藍(lán) 田， 呂芳麗， 李 娟， 陸達(dá)明， 黃 博， 黃世光△

(1暨南大學(xué)醫(yī)學(xué)院口腔醫(yī)學(xué)系，廣東廣州510632;2中山大學(xué)醫(yī)學(xué)院寄生蟲(chóng)教研室，廣東廣州510080)

傳統(tǒng)認(rèn)為肥大細(xì)胞主要參與IgE介導(dǎo)的過(guò)敏反應(yīng)，肥大細(xì)胞作為效應(yīng)和調(diào)節(jié)性免疫細(xì)胞在固有免疫的建立和適應(yīng)性免疫反應(yīng)的調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用近年來(lái)受到了重視［1-2］。然而，肥大細(xì)胞在牙周炎免疫病理中的作用一直為人們所忽視。Toll樣受體(Toll-like receptors，TLRs)是一類(lèi)識(shí)別病原相關(guān)分子模式的識(shí)別受體(pathogen-associated molecule patterns，PMAPs)，在固有免疫防御中起重要作用［3］。TLR4作為T(mén)oll樣受體家族的重要成員，是革蘭氏陰性菌細(xì)胞壁脂多糖成分的天然受體分子。我們?cè)谇捌诘难芯恐袌?bào)道了人慢性牙周炎牙齦組織中肥大細(xì)胞的表達(dá)不僅數(shù)量顯著增加，并見(jiàn)明顯脫顆?，F(xiàn)象，提示肥大細(xì)胞的募集和脫顆?？赡軈⑴c宿主牙周感染免疫反應(yīng)的病理過(guò)程［4-5］。然而，關(guān)于肥大細(xì)胞TLRs與牙周炎關(guān)系尚未見(jiàn)報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)免疫熒光雙染色的方法觀察不同病變程度牙周炎牙齦組織及肥大細(xì)胞上TLR4的表達(dá)情況，分析肥大細(xì)胞TLR4與牙周炎癥程度的相關(guān)性，探討肥大細(xì)胞TLR4在牙周炎發(fā)病中的可能作用。

材料和方法

1 研究對(duì)象

1.1 牙周炎病例選擇 選擇2010年～2012年在暨南大學(xué)荔灣口腔教學(xué)醫(yī)院牙周科門(mén)診就診的自愿接受本研究的牙周炎患者，年齡為25～65歲，其中男性37名(47歲±12歲)，女性31名(43歲±12歲)，各實(shí)驗(yàn)組在年齡、性別上差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。受試者均無(wú)糖尿病和其它系統(tǒng)疾病;6個(gè)月內(nèi)無(wú)服用抗生素藥物治療;無(wú)食物、藥物過(guò)敏史;非孕婦或服用避孕藥的婦女;1年內(nèi)沒(méi)有進(jìn)行牙周手術(shù)治療。納入標(biāo)準(zhǔn)依據(jù)美國(guó)牙周病學(xué)會(huì)1999年的牙周病新分類(lèi)指南［6］;所有受試者均簽署知情同意書(shū)。

1.2 分組 (1)正常對(duì)照組:無(wú)牙周袋，無(wú)附著喪失，X線(xiàn)片顯示無(wú)牙槽骨吸收，牙齦無(wú)炎癥;(2)輕度牙周炎組:牙齦有炎癥，探針出血，牙周袋≤4 mm，附著喪失≤2 mm，X線(xiàn)片顯示牙槽骨吸收不超過(guò)根長(zhǎng)的1/3，可有或無(wú)口臭;(3)重度牙周炎組:牙周袋＞6 mm，附著喪失≥5 mm，X線(xiàn)片顯示牙槽骨吸收超過(guò)根長(zhǎng)的1/2，甚至達(dá)根長(zhǎng)的2/3，多根牙有根分叉病變，牙齒多有松動(dòng)，牙齦炎癥明顯或發(fā)生牙周膿腫。

1.3 取材 輕度牙周炎組23例，為需要接受臨床牙冠延長(zhǎng)術(shù)者;重度牙周炎組25例，取自無(wú)保留價(jià)值或預(yù)后極差的重度牙周炎需要拔除者;正常對(duì)照組20例，取自因正畸治療需要拔除的牙周健康的前磨牙。

