物活性，如抗菌、抗血栓和抑制免疫原性等［10－13］，因而有可能較好地改進(jìn)GA交聯(lián)瓣膜的缺陷．本研究采用PC與GA共交聯(lián)豬主動脈脫細(xì)胞瓣膜材料，評價(jià)了該材料的細(xì)胞相容性、血液相容性以及免疫原性，以期在保留GA交聯(lián)的優(yōu)良性能的基礎(chǔ)上，消除或改進(jìn)其缺陷．

1 材料與方法

1．1 脫細(xì)胞豬心臟瓣膜制備

新鮮豬心臟取自上海復(fù)新屠宰場，放置于冰袋中運(yùn)輸至實(shí)驗(yàn)室．無菌條件下剪取主動脈瓣瓣葉，4℃下無鈣、鎂平衡鹽溶液（D－Hanks液）充分清洗，按照文獻(xiàn)報(bào)道方法脫除瓣膜細(xì)胞成分［8］，再經(jīng)充分清洗制備成脫細(xì)胞豬心臟瓣膜材料備用．

1．2 瓣膜間質(zhì)細(xì)胞的分離與培養(yǎng)

瓣膜間質(zhì)細(xì)胞（Heart valve interstitial cells，HVICs）按照文獻(xiàn)報(bào)道方法分離培養(yǎng)［14］．新鮮豬主動脈瓣膜經(jīng)D－Hanks液充分洗滌后剪成約1mm3小塊，加入用D－Hanks液配制的0．25%胰蛋白酶（Sigma，USA）5mL，37℃恒溫消化5min，取出以D－Hanks液清洗，去除內(nèi)皮細(xì)胞，再加入1．5mg／mL的Ⅱ型膠原酶（Sigma，USA，D－Hanks液配制）5mL，37℃消化1h即得到含有原代HVICs的細(xì)胞懸液．經(jīng)離心（Jouan A14，F(xiàn)rance）、清洗5次，所得原代HVICs加入含20%胎牛血清（四季青）及100U／mL雙抗的DMEM（Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium，Gibco，USA）培養(yǎng)液，于37℃、5%CO2飽和濕度培養(yǎng)箱（MEMMERT，F(xiàn)rance）中培養(yǎng)．細(xì)胞貼壁生長至90%培養(yǎng)皿底面時傳代培養(yǎng)，第3～5代的HVICs用于本研究實(shí)驗(yàn)．

1．3 交聯(lián)劑配比的確定

由于瓣膜共交聯(lián)后兩種交聯(lián)劑可能同時以低濃度緩慢釋放，所以本研究將GA臨床常用濃度（6．25mg／mL）與PC有效交聯(lián)濃度（10mg／mL）以PC／GA分別為80∶20、60∶40、50∶50、40∶60和20∶80的不同配比混合后，稀釋至50倍，作用于HVICs，觀察不同配比混合交聯(lián)劑對細(xì)胞增殖的抑制率．選擇對細(xì)胞增殖抑制率最低的配比作為共交聯(lián)方法中兩種交聯(lián)劑的最優(yōu)配比．將HVICs以5×103細(xì)胞／孔接種于96孔板中培養(yǎng)過夜，培養(yǎng)液換為含有不同配比的混合交聯(lián)劑的新鮮培養(yǎng)液，以不含交聯(lián)劑的細(xì)胞培養(yǎng)液作空白對照，繼續(xù)培養(yǎng)72h．用MTT法檢測各實(shí)驗(yàn)組對HVICs的增殖抑制．細(xì)胞增殖率（Relative viability of HVICs）計(jì)算公式為：細(xì)胞增殖率%＝（實(shí)驗(yàn)組OD值／空白對照組OD值）×100%．

1．4 脫細(xì)胞心臟瓣膜的交聯(lián)制備

將瓣膜材料隨機(jī)分為4組：a）不交聯(lián)組（Control）；b）以6．25mg／mL GA交聯(lián)組（GA6）；c）以10mg／mL PC交聯(lián)組（PC10）；d）以采用1．3所述方法選定的混合配比的共交聯(lián)組，即8mg／mL PC與1．25mg／mL GA共交聯(lián)組（P8G1）．所有交聯(lián)液均用pH 7．4的D－Hanks液配制，交聯(lián)過程均在37℃、120r／min的搖床中完成．b）和c）組分別采用6．25 mg／mL GA溶液和10mg／mL PC溶液交聯(lián)48h．d）組采用8mg／mL PC溶液交聯(lián)4h后，再用1．25mg／mL GA溶液繼續(xù)交聯(lián)至48h．交聯(lián)的各組瓣膜材料充分洗滌后以4℃的DHanks液保存?zhèn)溆茫鲜龈鹘M每組6個脫細(xì)胞瓣膜葉片．將未交聯(lián)和交聯(lián)后的脫細(xì)胞豬心臟瓣膜材料鋪展在藍(lán)色紙上，用數(shù)碼相機(jī)拍攝瓣膜材料的宏觀形態(tài)．

