劉萍萍 李倩如 朱敬松 軒小燕 管莎莎 杜 英

(鄭州大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院微生物與免疫教研室，鄭州450001)

實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓膜炎(Experimental autoimmune encephalomyelintis，EAE)是一種主要由T細(xì)胞介導(dǎo)的，以中樞神經(jīng)系統(tǒng)脫髓鞘為主要特征的自身免疫性疾病[1]。有研究表明 EAE小鼠CD4+CD25+Foxp3+調(diào)節(jié)性 T細(xì)胞(regulatory T cell，Treg)細(xì)胞數(shù)量和免疫抑制功能均降低，給EAE小鼠輸入功能性Treg能改善其病理狀況[2，3]。間充質(zhì)干細(xì)胞(Mesenchymal stem cell，MSCs)是骨髓中除造血干細(xì)胞外的另一種成體干細(xì)胞，具有強(qiáng)大的自我更新和多向分化能力，能分化成多種組織細(xì)胞，如神經(jīng)細(xì)胞、軟骨細(xì)胞和脂肪細(xì)胞等，并且MSCs具有顯著的免疫調(diào)節(jié)活性，能抑制T細(xì)胞、B細(xì)胞和NK細(xì)胞增殖，能誘導(dǎo)產(chǎn)生 Treg[4-7]。本研究旨在通過觀察MSCs移植EAE小鼠前后體內(nèi)免疫器官中Treg數(shù)量及功能的變化，探討 MSCs移植在治療EAE小鼠中的作用。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動物及主要試劑 SPF級雌性C57BL/6J小鼠70只，6～8周齡，體重(20±2)g，購自鄭州大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心。MOG多肽由聯(lián)美生物科技有限公司合成，結(jié)核菌素購自美國DIFCO公司，百日咳毒素購自中國藥品生物制品檢定所，不完全弗氏佐劑(IFA)購自Sigma公司，抗小鼠熒光標(biāo)記單抗:PE-Foxp3、FITC-CD4、APC-CD25 及同型對照，antimouse CD28、anti-mouse CD3均購自美國 eBioscience公司，SYBR PrimeScriptTMRT-PCR試劑盒購自TaKara公司，CD4+CD25+細(xì)胞免疫磁珠分選試劑盒購自德國Miltenyi Biotec公司。

1.2 EAE模型的建立 60只C57BL/6J小鼠，隨機(jī)分為EAE模型組、EAE模型MSCs移植組、正常對照組，每組20只。EAE模型組及EAE模型MSCs移植組自小鼠腋下至尾部皮下多點(diǎn)注射免疫乳劑100 μl，免疫乳劑含 MOG 50 μg、結(jié)核菌素 500 μg、不完全弗氏佐劑50 μl。分別于致敏第2天、第4天，小鼠腹部皮下注射百日咳毒素200 ng。致敏第7天再次注射免疫乳劑。致敏后小鼠常規(guī)飼養(yǎng)。

1.3 小鼠神經(jīng)功能評分 EAE誘導(dǎo)后，每日觀察小鼠癥狀、體征和體重變化，參照Kono等的評分標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行神經(jīng)功能評分:0分為無癥狀，1分為出現(xiàn)尾巴無力，2分為尾部和后肢無力，3分為后肢癱瘓，4分為后肢癱瘓加前肢無力，5分為瀕死狀態(tài)或死亡。免疫原致敏14～20天，凡評分≥1分者可作為EAE模型。

1.4 骨髓MSCs的分離和培養(yǎng) 無菌分離正常C57BL/6J小鼠股骨和脛骨，暴露骨髓腔，用生理鹽水沖洗骨髓腔，將收集的細(xì)胞液經(jīng)200目不銹鋼網(wǎng)過濾，1 000 r/min離心15分鐘收集細(xì)胞，紅細(xì)胞裂解液裂解紅細(xì)胞，用含10%胎牛血清和20 ng/ml bFGF的DMEM培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，細(xì)胞濃度調(diào)至5×105ml-1，置37℃、5%CO2培養(yǎng)。24小時后去除未貼壁的細(xì)胞，將貼壁細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)，每日觀察細(xì)胞生長情況，待細(xì)胞融合至貼滿瓶壁的80%以上，用胰蛋白酶-EDTA液進(jìn)行消化，傳代。利用MTT法檢測細(xì)胞生長狀況。

