賴 璐，梅 平

（長(zhǎng)江大學(xué)化學(xué)與環(huán)境工程學(xué)院，湖北 荊州434023）

量子點(diǎn)（quantu m dots，QDs）是一種具有獨(dú)特光學(xué)和電學(xué)性質(zhì)的無機(jī)納米材料，具有多元激發(fā)一元發(fā)射、抗光漂白強(qiáng)等特性，因此被廣泛的用于生物醫(yī)學(xué)成像［1］、藥物載體［2］、DNA檢測(cè)［3］、電子工業(yè)［4］等領(lǐng)域。隨著量子點(diǎn)在生物成像及醫(yī)學(xué)診斷等領(lǐng)域的廣泛應(yīng)用，其生物安全性也引起了人們的關(guān)注。為了解量子點(diǎn)的生物安全性，人們從生物大分子［5］、亞細(xì)胞器［6］、細(xì)胞［7］、原生動(dòng)物［8－9］等不同生命層次研究了量子點(diǎn)的毒性大小以及致毒機(jī)制。蛋白質(zhì)是生物體內(nèi)最重要的一類生物大分子，是細(xì)胞原生質(zhì)的主要成分，與核酸一起共同構(gòu)成了生命體的物質(zhì)基礎(chǔ)。當(dāng)分散在生物流體（如血液）中時(shí)，量子點(diǎn)的表面可能會(huì)吸附蛋白質(zhì)或其他生物大分子，或者發(fā)生聚集生成不同大小的団簇［10］。這些作用均可能導(dǎo)致蛋白質(zhì)等生物大分子的結(jié)構(gòu)和功能發(fā)生變化。因此，研究量子點(diǎn)與蛋白質(zhì)的相互作用顯得非常必要。下面，筆者采用熒光光譜、紫外－可見吸收光譜、圓二色譜、紅外光譜等方法系統(tǒng)地研究了谷胱甘肽（GSH）修飾的Cd Te量子點(diǎn)和人血清白蛋白（HSA）之間的相互作用，探討了相互作用機(jī)理與相互作用熱力學(xué)參數(shù)，研究了量子點(diǎn)對(duì)HSA構(gòu)象的影響。

1 試驗(yàn)部分

1.1 試劑與儀器

1）試劑 人血清白蛋白（HSA），L－谷胱甘肽（GSH，98%），氯化鎘（99.99%），硼氫化鈉（99%），碲粉（99.999%，約200目）購(gòu)自Sig ma－Al drich公司。試驗(yàn)用水均采用Millipore超純水系統(tǒng)進(jìn)行純化（18.2 mΩ·c m－1）。

2）儀器 TU－1900雙光束紫外－可見分光光度計(jì)（北京普析通用儀器有限責(zé)任公司）；帶恒溫系統(tǒng)的LS－55熒光分光光度計(jì)（美國(guó)Perkin El mer公司）；J－810圓二色光譜儀（日本Jasco公司）；PB－10 p H計(jì)、BS110S電子分析天平（北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司）；KQ2200型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；Milli－Q Advantage A10超純水系統(tǒng)（美國(guó)Millipore公司）。

1.2 GSH修飾Cd Te量子點(diǎn)的制備

1）Cd前體的制備 稱取0.2 mmol Cd Cl2和0.24 mmol GSH，溶于50 ml超純水。邊攪拌邊逐滴加入1 mol／L Na OH溶液（超純水配制），調(diào)節(jié)pH值至8.0。將溶液轉(zhuǎn)移至三口燒瓶中，采用Schlenk技術(shù)抽氣充氣（高純Ar）反復(fù)6次，除盡溶液中的O2。

2）Te前體的制備 稱取0.2 mmol Te粉和0.5 mmol NaBH4，置于10 ml的離心管中，加入2 ml超純水，冰水浴下攪拌反應(yīng)直至成無色透明溶液。