1．5 細(xì)胞相容性評價(jià)

采用瓣膜材料表面種植HVICs、計(jì)算細(xì)胞粘附率以評價(jià)交聯(lián)瓣膜的細(xì)胞相容性．交聯(lián)瓣膜各組樣品（n＝4）材料剪成直徑為10mm的圓片，瓣膜材料褶皺多的一面向上放置于48孔板中．培養(yǎng)液將HVICs稀釋成104細(xì)胞／mL細(xì)胞懸液，每孔加細(xì)胞懸液100μL，培養(yǎng)16h．取出瓣膜材料用D－Hanks液漂洗3遍，洗去未粘附細(xì)胞，經(jīng)固定、梯度酒精脫水、干燥后，300倍下掃描電鏡觀察、每個樣品任選4個視野拍照用于粘附細(xì)胞計(jì)數(shù)，以實(shí)驗(yàn)組4個視野平均粘附細(xì)胞數(shù)相對于不交聯(lián)組的細(xì)胞數(shù)作為細(xì)胞相對粘附率（Relative adhesion）．相對粘附率按下式計(jì)算：

相對粘附率%＝（各交聯(lián)組平均粘附細(xì)胞數(shù)／對照組平均粘附細(xì)胞數(shù)）×100%．

1．6 掃描電子顯微鏡（SEM）觀察

將樣品浸泡在濃度為2．5%戊二醛的D－Hanks溶液中固定4h．此后用D－Hanks溶液洗滌3次，然后依次浸泡于一系列梯度濃度的乙醇溶液中（乙醇的體積分?jǐn)?shù)分別為30%，50%，70%，90%，95%和100%），每個濃度10min，使之脫水．接著將樣品浸入體積分?jǐn)?shù)為50%的六甲基二硅胺烷（HMDS）—乙醇溶液中干燥10min，然后放入純的HMDS中干燥10min，最后放入通風(fēng)櫥中通風(fēng)揮發(fā)干燥過夜，干燥樣品噴金用于電鏡觀察．

1．7 溶血實(shí)驗(yàn)

新鮮抗凝血液（上海市血液中心提供）以2 000r／min離心10min，棄掉上清，沉淀用DHanks液重懸清洗3次，最后用D－Hanks液按1∶10稀釋后備用．取稀釋后的血液300μL分別加入：?1 200μL超純水（陽性對照）；?1 200μL無菌D－Hanks液（陰性對照）；?—?各材料組1 200μL懸液，即分別含不交聯(lián)組瓣膜材料和GA6，P8G1和PC10交聯(lián)組瓣膜材料碎末（＜1mm3）的D－Hanks液配制的懸液．輕輕混勻，室溫放置2h后4 000r／min離心2min，使用數(shù)碼相機(jī)拍攝各實(shí)驗(yàn)組的溶血狀況照片；取離心后各組上清用酶聯(lián)免疫檢測儀（ELX800，BIO－TEK，USA）于541nm下測定其吸光度．按下式計(jì)算樣品的溶血率（Hemolysis Rate）：

溶血率%＝［（樣品OD值－陰性O(shè)D值）／（陽性O(shè)D值－陰性O(shè)D值）］×100%．

1．8 血小板粘附

脫細(xì)胞交聯(lián)瓣膜各組樣品（n＝4）材料剪成直徑為10mm的圓片，皺褶多的一面向上放置于48孔板中，每孔加入200μL血小板（106血小板／mL，上海市血液中心提供）孵育1h．棄掉孵育后的血小板溶液，SEM觀察瓣膜材料表面血小板粘附狀況，放大2 000倍下每樣品隨機(jī)選取4個視野拍照，用于粘附的血小板計(jì)數(shù)，取平均值后用于表征瓣膜材料的抗血栓形成能力．血小板粘附數(shù)量越多表示材料形成血栓的可能性越大；反之，粘附數(shù)量越少則表示材料的抗血栓能力越強(qiáng)．