2 方法

2.1 組織標(biāo)本采集、處理與觀察 牙齦組織標(biāo)本于4%中性甲醛液中固定48 h以上，制成頰舌向5μm厚度連續(xù)切片，HE染色，光學(xué)顯微鏡下觀察牙齦組織學(xué)改變。由2名病理醫(yī)師盲法觀察，并對(duì)牙齦組織的炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)情況進(jìn)行評(píng)分，求其平均值。炎癥程度評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)參照Huang等［7］的方法:0:無(wú)炎癥細(xì)胞浸潤(rùn);1:輕度炎癥，炎癥細(xì)胞局部呈小灶狀浸潤(rùn);2:中度炎癥，炎癥細(xì)胞呈灶狀及片狀浸潤(rùn);3:重度炎癥，炎癥細(xì)胞在牙齦組織內(nèi)呈彌漫性浸潤(rùn)。

2.2 TLR4免疫組織化學(xué)SP法染色及結(jié)果處理 免疫組化染色:采用免疫組織化學(xué)SP法對(duì)牙齦組織切片進(jìn)行染色，Ⅰ抗TLR4(武漢博士德)，稀釋濃度為1∶100。采用SP法(試劑盒為 PV9002，北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)染色、DAB(DAB染色試劑盒，北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)顯色劑顯色，陰性對(duì)照采用PBS緩沖液代替I抗，蘇木素復(fù)染。組織化學(xué)法染色陽(yáng)性信號(hào)為棕黃色細(xì)小顆粒，定位于細(xì)胞核或細(xì)胞漿。對(duì)每個(gè)切片標(biāo)本中陽(yáng)性細(xì)胞進(jìn)行記數(shù)。每個(gè)切片記數(shù)5個(gè)400倍視野下總細(xì)胞數(shù)及陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)，計(jì)算陽(yáng)性細(xì)胞比例(%)，取其平均值。

2.3 肥大細(xì)胞和TLR4免疫熒光雙染色法及結(jié)果處理 采用免疫熒光雙染色法對(duì)牙齦組織切片進(jìn)行染色。Ⅰ抗:tryptase抗體(Abcam)，稀釋濃度為1∶200;TLR4抗體(武漢博士德)，稀釋濃度為1∶100。Ⅱ抗:山羊抗鼠IgG(H+L)Alex Flour? 555和山羊抗兔IgG(H+L)Alex Flour?488(Cell Signaling Technology)，稀釋濃度為1∶200。免疫熒光陽(yáng)性信號(hào)為肥大細(xì)胞表達(dá)綠色熒光，TLR4表達(dá)紅色熒光，定位于細(xì)胞核或細(xì)胞漿，同一視野肥大細(xì)胞與TLR4重疊后為黃色熒光。染色切片由2名病理醫(yī)師于免疫熒光顯微鏡觀察表達(dá)TLR4的肥大細(xì)胞數(shù)量，取其平均值。每張切片在高倍視野(×400)下選取黃色熒光細(xì)胞數(shù)目最多的5個(gè)視野進(jìn)行計(jì)數(shù)，計(jì)算5個(gè)視野中表達(dá)TLR4的肥大細(xì)胞的總數(shù)。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件分析。牙齦組織炎癥程度評(píng)分的組間比較采用Kruskal-Wallis檢驗(yàn);牙齦組織TLR4陽(yáng)性細(xì)胞比例和TLR4陽(yáng)性肥大細(xì)胞數(shù)量的組間比較采用完全隨機(jī)設(shè)計(jì)的單因素方差分析(ANOVA)，組間兩兩比較采用最小顯著性差異法(LSD法)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 組織學(xué)分析

牙齦組織的組織學(xué)改變見(jiàn)圖1，正常對(duì)照組未見(jiàn)炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)(圖1A);輕度牙周炎組見(jiàn)少量散在炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)(圖1B);重度牙周炎組有明顯的炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，出現(xiàn)大范圍的淋巴細(xì)胞、漿細(xì)胞和肥大細(xì)胞浸潤(rùn)，可見(jiàn)散在分布的巨噬細(xì)胞樣細(xì)胞及多形核細(xì)胞(圖1C)。重度牙周炎組炎癥程度評(píng)分明顯高于輕度牙周炎組(P＜0.05)。

