魏 楊，徐亞鉑，劉向波，康相濤,2，田亞東,2*

(1.河南農業(yè)大學 牧醫(yī)工程學院，河南 鄭州 450000；2.河南省家禽種質資源創(chuàng)新工程中心，河南 鄭州 450000)

膽固醇，被稱為膽甾醇[1]，是動物細胞膜的重要成分之一[2]，許多類固醇激素和膽汁酸生成的前體。對于大多數(shù)組織來說，保證膽固醇的供給，維持其代謝平衡是十分重要的。但相關研究表明，膽固醇水平的高低與人類健康有著密切的關系，人體從食物中攝入過量的膽固醇，會使血液中膽固醇含量增加，然而高膽固醇血癥是動脈粥樣硬化和冠心病的重要致病因素之一[3]。美國相關研究結果表明，通過調節(jié)人類膳食中的膽固醇含量，降低血漿中膽固醇含量的1%，可以減少2%的冠心病發(fā)病率[3]。

3-羥基-3-甲基戊二酸單酰輔酶A還原酶(HMGCR)是膽固醇合成過程中的限速酶，在膽固醇合成途徑中起到關鍵調節(jié)作用[4]。雞HMGCR基因位于Z染色體上，包含20個外顯子和19個內含子。本研究的目的是探討HMGCR基因多態(tài)性與雞蛋膽固醇含量之間的關聯(lián)性，從而為培育出一種低膽固醇含量蛋雞新品系提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

選取絲羽烏骨雞健康母雞225只，單籠飼養(yǎng)于相同的管理條件下。30周齡時連續(xù)采集每個個體的雞蛋3枚，用于測定雞蛋膽固醇含量。在雞蛋收集結束后，采集每個個體翅靜脈血液。利用酚-氯仿法從血液中提取基因組DNA，并溶解于TE中，保存于4℃直至使用。

1.2 雞蛋膽固醇含量測定

準確稱取5 g蛋黃液用蒸餾水將其定容于50 mL容量瓶中制成原始蛋黃稀釋液。吸取原始蛋黃稀釋液1.0 mL，分別加入95%乙醇3.0 mL和50%氫氧化鉀溶液2.0 mL，置于60℃水浴中皂化60 min。皂化結束后冷卻，分別加入5.0 mL正己烷和3.0 mL蒸餾水，混合均勻，靜置，直至正己烷與蒸餾水分層清晰。吸取上清液0.5 mL，在40℃下恒溫抽真空干燥，隨后使用0.5 mL甲醇溶解作為高效液相分析樣品。

色譜條件如下：以100%色譜級甲醇做為流動相，進樣量為5 μL，在柱溫38 ℃、流速為1.0 mL/min的條件下，以205 nm波長進行檢測。

1.3 引物設計

根據(jù)混合DNA池測序結果發(fā)現(xiàn)，在Exon17及Exon18內分別含有一個突變位點，將其命名為g.12217G>T和 g.12684T>C。使用Oligo6.0軟件設計特異性引物，所用引物由上海生工生物工程技術服務有限公司合成。引物信息見表1。

1.4 PCR擴增及CRS-PCR-RFLP

PCR反應體系為25 μL體系：2×Taq MasterMix 12.5 μL，引物 (10 pmol/μL)各1 μL，DNA模板1 μL，超純水9.5 μL。PCR反應條件為：95 ℃預變性5 min，95 ℃變性30 s，57.7°C (g.12217G>T) or 62 ℃ (g.12684T>C)退火30 s，72 ℃延伸30 s，共30個循環(huán)，72 ℃延伸10 min。

表1 引物序列Table 1 Primer sequences

CRS-PCR-RFLP反應條件為：10 μL PCR產物、10 U限制性內切酶、2 μL buffer和7.7 μL的 ddH2O混合，37 ℃過夜。酶切產物均使用3.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測分型。

1.5 統(tǒng)計分析

采用Regression對雞蛋中膽固醇含量做回歸方程。根據(jù)電泳結果計算基因型頻率及等位基因頻率。使用PopGene 32軟件(population genetic analysis, version 1.31)計算該群體的遺傳變異。根據(jù)公式計算多態(tài)信息含量(Polymorphic Information Content , PIC)[5]及雜合度(heterozygosity, H)[6]。利用SPSS 17.0中的一般線性模型分析不同基因型與相關性狀的關聯(lián)性。模型如下：

