崔花芹，汪心怡，陳 吉，陳 卓，趙 華，瞿成奎，3，汪思應

(1．安徽醫(yī)科大學基礎(chǔ)醫(yī)學院，合肥 230032;2．安徽醫(yī)科大學臨床學院，合肥 230032;3．Case Western Reserve University，Cleveland，USA，44106)

近年來，我國腫瘤發(fā)病呈現(xiàn)明顯的高發(fā)早發(fā)趨勢，懷疑系環(huán)境污染及基因突變相互作用的結(jié)果。一方面環(huán)境污染通過引發(fā)基因突變致癌，另一方面，基因突變的機體可能對環(huán)境污染更加敏感而易發(fā)生腫瘤。環(huán)境污染物有很多種，其中包括因采礦、廢氣污染、污水灌溉及使用重金屬制品導致的重金屬污染［1］。根據(jù)流行病學調(diào)查，我國水源污染物中砷和鎘排在首位。重金屬污染物主要通過氧化應激，激活 NF-κB、AP-1、HIF-1 等的信號分子及氧化損傷造成基因突變，導致細胞惡性轉(zhuǎn)化，促發(fā)腫瘤，基因突變也可能通過信號途徑異?；罨斑z傳不穩(wěn)定性導致細胞惡性轉(zhuǎn)化促發(fā)腫瘤［2］。但這些僅僅初步解釋了腫瘤高發(fā)的一些問題，對于腫瘤早發(fā)并沒有答案。我們推斷:環(huán)境污染促發(fā)基因突變，而攜帶基因突變的細胞或機體對環(huán)境污染更加敏感，可能是促進腫瘤早發(fā)的主要原因。我們前期研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)SHP-2激活突變的細胞在重金屬污染物誘導下，更容易發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化，攜帶SHP-2激活突變的小鼠在環(huán)境因素誘導下更易發(fā)生腫瘤［3］。SHP-2是一個含有兩個SH2結(jié)構(gòu)域的酪氨酸磷酸酶，在各組織中廣泛表達，被激活時，活化的蛋白通過酪氨酸磷酸化位點與SH2結(jié)構(gòu)域結(jié)合或C端的2個酪氨酸位點磷酸化活化結(jié)合自身的SH2結(jié)構(gòu)域發(fā)揮活性［4，5］，影響NF-кB、JAK-START、PI3K 等信號途徑。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)SHP2多種激活突變參與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展［6-8］。但激活突變SHP2與環(huán)境污染污染物聯(lián)合協(xié)同作用的機制不清，闡明之有助于解決腫瘤高發(fā)和早發(fā)問題。但腫瘤發(fā)生的分子機制很復雜，其中miRNA是新近發(fā)現(xiàn)的可能參與包括腫瘤在內(nèi)的多種疾病發(fā)生發(fā)展的主要分子之一，miRNA也就是通常所說的微小核糖核甘酸，是一類非編碼的單鏈RNA，大約含有18～25個核苷酸［9］。研究發(fā)現(xiàn)，它主要是通過與靶mRNA的3’-UTR區(qū)完全或部分結(jié)合從而使靶基因降解或沉默，進而影響腫瘤的發(fā)生和發(fā)展，發(fā)揮了類似于癌基因或抑癌基因的作用，同一個miRNA可能同時調(diào)控幾個不同的mRNA，同一個mRNA也可以受到幾個不同的miRNA的調(diào)節(jié)，類似于基因密碼子的匹配機制，因此，人體內(nèi)大約有30%的蛋白受到miRNA的調(diào)控，在細胞內(nèi)形成了一個非常大的網(wǎng)絡(luò)［10］，MiRNA的發(fā)現(xiàn)為腫瘤的研究提供了一個新視野，很多研究發(fā)現(xiàn)，microRNAs與腫瘤細胞的增殖、凋亡及遷移等都有著密切的關(guān)系［11］，miRNAs異常表達可能參與了環(huán)境因素促發(fā)腫瘤的過程。因此，本研究為了初步探測miRNAs在腫瘤形成中的作用，建立了環(huán)境及基因突變的MEFs細胞，基因芯片技術(shù)檢測砷處理48h后的MEFs細胞和SHP2D61G/+突變的MEFs細胞的miRNA表達譜，探討miRNAs表達變異情況，并選取兩個變異趨勢隨砷處理和基因突變一致的兩個 miRNA做 RT-PCR檢測，發(fā)現(xiàn)mmu-miRNA-100的表達隨處理遞減;mmu-miRNA-1907的表達隨處理遞增，為我們進一步研究miRNA在致瘤中的機制做準備。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試劑與儀器

DMEM、FBS(均為 GIBCO公司生產(chǎn)，美國)、三氧化二砷(為Sigam公司生產(chǎn)，美國)、RT-PCR試劑盒、引物(為上海吉瑪公司生產(chǎn)，中國上海)、總 RNA提取試劑 和Trizol(為Invitrogen公司生產(chǎn)，美國)、倒置顯微鏡(Olympus IX71，日本)、CO2恒溫培養(yǎng)箱(Thermos公司，美國)。