在室溫下，強(qiáng)力攪拌下用注射器向Cd前體中加入0.4 ml新制備的Na HTe溶液（0.04 mmol），［Cd］∶［GSH］∶［Te］＝1∶1.2∶0.2（摩爾濃度比）。將三口燒瓶置于油浴中，冷凝回流不同時(shí)間，可得到最大發(fā)射波長(zhǎng)不同的Cd Te量子點(diǎn)。

3）純化方法 加入一定量的異丙醇至溶液變渾濁，離心棄上清，重復(fù)3次。將離心收集的沉淀置于真空干燥箱中，35℃干燥48 h。再將所得固體溶于磷酸鹽緩沖溶液（PBS）中，用0.22μm過濾頭過濾。最后用0.01 mol／L PBS緩沖液（p H＝7.4）透析。用紫外－可見吸收光譜（UV－vis）、熒光發(fā)射光譜（FL）以及X－射線衍射圖譜（XRD）對(duì)合成所得Cd Te QDs進(jìn)行結(jié)構(gòu)表征。

1.3 熒光光譜試驗(yàn)

采用熒光滴定法測(cè)定不同溫度下（298、304和310 K）Cd Te量子點(diǎn)對(duì)HSA的熒光猝滅作用。激發(fā)波長(zhǎng)為280n m，激發(fā)狹縫和發(fā)射狹縫寬度分別為5.0和10.0n m，記錄研究體系在290～430n m之間的熒光發(fā)射光譜。

1.4 紫外－可見吸收光譜

測(cè)定1×10－6mol／L HSA、1×10－6mol／L Cd Te量子點(diǎn)以及Cd Te量子點(diǎn)與 HSA 物質(zhì)的量之比為1∶1的混合溶液的紫外－可見吸收光譜。

1.5 圓二色譜

測(cè)定室溫下各不同體系溶液的遠(yuǎn)紫外（260～200nm）圓二色譜。選用池徑為0.1c m的石英比色皿，掃描時(shí)間為500nm／min，響應(yīng)時(shí)間為0.5s。HSA與Cd Te量子點(diǎn)的物質(zhì)的量之比分別為20∶1，10∶1，5∶1。以PBS緩沖液為空白扣除溶劑吸收峰。

2 結(jié)果與討論

2.1 Cd Te QDs的表征

圖1為GSH修飾Cd Te量子點(diǎn)的紫外－可見吸收光譜圖及熒光光譜圖。從圖1中可以看出，合成得到的Cd Te量子點(diǎn)有明顯的激子吸收峰，熒光峰位于581.5n m，熒光發(fā)射峰對(duì)稱性較好，半峰寬約為50n m。以上結(jié)果說明合成得到的Cd Te量子點(diǎn)尺寸分布比較均一、光學(xué)性能好。圖2為合成所得Cd Te量子點(diǎn)的固體粉末樣品的XRD表征。由圖2可知，Cd Te QDs的衍射譜圖與體相立方形Cd Te的衍射峰相近（PDF No.15－0770）。合成產(chǎn)物在2θ（入射角）＝24.0°、39.8°和47.0°處有3個(gè)明顯的衍射峰，分別對(duì)應(yīng)于立方晶系Cd Te的（111）、（220）和（311）3個(gè)晶面，說明合成所得Cd Te量子點(diǎn)有比較好的晶形結(jié)構(gòu)［11］。XRD衍射峰的寬化說明Cd Te量子點(diǎn)的粒徑比較小。

圖1 GSH－CdTe量子點(diǎn)的紫外－可見吸收光譜和熒光發(fā)射光譜圖（激發(fā)波長(zhǎng)為400n m）

圖2 GSH－CdTe量子點(diǎn)的X－射線衍射圖譜

2.2 熒光猝滅機(jī)理和猝滅常數(shù)

