王 波，顧俊蓮，戴玉鑫，佟力軍，孟令娜，李 揚(yáng)

（1.內(nèi)蒙古林業(yè)總醫(yī)院病理科，內(nèi)蒙古 呼倫貝爾 022150；2.吉林大學(xué)白求恩醫(yī)學(xué)院病理生理學(xué)教研室，吉林 長春 130021）

放射治療是惡性腫瘤的主要治療方法，約70%的癌癥患者在治療過程中需要采用放射治療，但由于放射治療副作用大，預(yù)后不良，所以對(duì)于惡性腫瘤的聯(lián)合治療已經(jīng)越來越引起人們的重視。解熱鎮(zhèn)痛抗炎藥是一類具有抗炎、鎮(zhèn)痛，多數(shù)還具有抗炎抗風(fēng)濕作用的藥物。近期研究［1－2］發(fā)現(xiàn)：這類藥物不但能降低惡性腫瘤患病的危險(xiǎn)性，而且能抑制乳腺癌和前列腺癌等多種惡性腫瘤細(xì)胞的增殖。吲哚美辛是具有代表性的一類解熱鎮(zhèn)痛抗炎藥，國外研究［3］證實(shí)其對(duì)多種癌細(xì)胞具有抑制作用，但該藥物聯(lián)合放射治療對(duì)人急性髓系白血病的治療作用尚無相關(guān)報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)研究吲哚美辛聯(lián)合放射治療處理人急性髓系白血病HL－60細(xì)胞，觀察其對(duì)癌細(xì)胞的增殖抑制作用，為抗腫瘤研究提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞與主要試劑 HL－60細(xì)胞購自上海中科院細(xì)胞庫，IMDM和胎牛血清購自Gibco公司，吲哚美辛購自Sigma公司，實(shí)時(shí)熒光定量PCR mix購自Takala公司，MTT和臺(tái)盼藍(lán)購自上海鼎國公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng) HL－60細(xì)胞培養(yǎng)于含10%血清的IMDM中，37℃、CO2孵箱中培養(yǎng)傳代，次日傳代，更換新鮮培養(yǎng)基。新鮮接種的細(xì)胞換成含2%血清的IMDM，同時(shí)加入不同濃度（0、20、40、60、80和100μmol·L－1）的吲哚美辛處理細(xì)胞。放射劑量根據(jù)文獻(xiàn)選用3Gy進(jìn)行放射治療。放射處理?xiàng)l件：照射時(shí)在培養(yǎng)瓶下加墊厚度為2cm等效有機(jī)玻璃板，細(xì)胞在室溫下用直線加速器上的6MV X線照射，單次照射劑量分別為3Gy，平均劑量率為180cGy·min－1。

1.3 MTT法檢測細(xì)胞的增殖 取對(duì)數(shù)生長期的HL－60細(xì)胞，按每孔2×104接種于96孔板里，培養(yǎng)24h后，更換成含2%血清的IMDM，同時(shí)加入不同濃度（20、40、60、80和100μmol·L－1）的吲哚美辛處理細(xì)胞，每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔，在37℃、CO2孵箱中培養(yǎng)48h，每孔加入20μL MTT，繼續(xù)孵育4～6h，棄上清，加入150μL DMSO，輕輕混勻，于酶標(biāo)儀470nm處測吸光度（A）值，計(jì)算細(xì)胞增殖抑制率，細(xì)胞增殖抑制率＝（1－實(shí)驗(yàn)組A570值／對(duì)照組A570值）×100%。

1.4 臺(tái)盼藍(lán)染色法檢測細(xì)胞活力 實(shí)驗(yàn)設(shè)不加吲哚美辛的對(duì)照組、80μmol·L－1吲哚美辛組、3Gy X線照射組和吲哚美辛（80μmol·L－1）聯(lián)合照射（3Gy X線）組。細(xì)胞消化成單細(xì)胞懸液，采用0.4%臺(tái)盼藍(lán)染色并細(xì)胞計(jì)數(shù)，死細(xì)胞為藍(lán)紫色，活細(xì)胞為透明色，重復(fù)3次，取平均值，計(jì)算細(xì)胞活力抑制率，細(xì)胞活力抑制率（%）＝ ［1－（實(shí)驗(yàn)組A值－空白對(duì)照組A值）／（對(duì)照組A值－空白對(duì)照A值）］×100%。