Y =μ+ G+E

式中：Y為個體表型值，μ為群體均值，G為標記基因型效應，E為隨機誤差；成對比較采用SPSS17.0分析軟件Borferroin法。

2 結果與分析

2.1 絲羽烏骨雞蛋膽固醇含量測定

對225只30周齡絲毛烏骨雞所產的675枚蛋進行雞蛋膽固醇含量測定，結果見表2。標準膽固醇溶液(a)及蛋黃樣品(b)的高效液相色譜分離結果見圖1。在選擇的色譜條件下，膽固醇的保留時間為9 min。以膽固醇濃度分別為0.05，0.10，0.20，0.30，0.40，0.50 mg/mL的標準膽固醇工作液上樣，上樣量為5 μL，以峰面積為縱坐標Y、膽固醇濃度為橫坐標X繪制標準曲線(如圖2所示)，并進行線性回歸，回歸方程為Y=2258X+12.33，相關系數(shù)R2=0.999。根據(jù)此公式計算出蛋黃中膽固醇含量及全蛋中膽固醇含量(表2)。

表2 絲羽烏骨雞雞蛋膽固醇含量測定Table 2 The determination silkies' egg cholesterol

圖1 高效液相色譜圖 Fig.1 HPLC Finger Print a.標準膽固醇樣品；b.蛋黃樣品a.Standard cholesterol samples；b.Egg yolk sample

圖2 膽固醇濃度標準曲線Fig. 2 The standard curve of cholesterol

2.2 雞HMGCR基因遺傳變異的檢測

為了在雞HMGCR基因的PCR產物中創(chuàng)造HinfI限制性內切酶的識別位點，在g.12217G>T引物對的下游引入一個錯配位點。PCR產物經(jīng)消化后使用3.0%瓊脂糖凝膠進行分型，酶切圖片顯示了三種基因型，分別被命名為GG (141+21)bp, GT (162+141+21)bp, TT (162bp)；采用導入Eco88I限制性內切酶切位點的方法，對g.12684T>C突變位點設計引物對其進行PCR-RFLP。對擴增片段進行酶切消化后后，使用3.0%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測，酶切結果顯示三種帶型，分別命名CC (250+22)bp, CT (272+250+22)bp, TT (272bp)，如圖3所示。

2.3 群體遺傳學分析

該群體遺傳學分析見表3。由表3可知：群體中g.12217G>T突變位點的TT基因型頻率(0.084)和T等位基因頻率(0.477)較低；g.12684T>C突變位點TC基因型個體出現(xiàn)的頻率(0.829)遠遠高于其他兩種基因型。G.12217G>T和g.12684T>C兩個突變位點的雜合度為中等水平，可知這兩個等位基因群體內遺傳變異的程度不大；多態(tài)信息含量值均為中度多態(tài)(0.5>PIC>0.25)。

圖3 HMGCR基因酶切產物電泳圖(3.0%瓊脂糖) Fig. 3 3.0% agarose gel electrophoresis for digesting HMGCR gene PCR Product

表3 群體中兩個SNPs位點群體遺傳學分析Table 3 Population genetic analysis of the two SNPs in the population

2.4 HMGCR基因各突變位點與絲毛烏骨雞蛋膽固醇含量的關聯(lián)分析

g.12217G>T及g.12684T>C突變位點不同基因型與絲毛烏骨雞蛋膽固醇含量之間的關聯(lián)性分析見表4。G.12217G>T突變位點僅對雞蛋中膽固醇含量具有顯著的影響(P<0.1)，GG基因型雞蛋中膽固醇含量顯著低于其他兩種基因型。G.12684T>C突變位點僅對蛋黃重具有顯著影響(P<0.1)，CC基因型的蛋黃重最大。

3 討 論

隨著我國經(jīng)濟的快速發(fā)展，人們消費水平極大提高及膳食中動物性食品比重的逐漸增加, 人們在追求畜產品數(shù)量的同時，對其風味、感觀滿意程度及保健功能也提出了更高的要求[7]。雞蛋是人們日常必備的動物性食品之一，但雞蛋中較高的膽固醇含量都已成為制約市場需求量的重要因素。