Figure 1.Histological changes of human gingival tissues(HE staining，× 400)and their scores of inflammation.A:healthy control group(n=20);B:mild chronic periodontitis group(n=23);C:severe chronic periodontitis group(n=25).Mean±SD.*P＜0.05 vs A;#P＜0.05 vs B.圖1 各組牙齦組織的組織學(xué)變化和炎癥程度評(píng)分

2 牙齦組織TLR4免疫組織化學(xué)染色結(jié)果

牙齦組織TLR4免疫組化染色結(jié)果見(jiàn)圖2，正常對(duì)照組牙齦組織可見(jiàn)散在分布數(shù)量較少的TLR4表達(dá)(圖2A);輕度牙周炎組牙齦組織中TLR4陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)明顯增加(圖2B);重度牙周炎組牙齦組織見(jiàn)大量的TLR4表達(dá)(圖2C)。與正常對(duì)照組相比較，牙周炎組的TLR4明顯上升(P＜0.05);重度牙周炎組的TLR4陽(yáng)性細(xì)胞比例顯著高于輕度牙周炎組(P＜0.05)。

Figure 2.Expression of TLR4 in human gingival tissues(immunohistochemical staining，×400).A:healthy control group(n=20);B:mild chronic periodontitis group(n=23);C:severe chronic periodontitis group(n=25).Mean±SD.*P＜0.05 vs A;#P＜0.05 vs B.圖2 免疫組織化學(xué)染色檢測(cè)各組牙齦組織中TLR4的表達(dá)

3 肥大細(xì)胞和TLR4免疫熒光雙染色結(jié)果

各組牙齦組織肥大細(xì)胞和TLR4免疫熒光雙染色結(jié)果見(jiàn)圖3。正常對(duì)照組牙周組織中可見(jiàn)小量散在分布的肥大細(xì)胞和TLR4陽(yáng)性表達(dá)的肥大細(xì)胞(圖3A);輕度牙周炎組牙齦組織中肥大細(xì)胞數(shù)和TLR4陽(yáng)性肥大細(xì)胞數(shù)明顯增加(圖3B);重度牙周炎組牙齦組織中見(jiàn)大量的肥大細(xì)胞和TLR4陽(yáng)性肥大細(xì)胞(圖3C)。與正常對(duì)照組相比，牙周炎組TLR4陽(yáng)性表達(dá)的肥大細(xì)胞數(shù)量明顯上升(P＜0.05);重度牙周炎組TLR4陽(yáng)性表達(dá)的肥大細(xì)胞的數(shù)量顯著多于輕度牙周炎組(P＜0.05)。

Figure 3.Expression of TLR4 on mast cells in human gingival tissues(immunofluorescet staining， × 400).A:healthy control group(n=20);B:mild chronic periodontitis group(n=23);C:severe chronic periodontitis group(n=25).Mean±SD.*P＜0.05 vs A;#P＜0.05 vs B.圖3 免疫熒光染色檢測(cè)各組牙齦組織中肥大細(xì)胞TLR4的表達(dá)