1.5 MSCs的移植 將培養(yǎng)的MSCs經(jīng)胰酶消化，PBS離心洗滌3次，加入PBS重懸細(xì)胞后，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×106ml-1，經(jīng)小鼠尾靜脈注射EAE模型MSCs移植組(每只0.2 ml)，共2次，間隔2天。正常對照組及EAE模型組小鼠尾靜脈注射0.2 ml PBS。

1.6 流式細(xì)胞術(shù)分析Treg的數(shù)量 在MSCs移植后第20、40、60天，隨機(jī)處死各組小鼠5只，分別無菌獲取胸腺、脾臟、淋巴結(jié)，通過機(jī)械研磨、裂解紅細(xì)胞后，PBS洗3次，制成單個核細(xì)胞懸液。加入FITC-CD4、APC-CD25、PE-Foxp3 抗小鼠 mAb及同型對照抗體三標(biāo)記細(xì)胞，流式細(xì)胞儀FACSCalibur(BD公司)檢測。

1.7 Real time RT-PCR法檢測Foxp3和相關(guān)細(xì)胞因子mRNA表達(dá) MSCs移植后分別于第20、40、60天獲取小鼠脾臟和淋巴結(jié)，加入Trizol試劑(Invitrogen公司)提取總RNA，用RT Kit(Takara公司)反轉(zhuǎn)錄成 cDNA，用 SYBR green I real time PCR Kit(TaKaRa公司)試劑盒擴(kuò)增目的基因，引物由上海生工合成，F(xiàn)oxP3:sence 5'agg aga aag cgg ata cca 3'，anti-sence 5'tgt gag gac tac cga gcc 3';IL-10 sence 5'ttt caa aca aag gac cag 3'，anti-sence 5'gga tca ttt ccg ata agg 3';TGF-β1:sence 5'cta atg gtg gac cgc aac aac g 3'，anti-sence 5'gca ctg ctt ccc gaa tgt ctg 3';IL-4:sence 5'tcc tgc tct tct ttc tcg 3'，anti-sence 5'ttc tcc tgt gac ctc gtt3';GAPDH(內(nèi)參照):sence 5'gtt gtc tcc tgc gac ttc a 3'，anti-sence 5'ggt ggt cca ggg ttt ctt a 3'。

1.8 檢測Treg對CD4+CD25-T細(xì)胞(Teff)增殖的抑制作用 免疫磁珠法分選各組小鼠脾臟CD4+CD25+及CD4+CD25-細(xì)胞，分選方法參照免疫磁珠分選試劑盒說明書。用CD3單抗包被96孔培養(yǎng)板，先將正常對照組小鼠的CD4+CD25-細(xì)胞重懸到含10%胎牛血清、100 U/ml IL-2、1 μg/ml CD28 mAb的RPMI1640培養(yǎng)液，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×106ml-1，取100 μl加入到各包被孔中，然后分別加入正常對照組、EAE組、EAE模型 MSCs移植組的CD4+CD25+細(xì)胞各100 μl(細(xì)胞濃度1 ×106ml-1)，每組設(shè)3個復(fù)孔，置5%CO2飽和濕度37℃培養(yǎng)24小時。MTT法檢測各組細(xì)胞的增殖情況。

2 結(jié)果

2.1 MSCs體外培養(yǎng)、增殖特征 初分離的骨髓單個核細(xì)胞在倒置顯微鏡下呈現(xiàn)為小球形，誘導(dǎo)培養(yǎng)3～4天后部分細(xì)胞貼附于培養(yǎng)瓶壁，形狀似紡錘形，有較強(qiáng)折光性。培養(yǎng)至7～10天，絕大多數(shù)細(xì)胞貼附于瓶壁，并逐漸生長形成分散的或條索狀聚集狀態(tài)，細(xì)胞體積顯著增大。繼續(xù)傳代培養(yǎng)，通過MTT法檢測MSCs增殖活性，顯示第4、5代細(xì)胞增殖能力最強(qiáng)，隨傳代次數(shù)增加，MSCs增殖能力逐漸減弱，并出現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)顆粒、細(xì)胞碎片等老化現(xiàn)象，因此利用傳4～5代的MSCs進(jìn)行細(xì)胞移植，見圖1。