1．9 單核巨噬細(xì)胞的粘附

THP－1細(xì)胞是人急性白血病單核細(xì)胞株（human acute monocytic leukemia cell lines，上海市血液中心提供），經(jīng)佛波酯（phorbol 12－myristate 13－acetate，PMA）誘導(dǎo)分化可形成具有貼附生長能力的巨噬細(xì)胞，其對材料的粘附可以表征此材料的免疫原性［15，16］．THP－1以106細(xì)胞／mL培養(yǎng)于12孔板中，RPMI－1640培養(yǎng)液中加入誘導(dǎo)劑100ng／mL的PMA培養(yǎng)48h，使之誘導(dǎo)分化為巨噬細(xì)胞．D－Hanks液洗去未貼壁細(xì)胞，收集巨噬細(xì)胞并用培養(yǎng)液稀釋成106細(xì)胞／mL．各組瓣膜材料樣品（n＝4）剪成直徑為10mm的圓片，皺褶多的一面向上放置于48孔板中，每孔接種200μL稀釋后巨噬細(xì)胞懸液，培養(yǎng)16h后D－Hanks液洗去未粘附細(xì)胞，瓣膜材料經(jīng)固定、脫水、干燥后，SEM觀察巨噬細(xì)胞粘附狀況．另取200倍下SEM照片作如1．8所述計(jì)數(shù)、計(jì)算粘附率．巨噬細(xì)胞粘附率越高表示材料潛在的免疫原性越高；反之，粘附率越低則表示材料潛在的免疫原性越低．粘附率（Cell adhesion）按下式計(jì)算：

粘附率%＝（各交聯(lián)組平均粘附細(xì)胞數(shù)／對照組平均粘附細(xì)胞數(shù)）×100%．

1．10 統(tǒng)計(jì)分析

所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用Student t－test分析軟件統(tǒng)計(jì)分析，分析結(jié)果用平均數(shù)（mean）±標(biāo)準(zhǔn)差（SD）表示．統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用t檢驗(yàn)檢測組間差異，p＜0．05表示組間有顯著性差異，p＜0．01表示組間有極顯著差異．

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2．1 共交聯(lián)劑配比及交聯(lián)濃度的確定

如圖1所示，不同混合比例配制的兩種交聯(lián)劑混合液對細(xì)胞的增殖抑制作用隨著GA比例的減少和PC比例的增加而降低．當(dāng)PC和GA濃度以160μg／mL和25μg／mL混合時，即混合比例為80∶20時，對細(xì)胞增殖的抑制作用最小．因此，本研究采用此對細(xì)胞增殖抑制最小的交聯(lián)劑濃度配比，再結(jié)合GA臨床常用交聯(lián)濃度6．25mg／mL和PC有效交聯(lián)濃度10mg／mL，確定后續(xù)共交聯(lián)方法中PC與GA分別以8mg／mL和1．25mg／mL的濃度交聯(lián)瓣膜材料．為敘述簡潔，該共交聯(lián)方法標(biāo)記為P8G1．

圖1 相同稀釋比例的各共交聯(lián)液對于HVICs增殖情況的影響Fig．1 Cell viability of HVICs cultured in co－crosslinking reagents with same dilution ratio

2．2 脫細(xì)胞及交聯(lián)的心臟瓣膜形貌

脫細(xì)胞瓣膜經(jīng)交聯(lián)后，不交聯(lián)（control）、6．25mg／mL GA交聯(lián)（GA6）、共交聯(lián)（P8G1）以及10mg／mL PC（PC10）交聯(lián)瓣膜的宏觀形貌如圖2中上圖所示．脫細(xì)胞未交聯(lián)瓣膜呈白色半透明狀，基本保持正常形態(tài)結(jié)構(gòu)，稍有收縮．GA6交聯(lián)瓣膜顏色呈淡黃色，形態(tài)輕度皺縮、僵硬．與其相比，P8G1與PC10交聯(lián)瓣膜因PC（PC溶液呈褐色）參與交聯(lián)而呈淡褐色和深褐色，形態(tài)柔軟無明顯皺縮．由于PC本身顏色呈褐紅色，P8G1與PC10交聯(lián)瓣膜因PC含量影響而呈淡褐紅色和深褐紅色，有少量褶皺，顯示所交聯(lián)的瓣膜柔軟，無明顯收縮．圖2中下圖所示為各組瓣膜的微觀形貌，顯示各組瓣膜基質(zhì)纖維完整、無明顯斷裂．其中脫細(xì)胞不交聯(lián)組及P8G1與PC10組纖維完整較松軟，而GA6組則明顯緊密，可能是GA6組宏觀形貌較僵硬的原因．