1.5 RT－PCR檢測 HL－60細(xì)胞中 mRNA的表達(dá)用TRIzol試劑提取細(xì)胞總RNA，采用dNTP、逆轉(zhuǎn)錄酶等將RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，取適量進(jìn)行PCR反應(yīng)。GAPDH 實(shí)時(shí)引物序列：Sense，5′－AGAAGGCTGGGGCTCATTTG －3′；Antisense，5′－AGGGGCCATCCACAGTCTTC－3′，設(shè)計(jì)30個(gè)循環(huán)，退火溫度為58℃。PCNA實(shí)時(shí)引物序列：Sense，5′－GGTCCAGGGCTCCATCCT－3′；Antisense，5′－CCAGCAGGCCTCGTTGAT－3′，設(shè)計(jì)30個(gè)循環(huán)，退火溫度為56℃。Caspase－3實(shí)時(shí)引物序列：Sense，5′－TAACCAGGTGCTGTGGAGTA－3′；Antisense，5′－GTGGAATTGATGCGTGATGT－3′，設(shè)計(jì)30個(gè)循環(huán)，退火溫度為50℃。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，細(xì)胞增殖抑制率和細(xì)胞活力抑制率以表示，組間比較采用單因素方差分析。

2 結(jié) 果

2.1 吲哚美辛聯(lián)合照射作用下HL－60細(xì)胞增殖抑制率的變化 MTT結(jié)果顯示：與對(duì)照組比較，在3Gy X線照射下，80μmol·L－1吲哚美辛聯(lián)合照射組細(xì)胞的增殖抑制率最高；與對(duì)照組比較，80、100和200μmol·L－1吲哚美辛聯(lián)合照射組細(xì)胞的增殖抑制率明顯增加，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表1。

2.2 吲哚美辛聯(lián)合照射作用下HL－60細(xì)胞活力抑制率的變化 與對(duì)照組比較，80μmol·L－1吲哚美辛聯(lián)合3Gy X線照射組細(xì)胞活力抑制率明顯增加，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表2。

2.3 吲哚美辛聯(lián)合照射作用下 HL－60細(xì)胞中PCNA和Caspase－3mRNA表達(dá)的變化 與對(duì)照組比較，80μmol·L－1吲哚美辛聯(lián)合3Gy X線照射組HL－60細(xì)胞中PCNA mRNA表達(dá)明顯降低（P＜0.01），Caspase－3mRNA表達(dá)明顯增加（P＜0.01）。見圖1和表3。

表1 不同濃度吲哚美辛聯(lián)合照射作用下HL－60細(xì)胞的增殖抑制率Tab.1 The inhibitory rates of proliferation of HL－60cells after treated with different concentrations of indometnacin combined with radiation （n＝6，，η／%）

表1 不同濃度吲哚美辛聯(lián)合照射作用下HL－60細(xì)胞的增殖抑制率Tab.1 The inhibitory rates of proliferation of HL－60cells after treated with different concentrations of indometnacin combined with radiation （n＝6，，η／%）

＊ P＜0.05，＊＊P＜0.01compared with control group.

0±0.12 0±0.08 Indometnacin 40μmol·L－1＋3Gy X－rays radiation 1.57±0.01 19.07±0.1260μmol·L－1＋3Gy X－rays radiation 13.85±0.05 32.55±0.0780μmol·L－1＋3Gy X－rays radiation 45.89±0.14＊＊ 56.13±0.09＊＊100μmol·L－1＋3Gy X－rays radiation 25.73±0.08＊ 32.03±0.0624h 48h Control（0μmol·L－1＋3Gy X－rays radiation）Group Inhibitoryrate＊

表2 吲哚美辛聯(lián)合3Gy X線照射作用下HL－60的細(xì)胞活力抑制率Tab.2 The inhibitory rates of viabilities of HL－60cells after treated with indometnacin combined with radiation（n＝6，，η／%）

表2 吲哚美辛聯(lián)合3Gy X線照射作用下HL－60的細(xì)胞活力抑制率Tab.2 The inhibitory rates of viabilities of HL－60cells after treated with indometnacin combined with radiation（n＝6，，η／%）

＊P＜0.05，＊＊P＜0.01compared with control group；△P＜0.05compared with indometnacin group；#P＜0.05compared with 3Gy X－rays radiation group.