3.1 膽固醇在產蛋雞體內的代謝

體內膽固醇的來源分為外源性吸收和內源性合成兩部分。外源性吸收主要源于飼料，內源性合成主要源于肝臟。產蛋雞的脂質代謝與哺乳動物不同，產蛋雞攝入的飼料以植物飼料為主，所以產蛋雞從飼料中攝入的膽固醇含量很少，其主要是通過自身的膽固醇合成來滿足自身生理及生產的需要。蛋雞每天合成約300 mg膽固醇，其中大約2/3沉積在雞蛋中[8]，10 mg左右直接排入腸道[9]，其余的則發(fā)生轉化(如類固醇激素、維生素D3等)和形成膜結構。對于產蛋雞而言，肝臟和卵巢是合成膽固醇的主要場所。肝臟不僅是脂質合成速度最快，也是合成量最多的器官，是機體最活躍的合成部位和血漿中膽固醇的主要來源[8]。膽固醇合成過程比較復雜，有近30步反應，整個過程可分為3個階段[10]。乙酰CoA是膽固醇合成的直接原料，它來自葡萄糖、脂肪酸及某些氨基酸的代謝產物。另外，還需要腺嘌呤核苷三磷酸(ATP)供能和煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)供氫進行一系列的氧化還原反應，經(jīng)過生成HMG-CoA、甲羥戊酸、鯊烯、羊毛固醇等中間產物，最終生成膽固醇。合成1分子膽固醇需消耗18分子乙酰輔酶A、36分子ATP和16分子NADPH。其中HMGR-CoA還原酶在生成甲羥戊酸這一過程中決定了合成反應的快慢，也是外界調控體內膽固醇合成的主要靶點。

表4 HMGCR基因g.12217G>T和g.12684T>C不同基因型與雞蛋性狀的關聯(lián)分析Table 4 Associations of g.12217G>T and g.12684T>C genotypes of the HMGCR gene with egg traits

3.2 HMGCR基因兩個多態(tài)位點與雞蛋膽固醇含量相關性分析

隨著人的老齡化，心血管疾病逐漸成為威脅人類健康的殺手，臨床和流行病學研究發(fā)現(xiàn)動脈粥樣硬化是導致心血管疾病的重要因素，而高脂、高膽固醇膳食與動脈粥樣硬化有著密切關系。膳食膽固醇(CHOL)主要來源于動物性食物，雞蛋是動物性食品中CHOL含量較高的一種，平均213 mg/枚[11]。1972年，美國膳食研究委員會采納了美國心臟研究協(xié)會的觀點，建議每天攝入膽固醇應少于300 mg，為遵循這一建議，每周食用全蛋不宜超過3枚[12]。人們由于擔心膽固醇過高會引起動脈粥樣硬化，從而減少了雞蛋的食用，這就是美國和加拿大雞蛋消費下降的重要原因[11]。

陸俊賢等[13]對我國7個品種蛋雞的雞蛋膽固醇含量進行了測定，結果發(fā)現(xiàn)我國地方雞種雞蛋的膽固醇含量平均約為196 mg/枚，低于國外雞種，但是差異不明顯。楊朋坤[14]對四個品種雞蛋的膽固醇含量進行了研究，結果發(fā)現(xiàn)絲羽烏雞蛋的膽固醇含量最高，31周齡絲羽烏骨雞雞蛋膽固醇含量約為262.9339 mg/100 g雞蛋。本試驗中絲毛烏骨雞雞蛋的膽固醇含量平均約為456.6 mg/100 g 雞蛋，明顯高于他們的研究結果，由于不同的飼養(yǎng)環(huán)境及飼糧組成的差異所造成的偏差。

孫憲如[15]建議在降低膽固醇方面應該利用雜交優(yōu)勢，選擇膽固醇含量最低的蛋作為種蛋，可使后代所產蛋中膽固醇含量降低5%～7%。CaPo(1995)報道通過雜交得到的品種每克蛋黃膽固醇含量和其他與之相比較的品種間差異顯著。蛋黃膽固醇濃度的值變異較大，大約為20%～40%，蛋黃中膽固醇的含量與遺傳具有一定的關系，其遺傳力約為0.21～0.26[16]，且性狀的表達受環(huán)境因素影響較大，通過常規(guī)遺傳育種手段很難有效穩(wěn)定地降低蛋黃膽固醇，因此我們需要通過選育或基因突變來獲得產低膽固醇雞蛋的新品系[17-19]。

蛋黃膽固醇濃度或雞蛋膽固醇含量為數(shù)量性狀其表達受一系列微效基因的調控，其中包括3-甲基-3-羥基戊二酸單酰輔酶A還原酶(HMGCR)基因[20]、載脂蛋白B(APo-B)基因、卵母細胞卵黃生成受體(OVR)基因等[21]。HMGCR是機體合成膽固醇過程中的限速酶，APo-B在血液中與膽固醇結合，起到運輸?shù)淖饔茫鳲VR則通過內吞作用介導脂蛋白完整轉運進入生長中的卵母細胞，最后使膽固醇沉積在蛋黃中。從這些基因中尋找出影響膽固醇含量的分子標記，然后對低膽固醇品系進行標記輔助選擇，對加快選育進程具有重要的作用。