圖2 交聯(lián)的脫細(xì)胞瓣膜宏觀照片（上）和微觀形貌SEM圖（下）Fig．2 The photos（above）and SEM images（below）of crosslinked AHVM

2．3 細(xì)胞相容性

采用瓣膜表面種植HVICs來評價(jià)交聯(lián)瓣膜材料的細(xì)胞相容性．從圖3A可以看出，對照組粘附細(xì)胞數(shù)量較多，形態(tài)伸展呈梭形或多邊形，有較多偽足．而GA6交聯(lián)瓣膜材料只有少量細(xì)胞粘附，且有部分細(xì)胞已破裂．P8G1和PC10交聯(lián)瓣膜材料表面粘附細(xì)胞數(shù)量相當(dāng)，且形態(tài)均呈圓形或剛伸出偽足．細(xì)胞計(jì)數(shù)統(tǒng)計(jì)結(jié)果（見圖3B）顯示：與對照組（100%）相比，GA6交聯(lián)瓣膜材料粘附的細(xì)胞量僅為（19．75±3．27）%；P8G1和PC10交聯(lián)瓣膜材料的粘附量分別為（78．75±8．7）%、（98．21±4．42）%．這一結(jié)果說明P8G1交聯(lián)瓣膜材料的細(xì)胞相容性介于GA6交聯(lián)瓣膜材料與PC10交聯(lián)瓣膜材料之間，且極顯著高于GA6．

圖3 各交聯(lián)組瓣膜材料表面粘附HVICs的SEM照片（A）和相對粘附率（B）Fig．3 SEM images（A）and relative adhesion of（B）HVICs on crosslinked AHVM

2．4 溶血

如圖4右上角插圖所示，正常（陰性對照）無溶血現(xiàn)象，血液離心后紅細(xì)胞沉降與EP管底部，上清液中沒有血紅素，而陽性對照由于紅細(xì)胞破裂，大量血紅素溶解于上清液中．與陽性對照組相比，各實(shí)驗(yàn)組瓣膜材料上清液中幾乎沒有血紅素，無明顯的溶血發(fā)生．溶血實(shí)驗(yàn)的定量結(jié)果顯示：各實(shí)驗(yàn)組的溶血率均極顯著的低于陽性對照組（純水）．Control、GA6、P8G1和PC10各組交聯(lián)瓣膜材料的溶血率分別為（0．36±0．116）%、（0．42±0．3）%、（0．75±0．36）%、（0．72±0．58）%，均遠(yuǎn)低于國際標(biāo)準(zhǔn)ISO 10993－4：2002所規(guī)定的血液相容性標(biāo)準(zhǔn)最大溶血率5%［17］．雖然與GA6相比，P8G1和PC10交聯(lián)瓣膜材料的溶血率略有上升，但是并不存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異．

圖4 各交聯(lián)組瓣膜材料的溶血率Fig．4 Hemolysis rates of AHVM

2．5 血小板粘附

圖5A所示為血小板粘附于各實(shí)驗(yàn)組瓣膜材料表面的掃描電鏡照片．如圖，大量血小板粘附于GA6交聯(lián)瓣膜材料表面，而P8G1和PC10交聯(lián)瓣膜材料表面僅粘附少量血小板．如圖5B，對粘附血小板計(jì)數(shù)統(tǒng)計(jì)進(jìn)一步驗(yàn)證了這一結(jié)果：PC10交聯(lián)瓣膜材料的血小板粘附數(shù)量與對照組和GA6交聯(lián)瓣膜均存在顯著性差異（p＜0．05）．P8G1交聯(lián)組瓣膜材料粘附的血小板數(shù)量與對照組相當(dāng)，但顯著低于GA6交聯(lián)瓣膜（p＜0．05）．

2．6 免疫原性評價(jià)