2.2 MSCs移植對EAE小鼠神經(jīng)功能評分的影響MSCs移植前，EAE模型組、EAE模型MSCs移植組小鼠于EAE誘導(dǎo)14天均出現(xiàn)顯著異常表現(xiàn)，85%EAE誘導(dǎo)小鼠出現(xiàn)神經(jīng)功能評分增加，達(dá)到2分以上，部分小鼠出現(xiàn)尾部癱瘓、弓背，部分小鼠表現(xiàn)為后肢無力、甚至癱瘓。MSCs移植后，EAE模型MSCs移植組小鼠神經(jīng)功能評分顯著降低，神經(jīng)功能持續(xù)改善，與EAE對照組相比有顯著差異，P＜0.05，見表1。

2.3 各組小鼠脾臟、淋巴結(jié)、胸腺 CD4+CD25+Foxp3+T細(xì)胞的數(shù)量 流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果顯示，MSCs移植后第20天，EAE模型MSCs移植組和正常對照組胸腺、脾臟和淋巴結(jié)中的 CD4+CD25+Foxp3+T細(xì)胞比例均顯著高于EAE模型組(P＜0.05)，見圖2。

2.4 各組小鼠淋巴器官 Foxp3、TGF-β1、IL-10 mRNA的水平 RT-PCR檢測結(jié)果顯示Foxp3在正常對照組胸腺、脾臟和淋巴結(jié)穩(wěn)定表達(dá)，EAE模型組小鼠各淋巴器官Foxp3 mRNA水平逐漸降低，與正常對照組相比有顯著差異，P＜0.05。EAE模型MSCs移植組在MSCs移植前胸腺、脾臟和淋巴結(jié)Foxp3 mRNA呈現(xiàn)低表達(dá)，MSCs移植20天后，逐漸升高，IL-10、TGF-β1 mRNA 水平亦逐漸升高，移植后第50天，上述細(xì)胞因子mRNA水平均與EAE模型組相比有顯著差異，P＜0.05(見表2，圖3)。

圖1 體外培養(yǎng)傳代MSCs形態(tài)(×200)Fig．1 Themorphology of MSCs subcultured in vitro(×200)

表1 MSCs移植對EAE小鼠神經(jīng)功能評分的影響(n=20)Tab．1 The influence of MSCs transplantation on clinical score of EAE mice(n=20)

圖2 MSCs移植對小鼠脾臟、淋巴結(jié)、胸腺CD4+CD25+Foxp3+T細(xì)胞的數(shù)量的影響Fig．2 The effection of MSCs transplantation on the frequency of CD4+CD25+Foxp3+T in spleen，lymph node and thymus of mice

圖3 MSCs移植對各組小鼠淋巴器官Foxp3、TGF-β、IL-10 mRNA水平的影響Fig．3 The influence of MSCs transplantation on the mRNA level of Foxp3，TGF-β and IL-10 in lymph organs of mice

表2 MSCs移植后50天各組細(xì)胞因子mRNA水平(±s)Tab．2 The level of cytokines mRNA on 50d after MSCs transplantation(±s)

表2 MSCs移植后50天各組細(xì)胞因子mRNA水平(±s)Tab．2 The level of cytokines mRNA on 50d after MSCs transplantation(±s)

Note:Compared with EAE mice，1)P ＜0.05.

Group.35 6.52±0.42 EAE mice with MSCs 5.24±0.181)14.88±0.281)14.26±0.351)6.42±0.271)9.12±0.351)14.45±0.411)8.02±0.351)12.54±0.401)10.84±0.371)1 IL-10 EAE mice 3.01±0.21 11.56±0.26 11.23±0.32 4.35±0.21 4.67±0.34 8.46±0.41 5.23±0.38 8.74±0 Thymus Spleen Lymph node Foxp3 TGF-β1 IL-10 Foxp3 TGF-β1 IL-10 Foxp3 TGF-β 3 13.12±0.39 10.05±0.29 Normal control 6.14±0.16 15.26±0.19 15.46±0.33 6.74±0.17 8.71±0.32 10.23±0.52 8.06±0.3

圖4 CD4+CD25+Treg對CD4+CD25-Teff增殖的抑制作用Fig．4 The suppression of CD4+CD25+Treg on the proliferation of CD4+CD25-Teff