4 結 論

本試驗中HMGCR基因g.12217G>T位點與雞蛋中膽固醇含量顯著相關，其中GG基因型個體顯著小于GT基因型和TT基因型個體；HMGCR基因g.12684T>C位點對蛋黃重具有顯著的影響，其中CC基因型個體顯著大于TT基因型和TC基因型個體，將這兩個位點的結果結合在一起，我們可以得到野生型個體雞蛋的蛋黃重且雞蛋中膽固醇含量低，這一結論有利于日后對產低膽固醇雞蛋新品種的選育，可以避免雞蛋中膽固醇含量高但蛋黃小這一缺點，可以更好地滿足消費者的消費心理。

參考文獻:

[1] 王鏡巖,朱圣庚,徐長法.生物化學(上冊)[J].3版.北京：高等教育出版社，2002.

[2] 毛應華.膽固醇對細胞膜結構和功能的影響[J]. 國外醫(yī)學衛(wèi)生學分冊，2004,31(6):352-355.

[3] LRCP.The lipid research clinic coronary Primary trial results.The relation of reduction in incidence of coronary heart disease to cholesterol lowing[J].J Am Med Assn,1984,251:365-374.

[4] Goldstein J L,Brown M S.Regulation of the mevalonate pathway[J].Nature,1900,343(6257):425.

[5] Botstein D,White R L,Skolnick M,et al. Construction of a genetic linkage map in man using restriction fragment length polymorphisms[J]. Am J Hum Genet,1980,32:314-331.

[6] Nei M,Li W H. Mathematic model for studying genetic variation in terms of restriction endonucleaes[J]. PNAS (USA).1979,76:5 269-5 273.

[7] 張佳程,駱承庠.生物方法降低食品中膽固醇的研究趨勢[J].食品科學,1997,18(11):50-53.

[8] Naber E C. Nutrient and drug effects on cholesterol metabolism in the laying hen[J]. Federation Proc, 1983, 42:2 486-2 493.

[9] Sim J S, Kit t s W D, Bragg D B. Influence of dietary oil, cholesterol, and soysterol on fecal neutural and acidic steroid excretion in laying hens[J]. Poultry Sci, 1980, 59:325-327.

[10] 王曉鳳．豬HMGR基因的克隆、表達、染色體定位及多態(tài)性分析[D]．北京：中國農業(yè)大學，2006．

[11] 王彥文.對低膽固醇雞蛋的新認識[J].中國畜牧獸醫(yī),1995,22(2):35.

[12] Herron K L, Fernandez K L.Are the current dietary guidelines regarding egg consum ption appropriate[J].The Journal of Nutrition,2004,134(1):187-190.

[13] 陸俊賢,葛慶聯(lián),施祖瀚，等.不同品種雞蛋中膽固醇含量比較[J].中國家禽,2010,32(8):64-65.

[14] 楊朋坤.不同品種雞蛋膽固醇沉積規(guī)律和相關基因表達的研究[D].鄭州：河南農業(yè)大學,2011.

[15] 孫憲如.蛋黃膽固醇含量與某些性狀的相關研究[J].西南民族學院學報：自然科學版,1994(1):123-125.

[16] 崔學平,斯大勇,崔揚健.雞蛋膽固醇問題的思考,內江職業(yè)技術學院學報,2008,2(4):63-66.

[17] Bair,Marion.Yolk cholesterol in eggs from various avian species[J].Poult Sci,1978,57:1 260-1 265.

[18] Klicka J.Feeding drinking and excretion[M]∥New York：USA.Turtles PersPectives and Research，1979：229-246.

[19] Rail T W.Central nervous system stimulants[C]∥Gilman A G,Goodman L S,Gilman A. In the Xan-thines in the Pharmacological Basis o f TheraPeutics.New York：Macmillan,1981：592-607.

[20] Ding J X,Jiang D C,Kurczy M,et al.Inhibition of HMG CoA reductase reveals an unex pected role for cholesterol during PGC migration in the mouse[J].BMC DeveloPmental Biology,2008,8:120-134.

[21] 陳東軍.雞蛋含量相關性研究膽固醇代謝候選基因SNPs篩查及其與蛋黃膽固醇[D].合肥:安徽農業(yè)大學,2010.