熒光是電子從高能級(jí)軌道躍遷回低能級(jí)軌道時(shí)所引起的光子發(fā)射過程，各種分子間的相互作用會(huì)導(dǎo)致熒光的猝滅，包括激發(fā)態(tài)的反應(yīng)、能量轉(zhuǎn)移、基態(tài)復(fù)合物的生成以及碰撞引起的猝滅［12］。根據(jù)猝滅常數(shù)與溫度的關(guān)系或者通過測(cè)定熒光壽命，猝滅機(jī)理通常被區(qū)分為動(dòng)態(tài)猝滅或者靜態(tài)猝滅。具體而言，動(dòng)態(tài)猝滅取決于擴(kuò)散過程，溫度升高粒子的擴(kuò)散速度越快，因此猝滅常數(shù)隨溫度的升高而增加。相反，溫度升高會(huì)導(dǎo)致復(fù)合物的穩(wěn)定性下降，因此靜態(tài)猝滅常數(shù)隨溫度的升高而減?。?2］。圖3為量子點(diǎn)對(duì)HSA的熒光猝滅圖譜。從圖3中可以看出，以280n m的激發(fā)光激發(fā)時(shí)，HSA在340n m處出現(xiàn)較強(qiáng)的熒光發(fā)射峰，而量子點(diǎn)在此處沒有熒光發(fā)射。隨著量子點(diǎn)的加入，HSA的熒光隨之逐漸降低。對(duì)于熒光猝滅，熒光強(qiáng)度的降低通?？梢杂媒?jīng)典的Ster n－Vol mer方程［13］描述：

式中，F(xiàn)0和F分別為未加入猝滅劑量子點(diǎn)和加入猝滅劑后的HSA的熒光強(qiáng)度；Ksv為Ster n－Vol mer猝滅常數(shù)；［Q］是猝滅劑的濃度。根據(jù)式（1），以F0／F對(duì)［Q］作圖，由直線的斜率可求得Ksv。圖4是不同表面修飾量子點(diǎn)在不同溫度下F0／F對(duì)［Q］圖。表1為根據(jù)圖4計(jì)算所得不同溫度下的猝滅常數(shù)Ksv。由表1中數(shù)據(jù)可知，量子點(diǎn)對(duì)HSA熒光的猝滅常數(shù)隨溫度的升高而減小，這表明量子點(diǎn)與HSA之間形成了復(fù)合物，猝滅機(jī)理是靜態(tài)猝滅而不是動(dòng)態(tài)猝滅。

圖3 不同濃度量子點(diǎn)溶液對(duì)HSA的熒光猝滅圖

圖4 不同溫度下量子點(diǎn)猝滅HSA內(nèi)源熒光的Ster n－Vol mer關(guān)系圖

表1 不同溫度下量子點(diǎn)猝滅HSA內(nèi)源熒光的猝滅常數(shù)與結(jié)合常數(shù)

為了進(jìn)一步驗(yàn)證表面帶負(fù)電的量子點(diǎn)對(duì)人血清白蛋白的猝滅機(jī)制是靜態(tài)猝滅，筆者測(cè)定了體系的紫外－可見吸收光譜的變化。動(dòng)態(tài)猝滅主要由HSA和猝滅劑之間的碰撞或能量轉(zhuǎn)移引起，所以HSA的紫外－可見吸收光譜不會(huì)發(fā)生變化［12］。而靜態(tài)猝滅是由于HSA和量子點(diǎn)之間形成了靜態(tài)復(fù)合物，所以會(huì)引起紫外－可見吸收光譜的變化。圖5是HSA的紫外－可見吸收光譜圖（曲線a）、量子點(diǎn)－HSA與同濃度量子點(diǎn)紫外－可見差譜（曲線b）。從圖5可以看出，HSA的吸收光譜與其差譜并不重合且有明顯差異，280與220n m處吸收峰的強(qiáng)度明顯下降。因此，Cd Te量子點(diǎn)對(duì)HSA的熒光猝滅是個(gè)靜態(tài)過程。

對(duì)于靜態(tài)猝滅過程，修正的Ster n－Vol mer方程［13］可以用來計(jì)算結(jié)合常數(shù)Ka：

式中，fa為熒光物質(zhì)（熒光基團(tuán)）可接近猝滅劑的部分（分?jǐn)?shù)）；Ka為有效猝滅常數(shù)，對(duì)于靜態(tài)猝滅機(jī)理可認(rèn)為是結(jié)合常數(shù)。由式（2）可知與斜率的比值即為結(jié)合常數(shù)Ka。圖6為不同溫度下根據(jù)修正Ster n－Vol mer方程擬合的結(jié)果，根據(jù)截距與斜率的比值可得到不同溫度下量子點(diǎn)和HSA的結(jié)合常數(shù)Ka（見表1）。表1中數(shù)據(jù)表明量子點(diǎn)和HSA的結(jié)合常數(shù)Ka隨溫度的升高數(shù)值減小，與靜態(tài)猝滅機(jī)制相符。