2.5 Treg對Teff增殖的抑制作用 與正常對照組相比，EAE組小鼠Treg對Teff增殖的抑制作用顯著降低，P＜0.05，MSCs移植組Treg對Teff增殖作用顯著增強(qiáng)，與EAE組相比有顯著差異，P＜0.05，見圖4。

3 討論

EAE的臨床表現(xiàn)、病理特征及免疫異常等均與MS相似，故被作為研究MS發(fā)病機(jī)制和治療策略的動物模型。MS和EAE中樞神經(jīng)系統(tǒng)的脫髓鞘病變與效應(yīng)性T細(xì)胞過度活化、炎癥細(xì)胞在CNS浸潤、前炎癥細(xì)胞因子和介質(zhì)的產(chǎn)生高度相關(guān)[8]。

Treg是體內(nèi)一群具有免疫抑制功能的T細(xì)胞亞群，其數(shù)量減少或功能缺失可導(dǎo)致多種自身免疫病的發(fā)生[9]。Foxp3被認(rèn)為是Treg的重要標(biāo)志，是Treg發(fā)育和發(fā)揮功能的關(guān)鍵因素，可能影響Treg的發(fā)育及其免疫調(diào)節(jié)過程[10]。Treg與效應(yīng)細(xì)胞之間的相互接觸也可通過Treg分泌的細(xì)胞因子IL-10、TGF-β實(shí)現(xiàn)。有研究表明去除Treg的小鼠易發(fā)生EAE，過繼轉(zhuǎn)移Treg細(xì)胞則有助于預(yù)防EAE的發(fā)生[11]。本研究結(jié)果顯示，MOG誘導(dǎo)的EAE小鼠模型，伴有胸腺、脾臟、淋巴結(jié)中CD4+CD25+Foxp3+T細(xì)胞比例減少、Foxp3表達(dá)降低，說明Foxp3 mRNA表達(dá)水平降低直接影響CD4+CD25+Foxp3+Treg在胸腺和脾臟、淋巴結(jié)的數(shù)量，且與免疫功能紊亂相關(guān)，與EAE的發(fā)生有關(guān)。

已有大量實(shí)驗(yàn)證實(shí)EAE小鼠通過輸入MSCs其臨床癥狀明顯減輕，中樞神經(jīng)系統(tǒng)炎癥病灶及脫髓鞘程度均降低[12，13]，移植的 MSCs可以在 EAE 小鼠淋巴結(jié)被發(fā)現(xiàn)，認(rèn)為MSCs是通過抑制CD4+Th1細(xì)胞而起作用。本研究發(fā)現(xiàn)同基因MSCs移植能使MOG免疫的EAE小鼠癥狀好轉(zhuǎn)、神經(jīng)功能評分降低，提示MSCs移植能顯著改善EAE臨床進(jìn)程，與文獻(xiàn)報道結(jié)果一致。在臨床評分降低的同時，MSCs移植還能使EAE小鼠CD4+CD25+Foxp3+T細(xì)胞比例增加，脾臟、淋巴結(jié)、胸腺Foxp3 mRNA表達(dá)上調(diào)。提示MSCs移植治療EAE的機(jī)制可能通過誘導(dǎo)Foxp3 mRNA表達(dá)增加和CD4+CD25+Foxp3+T細(xì)胞數(shù)量增加有關(guān)。

已有數(shù)據(jù)表明，MSCs能通過產(chǎn)生TGF-β和IL-10發(fā)揮免疫抑制活性，F(xiàn)oxp3與Treg介導(dǎo)的免疫抑制調(diào)節(jié)作用通過誘導(dǎo) TGF-β和 IL-10的產(chǎn)生有關(guān)[14，15]。本研究結(jié)果顯示，EAE 組 Foxp3 mRNA 的表達(dá)在上述各器官的表達(dá)量顯著低于正常對照組，當(dāng)EAE組分別給予同基因MSCs移植后，F(xiàn)oxp3 mRNA表達(dá)比EAE組顯著增加。提示MSCs移植能誘導(dǎo)Foxp3 mRNA的表達(dá)。同時，TGF-β1 mRNA和IL-10 mRNA表達(dá)在MSCs移植組也比EAE組顯著增加，說明MSCs移植也能改變TGF-β1、IL-10的表達(dá)。MSCs移植后，F(xiàn)oxp3、TGF-β1和 IL-10 mRNA在胸腺、脾臟、淋巴結(jié)表達(dá)的增加，并且Treg對Teff增殖的抑制活性得以恢復(fù)，MSCs可能通過這些機(jī)制發(fā)揮其免疫調(diào)節(jié)活性，改變EAE臨床進(jìn)程。

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