討 論

Toll樣受體是一類(lèi)廣泛存在于哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)的生物模式識(shí)別受體，能夠識(shí)別各種微生物表面的高度保守結(jié)構(gòu)，如細(xì)菌脂多糖、肽聚糖、脂蛋白、細(xì)菌DNA、雙鏈 RNA等。TLRs信號(hào)通過(guò)上調(diào)抗原提呈細(xì)胞(antigen-presenting cell，APC)表面的共刺激分子及APC分泌的炎癥細(xì)胞因子，誘導(dǎo)T、B淋巴細(xì)胞向效應(yīng) T、B淋巴細(xì)胞分化，調(diào)節(jié)適應(yīng)性免疫反應(yīng)［8-9］。研究發(fā)現(xiàn)中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞及單核細(xì)胞均表達(dá)TLRs，可識(shí)別不同的病原體，并在病原體入侵時(shí)快速激活固有免疫，引起炎癥反應(yīng)，殺滅入侵的病原體［10］。TLR4是Toll樣受體家族中最早被發(fā)現(xiàn)的成員之一，主要識(shí)別革蘭氏陰性菌細(xì)胞壁脂多糖結(jié)構(gòu)［11］。牙周病主要是革蘭氏陰性厭養(yǎng)菌如牙齦卟啉單胞菌(Porphyromonas gingivalis)等對(duì)牙周組織所致慢性病理?yè)p害的結(jié)果。研究顯示，牙周炎患者牙周組織中TLR2、3、4和9的表達(dá)均高于牙周健康者［12-13］，其中TLR2基因多態(tài)性與日本人群侵襲性牙周炎密切相關(guān)［14］，而TLR2和TLR4在血脂異常性牙槽骨破骨細(xì)胞分化中起著重要作用［15］。在牙周炎組織中，研究發(fā)現(xiàn)TLR4主要表達(dá)于結(jié)締組織中;而在牙周炎患者臨床相對(duì)健康的牙齦組織和健康牙齦組織中，未發(fā)現(xiàn)TLR4的表達(dá)，提示TLR4參與了牙周炎的免疫過(guò)程［16］。研究還顯示TLR4在人牙齦成纖維細(xì)胞上的表達(dá)水平影響牙齦組織的炎癥反應(yīng)程度［17］。本研究采用免疫組化方法觀察到TLR4陽(yáng)性細(xì)胞在慢性牙周炎結(jié)締組織中的比例較正常對(duì)照組明顯增大，重度慢性牙周炎組TLR4表達(dá)的程度明顯高于輕度慢性牙周炎組，提示TLR4與牙周炎癥程度密切相關(guān)。

近年人們認(rèn)識(shí)到肥大細(xì)胞具有獨(dú)特的免疫性能，除了在過(guò)敏和自身免疫性疾病中發(fā)揮重要作用外，還是重要的效應(yīng)和調(diào)節(jié)性免疫細(xì)胞，能夠啟動(dòng)快速而持續(xù)的免疫反應(yīng)，對(duì)固有免疫和適應(yīng)性免疫均有重要作用［18-19］。肥大細(xì)胞膜表面的TLRs受體，能夠識(shí)別廣泛的病原體產(chǎn)物以及損害相關(guān)分子模式［20］;而且，肥大細(xì)胞被激活后除了可新合成介質(zhì)外，還預(yù)先儲(chǔ)備了大量的介質(zhì)如組胺、蛋白酶、細(xì)胞因子(如 IFN-γ、TNF-α、IL-4、IL-5、IL-6、IL-10、IL-13、IL-16)和趨化因子等，一旦遇到相應(yīng)的刺激，肥大細(xì)胞立即釋放介質(zhì)并啟動(dòng)固有免疫反應(yīng)，引起炎癥反應(yīng)或參與機(jī)體的防御反應(yīng)［21-22］。細(xì)菌成分和炎癥細(xì)胞因子均可調(diào)節(jié)肥大細(xì)胞表面TLR4的表達(dá)，肥大細(xì)胞TLRs被激活后，不僅與其抗菌防御和炎癥反應(yīng)的進(jìn)展有關(guān)，也影響過(guò)敏反應(yīng)的進(jìn)程［23］。研究發(fā)現(xiàn)，TLRs被激活后可導(dǎo)致Th1型細(xì)胞因子的產(chǎn)生以及Th1細(xì)胞極化［24］;人和小鼠肥大細(xì)胞表面的TLR4受體可協(xié)同作用調(diào)節(jié)FcεRⅠ介導(dǎo)的肥大細(xì)胞信號(hào)通路，促進(jìn)肥大細(xì)胞脫顆粒以及釋放Th2細(xì)胞因子［25］。本研究采用免疫熒光雙染色法證實(shí)了人慢性牙周炎牙齦組織的肥大細(xì)胞表達(dá)TLR4，我們的觀察發(fā)現(xiàn)重度牙周炎牙齦組織中，肥大細(xì)胞TLR4的表達(dá)率遠(yuǎn)高于輕度牙周炎組，提示肥大細(xì)胞TLR4可能參與牙周組織的炎癥反應(yīng)，在牙周炎的發(fā)病和疾病進(jìn)程中起著重要的作用。但牙周炎組織內(nèi)的肥大細(xì)胞如何通過(guò)TLR4識(shí)別牙周致病菌抗原而調(diào)節(jié)牙周病，以及肥大細(xì)胞如何通過(guò)TLR4信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑調(diào)節(jié)牙周病發(fā)生和發(fā)展的作用機(jī)制尚需進(jìn)一步研究。