瓣膜的免疫原性取決于瓣膜殘留的免疫表位的多少，免疫表位越多越有利于巨噬細(xì)胞粘附，因此瓣膜單位面積粘附的巨噬細(xì)胞數(shù)量能夠反映瓣膜免疫原性的強(qiáng)弱．圖6A所示為巨噬細(xì)胞粘附于各交聯(lián)瓣膜材料的掃描電鏡圖．如圖所示，Control和GA6交聯(lián)瓣膜材料表面粘附的巨噬細(xì)胞粘附數(shù)量相當(dāng)，但是細(xì)胞形態(tài)差異明顯：對照組粘附細(xì)胞形態(tài)開始伸展有少量偽足，GA6組粘附細(xì)胞形態(tài)未伸展呈圓形．與GA6相比，粘附于P8G1與PC10交聯(lián)瓣膜材料表面的巨噬細(xì)胞數(shù)量明顯減少．圖6B的粘附率結(jié)果顯示：4組瓣膜材料均可粘附一定數(shù)量的巨噬細(xì)胞，其中PC10交聯(lián)瓣膜材料粘附率較低，雖然P8G1粘附率較PC10交聯(lián)瓣膜高，但是顯著低于GA6交聯(lián)瓣膜材料．

圖5 各交聯(lián)組瓣膜材料表面血小板粘附SEM照片（A）和粘附量（B）Fig．5 SEM images（A）and number（B）of platelet adhesion for crosslinked AHVM

3 討 論

GA是目前較常用的交聯(lián)劑，廣泛應(yīng)用于生物瓣交聯(lián)制備［1］．20世紀(jì)80年代發(fā)現(xiàn)，GA可與膠原蛋白分子的N末端氨基、ε－氨基和羥基等反應(yīng)形成共價(jià)鍵，使膠原蛋白分子間形成網(wǎng)狀交聯(lián)［1］．與GA交聯(lián)方式不同，PC主要通過其酚羥基與膠原蛋白中羥脯氨酸羥基、ε－氨基和酰胺羰基等基團(tuán)形成氫鍵交聯(lián)［8］．本研究中通過這兩種機(jī)理不同的交聯(lián)劑共交聯(lián)處理的生物瓣，在保留了GA交聯(lián)的一些優(yōu)良性能的基礎(chǔ)上，克服了GA交聯(lián)引起的幾項(xiàng)缺點(diǎn)．

低毒性為理想生物瓣所必須［2］．GA的游離醛基具有較強(qiáng)的細(xì)胞毒性，GA作為交聯(lián)劑因其在交聯(lián)的材料中可以緩慢釋放，因而可引起一定的細(xì)胞毒性［1］．共交聯(lián)P8G1組瓣膜顯示無收縮，較柔軟，其所帶褐紅色為PC本身顏色，而PC是一種廣泛存在于各種食物中，具有多種生物活性的黃酮類化合物［8］．研究表明，PC的毒性遠(yuǎn)低于GA，僅為相同濃度GA的1%［8］．本研究采用PC與GA共交聯(lián)的方法即瓣膜先經(jīng)8mg／mL PC交聯(lián)，再經(jīng)1．25mg／mL GA交聯(lián)的方法，降低了GA的使用量（為GA單獨(dú)交聯(lián)濃度的1／5）從而減弱了交聯(lián)后的釋放量，降低了細(xì)胞毒性．相同稀釋比例的共交聯(lián)液對細(xì)胞的增殖抑制率（55%）遠(yuǎn)低于GA（82%）．細(xì)胞相容性實(shí)驗(yàn)中，與對照組粘附細(xì)胞形態(tài)伸展、伸出偽足相比，共交聯(lián)瓣膜材料表面粘附細(xì)胞雖然鋪展較慢，僅部分伸出少量偽足，但細(xì)胞沒有破裂，形態(tài)明顯好于GA6交聯(lián)組．此外共交聯(lián)瓣膜材料表面粘附的相對細(xì)胞量（78%）約為GA單獨(dú)交聯(lián)（19%）的4倍，顯示共交聯(lián)瓣膜的細(xì)胞相容性遠(yuǎn)高于GA單獨(dú)交聯(lián)的瓣膜，具有較好的細(xì)胞相容性．

圖6 各交聯(lián)組瓣膜材料表面粘附的巨噬細(xì)胞SEM照片（A）與粘附率（B）Fig．6 SEM images（A）and cell adhesion rate（B）of immunogenicity evaluation for crosslinked AHVM