圖5 量子點(diǎn)紫外－可見吸收光譜圖

圖6 不同溫度下量子點(diǎn)猝滅HSA內(nèi)源熒光的修正Ster n－Vol mer關(guān)系圖

2.3 相互作用力類型

一般而言，內(nèi)源或外源物與生物大分子之間的相互作用力包括靜電相互作用、氫鍵、范德華力、疏水作用力和抗體結(jié)合位點(diǎn)的空間接觸等［14］。Ross和Subra manian總結(jié)了判斷有機(jī)小分子與生物大分子相互作用力的熱力學(xué)法則［15］。為了判斷量子點(diǎn)和人血清白蛋白之間的相互作用力，可通過van’t Hoff方程（3）計(jì)算相關(guān)的熱力學(xué)參數(shù)：

式中，K為反應(yīng)溫度下的結(jié)合常數(shù)；R是摩爾氣體常數(shù)。將l n K對(duì)1／T作圖，可得一直線，由直線的斜率和截距可求得ΔH 和ΔS。吉布斯自由能變（ΔG）可由式（4）得到：

表2為量子點(diǎn)和HSA相互作用的相關(guān)熱力學(xué)常數(shù)。由表2可知，ΔH＜0，ΔS＞0，表明HSA和Cd Te量子點(diǎn)之間的相互作用以靜電作用力為主［15］。

表2 量子點(diǎn)與HSA相互作用的熱力學(xué)參數(shù)

圖7 不同濃度量子點(diǎn)存在下HSA的圓二色譜

2.4 QDs對(duì)HSA二級(jí)結(jié)構(gòu)的影響

為了研究量子點(diǎn)對(duì)HSA二級(jí)結(jié)構(gòu)的影響，筆者考察了加入不同濃度量子點(diǎn)前后HSA的遠(yuǎn)紫外圓二色譜（CD）。在圓二色光譜中，HSA在208和222n m處存在2個(gè)負(fù)峰，通常被認(rèn)為是由于α－螺旋結(jié)構(gòu)中的肽鍵n→π＊電子轉(zhuǎn)移而產(chǎn)生的［16］。圖7是室溫下不同濃度的量子點(diǎn)對(duì)HSA圓二色光譜的影響。從圖7中可以看出，隨著量子點(diǎn)的加入，［θ］208和［θ］222的強(qiáng)度降低，這說明蛋白質(zhì)中的α－螺旋結(jié)構(gòu)含量減少。量子點(diǎn)與蛋白肽鏈上的氨基酸殘基發(fā)生了相互作用，破壞了氫鍵的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，使蛋白質(zhì)以更為松散的構(gòu)象存在［15］。蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)與其三級(jí)結(jié)構(gòu)相關(guān)，也與蛋白質(zhì)的活性有關(guān)，蛋白質(zhì)α－螺旋結(jié)構(gòu)含量的減少意味著HSA生物活性的喪失。為了定量描述量子點(diǎn)對(duì)人血清白蛋白不同類型的二級(jí)結(jié)構(gòu)數(shù)量的影響，筆者采用SELCON3算法分析了不同QDs濃度下人血清白蛋白的圓二色光譜。表3為未加入量子點(diǎn)和量子點(diǎn)加入之后HSA不同二級(jí)結(jié)構(gòu)的百分比。由表3可知，隨著量子點(diǎn)濃度的增加，α－螺旋結(jié)構(gòu)含量下降，而β－折疊和無規(guī)卷曲等結(jié)構(gòu)含量增加。

表3 量子點(diǎn)對(duì)HSA二級(jí)結(jié)構(gòu)的影響

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