Group Inhibitoryrate 24h 48h Control 15.24±3.21 12.68±3.59 Indometnacin（80μmol·L－1）34.34±2.16 30.02±5.473Gy X－rays radiation 59.42±2.43＊ 53.13±5.17＊Indometnacin（80μmol·L－1）＋3Gy X－rays radiation 78.35±4.13＊△#75.42±3.91＊＊△#

圖1 吲哚美辛聯(lián)合照射作用下HL－60細(xì)胞中PCNA和Caspase－3mRNA 的表達(dá)Fig.1 The expressions of PCNA and Caspase－3mRNA in HL－60cells after treated with indometnacin combined with radiation

3 討 論

據(jù)統(tǒng)計(jì)，白血病約占腫瘤總發(fā)病率的3%，是兒童和青年中最常見的一種惡性腫瘤［4－6］。在世界各國中歐洲和北美白血病的發(fā)病率最高，其死亡率為3.2～7.4／10萬人口。亞洲和南美洲發(fā)病率較低，死亡率為2.8～4.5／10萬人口。白血病的治療一直局限于放化療，但不良反應(yīng)多，已有文獻(xiàn)報(bào)道白血病患兒因放療引起粒細(xì)胞趨化、游走、吞噬及滅菌功能降低，感染發(fā)生率高。人照射的最低損傷限度為1Gy，而半數(shù)致死量（LD50）為4Gy，因此應(yīng)嚴(yán)格避免急性過量照射引起的細(xì)胞損傷［7］。同時(shí)放療還可引起嚴(yán)重的骨壞死，雖然有很多檢測指標(biāo)用以預(yù)防，但效果不是十分理想。所以單純放療使病情預(yù)后差，并嚴(yán)重影響患者的生存質(zhì)量。吲哚美辛是一種最常見的非甾體抗炎藥，文獻(xiàn)［8－9］報(bào)道：常規(guī)服用吲哚美辛可以減輕喉癌以及多種惡性腫瘤的危險(xiǎn)性，這可能與其減輕氧化損傷、減少腫瘤血管的再生和營養(yǎng)，降低腫瘤的轉(zhuǎn)移率有關(guān)［10－11］；且腫瘤患者術(shù)后應(yīng)用吲哚美辛栓可改善細(xì)胞免疫功能［12］。相關(guān)研究［13］表明：吲哚美辛對(duì)抗癌癥的機(jī)制可能與調(diào)節(jié)一些凋亡相關(guān)因子例如上調(diào)p53表達(dá)和bax／bcl－2比值或增強(qiáng)cox－2表達(dá)及誘發(fā)凋亡有關(guān)。人類急性T細(xì)胞白血病細(xì)胞系Jurkat細(xì)胞在維甲酰酚胺聯(lián)合吲哚美辛治療后通過凋亡誘導(dǎo)因子（apoptosis－inducing factor，AIF）－介導(dǎo)細(xì)胞死亡程序誘導(dǎo)細(xì)胞死亡［14］。吲哚美辛聯(lián)合放療在髖關(guān)節(jié)成形術(shù)后防止異位成骨方面比單獨(dú)應(yīng)用吲哚美辛具有更好的效果［15］。

表3 各組HL－60細(xì)胞中PCNA和Caspase－3mRNA的表達(dá)水平Tab.3 The expression levels of PCNA and Caspase－3mRNA in HL－60cells in various groups（n＝6，）

表3 各組HL－60細(xì)胞中PCNA和Caspase－3mRNA的表達(dá)水平Tab.3 The expression levels of PCNA and Caspase－3mRNA in HL－60cells in various groups（n＝6，）

＊P＜0.05，＊＊P＜0.01compared with control group；△P＜0.05compared with indometnacin group；#P＜0.05compared with 3Gy X－rays radiation group.

Group GAPDH PCNA Caspase－327.53±1.21 22.28±1.23 15.86±1.34 Indometnacin（80μmol·L－1）29.97±1.33 19.24±1.43 18.51±1.613Gy X－rays radiation 30.21±1.29 17.42±0.95＊ 22.43±1.35＊Indometnacin（80μmol·L－1）＋3Gy X－rays radiation 28.69±1.46 12.31±0.74＊＊△# 25.88±0.96＊＊△#Control

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)：吲哚美辛聯(lián)合照射處理可明顯抑制HL－60細(xì)胞的增殖，促進(jìn)凋亡。實(shí)時(shí)定量PCR檢測顯示：核增殖因子PCNA在聯(lián)合治療組明顯降低，凋亡最后執(zhí)行因子Caspase－3表達(dá)在聯(lián)合治療組明顯升高，表明吲哚美辛聯(lián)合照射處理增強(qiáng)了癌癥治療效果。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示：吲哚美辛聯(lián)合照射處理能減輕長期單獨(dú)照射帶來的不良反應(yīng)，對(duì)于白血病的治療有潛在的應(yīng)用前景。但具體的作用機(jī)制尚未明確，是否還有其他細(xì)胞調(diào)節(jié)因子參與需進(jìn)一步研究證實(shí)。

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