生物瓣植入體內(nèi)后與血液直接接觸，因此血液相容性是衡量生物瓣材料能否臨床應(yīng)用的重要指標(biāo)之一［2］．溶血試驗(yàn)是血液相容性評價(jià)的經(jīng)典實(shí)驗(yàn)方法，也是血液相容性評價(jià)方法中的唯一國家標(biāo)準(zhǔn)所采用的方法，主要是檢測瓣膜材料對血液中紅細(xì)胞的溶血作用［18］．當(dāng)血液相容性差的物質(zhì)與血液中的紅細(xì)胞接觸后，會引起紅細(xì)胞膜破裂，釋放出細(xì)胞內(nèi)的血紅蛋白，發(fā)生溶血．通過測定某物質(zhì)引起的血紅蛋白釋放量，可以表征該物質(zhì)的溶血率．血液相容性較好的材料應(yīng)具有較低的溶血率．本研究中，共交聯(lián)瓣膜材料幾乎沒有溶血現(xiàn)象發(fā)生，溶血率僅為0．7%，與GA交聯(lián)組相當(dāng)，都遠(yuǎn)低于國際標(biāo)準(zhǔn)ISO 10993－4：2002所規(guī)定的血液相容性標(biāo)準(zhǔn)所允許的5%［17］，符合醫(yī)用生物瓣的要求．

血小板粘附性能實(shí)驗(yàn)是研究生物瓣血液相容性的重要內(nèi)容之一，因?yàn)檠“逭掣?、聚集是材料表面血栓形成過程中重要的一步［3］．有研究報(bào)道PC可以減少血小板聚集，進(jìn)而抑制血栓形成［12］，其作用機(jī)制可能與PC的強(qiáng)抗氧化性能有關(guān)．本研究血小板粘附實(shí)驗(yàn)結(jié)果中，PC交聯(lián)瓣膜單位面積粘附的血小板數(shù)量（95個）遠(yuǎn)小于GA交聯(lián)瓣膜（293個），顯示PC單獨(dú)交聯(lián)瓣膜可以有效減少血小板粘附，從而抑制血栓形成，具有較強(qiáng)的抗血栓形成的潛能．共交聯(lián)瓣膜由于PC的前交聯(lián)處理，血小板粘附量（193個）介于PC交聯(lián)瓣膜與GA交聯(lián)瓣膜之間，同樣具備抗血栓形成的潛能．雖然共交聯(lián)瓣膜抗血栓形成的能力不及PC單獨(dú)交聯(lián)瓣膜，但是卻明顯高于GA單獨(dú)交聯(lián)瓣膜．本研究從溶血和血栓形成兩個方面證明了共交聯(lián)瓣膜具有較好的血液相容性．

理想生物瓣必須在植入人體后不能引起明顯的免疫排斥反應(yīng)［2］．研究發(fā)現(xiàn)，脫細(xì)胞處理瓣膜可去除引起免疫排斥反應(yīng)的細(xì)胞成分，可有效地降低瓣膜的免疫原性［19］．有文獻(xiàn)報(bào)道GA可以掩蓋相關(guān)抗原，進(jìn)而降低GA交聯(lián)生物瓣的免疫原性［1，20］．但是，2003年Simon等［21］發(fā)現(xiàn)GA交聯(lián)的脫細(xì)胞生物瓣給兒科四例患者置換后，有三位因異體脫細(xì)胞瓣膜存在免疫反應(yīng)，并在術(shù)后一年內(nèi)死亡．看來脫細(xì)胞和GA交聯(lián)還不足以完全消除免疫原性的隱患．因此，進(jìn)一步降低或消除脫細(xì)胞生物瓣的免疫原性顯得尤為重要．本研究中共交聯(lián)瓣膜的巨噬細(xì)胞粘附率顯著低于GA交聯(lián)的瓣膜，表明其潛在免疫原性低于GA單獨(dú)交聯(lián)．這可能是由于具有抑制免疫原性的PC［13］的加入而實(shí)現(xiàn)的優(yōu)良效果．

4 結(jié) 論

綜上所述，PC與GA共交聯(lián)的豬脫細(xì)胞心臟瓣膜材料細(xì)胞相容性遠(yuǎn)高于GA單獨(dú)交聯(lián)的瓣膜材料，具有較低的細(xì)胞毒性．該共交聯(lián)瓣膜材料不引起溶血，具有一定的抗血栓形成潛能，顯示了良好的血液相容性．同時與GA交聯(lián)效果相比，共交聯(lián)瓣膜材料的免疫原性也顯著降低．可見，PC與GA共交聯(lián)作為制備人工生物瓣膜材料的新方法，很有可能應(yīng)用于臨床瓣膜置換術(shù)的生物瓣制備．

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