1.1.2 實驗動物

SPF級C57BL/6品系SHP2D61G/+小鼠，6周齡，雌/雄，體重18～20 g，美國 Case Western Reserve大學瞿成奎教授贈送，由安徽醫(yī)科大學動物中心繁育【SCXK(皖)2011-002】，在安徽醫(yī)科大學實驗動物中心無特定病原體(specific-pathogen free，SPF)的飼養(yǎng)間【SYXK(皖)2011-007】飼養(yǎng)，所有實驗操作程序均經(jīng)過實驗動物研究所實驗動物使用管理委員會批準(LLSC211-002)。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)

MEFs細胞以DMEM+10%FBS培養(yǎng)，培養(yǎng)基內(nèi)含100IU/mL青霉素和鏈霉素，細胞在5%CO2，37℃恒溫細胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。

1.2.2 MEFs細胞建立及永生化

取雌雄小鼠合籠交配，第二天早上觀察雌鼠的陰道口，若有陰道栓表明已懷孕0.5 d，待胚胎6.5 d后解剖雌鼠，在超凈臺操作，以高壓滅菌的PBS清洗分離胚胎，制備胚胎組織塊，分別接種不同的培養(yǎng)皿，細胞在10%FBS的DMEM培養(yǎng)基中，37℃，5%CO2培養(yǎng)24 h，SHP2+/+MEF即組織周圍伸展生長出的細胞，留取細胞繼續(xù)培養(yǎng)并以SV40T抗原進行永生化備用;SHP2D61G/+MEFs細胞制備方法類似:取雌雄SHP2D61G/+小鼠合籠交配，同樣的分離6.5 d的胚胎，制備組織塊接種不同的細胞培養(yǎng)皿，并且留取部分組織做基因型鑒定，根據(jù)基因型鑒定結(jié)果留取SHP2D61G/+的MEFs細胞，繼續(xù)培養(yǎng)并以SV40T抗原進行永生化備用。

1.2.3 重金屬化合物As2O3處理MEFs細胞

美國是教育強國，其藥學教育也處于世界領(lǐng)先地位，美國的藥學教育研究一直為其他國家所借鑒。在英國教育升學組織（Quacquarelli Symonds，QS）2018年公布的世界藥學與藥理學學科前300名中，有70所美國高校上榜[1]。本文通過對近5年的《美國藥學教育雜志》進行文獻統(tǒng)計，了解其主要研究內(nèi)容、研究現(xiàn)狀及研究方法，為我國高等藥學教育研究的發(fā)展提供參考與借鑒。

取1×106對數(shù)期生長的MEFs細胞接種于75 cm2培養(yǎng)瓶，待細胞貼壁后，以 0.5 μmol/L As2O3處理48 h，以PBS洗三遍，加胰酶消化細胞，待細胞變圓后加入細胞培養(yǎng)基終止消化，吹打細胞后收集至離心管中900 r/min離心，棄上清，以PBS沖洗三次。以Trizol試劑盒提取細胞及組織總RNA，1 mL的Trizol裂解1×107個細胞，之后，在1 mL的Trizol中加入 200 μL 氯仿，震蕩 10 s，冰置 3 min，4℃，12000 r/min離心10 min，小心吸取上層水相至1.5 mLEP管中，加等量或稍多的異丙醇，輕輕顛倒混勻3 次，冰置10 min，4℃，12000 r/min 離心10 min，棄上清，加75%乙醇，4℃，7500 r/min離心15 min，棄上清，75%乙醇重復洗滌一次，棄上清，室溫晾約5 min，加入約50 μL DEPC水冰上溶解，紫外分光光度計測定其濃度，－80℃保存。

1.2.4 miRNA芯片雜交分析

因為miRNA僅含有二十個堿基左右，特異性很高，因此，每個miRNA需用兩條引物才能識別，每條引物只能識別miRNA序列的一半，一條引物攜帶標示序列Tag，另一條引物攜帶T7啟動子序列，只有兩條序列都與miRNA完全匹配才能形成RNA/DNA雜合體。之后，以磁珠分離出RNA/DNA雜合體，在T4連接酶的作用下，連接為一個DNA片段再轉(zhuǎn)錄，轉(zhuǎn)錄的RNA序列再與含有不同miRNA序列的膜雜交，加入含有辣根過氧化物酶HRP的親和素反應，最后加入發(fā)光底物進行測定。

1.2.5 聚合酶鏈式反應RT-PCR

以吉瑪提供的 MiR-RT primers引物、2 μL RNA、4 μL RT Buffer、0.75 μL dNTP、0.2 μLMMLV或AMV、DEPC水配成20 μL反應體系，反應條件為16℃，30 min，42℃，30 min，85℃，10 min，逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物保存在－20℃。逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物稀釋3～4倍后取2 μL 或4 μL 作為模板，作體系為20 μL 或40 μL 的PCR反應，20 μL體系的反應混合物包含2×PCR Buffer 10 μL、miR specific Primer set(5 μM)0.35 μL、miRNA RT product、2 μL、Taq DNA polymerase(5 u/μL)0.2 μL、加 ddH2O 至 20 μL。反應條件為:95℃變性3 min后，95℃，12 s，62℃，50 s，40 個循環(huán)，5%TAE瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.2.6 統(tǒng)計分析

SPASS13.0統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進行方差分析，數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標準差(±S)表示，每個試驗指標均重復3次，數(shù)據(jù)進行方差分析，以P＜0.05為差異顯著。

2 結(jié)果

2.1 miRNA芯片雜交分析 As2O3對 SHP2+/+MEFs細胞miRNA表達譜的影響

2.2 miRNA芯片雜交分析As2O3對SHP2D61G/+MEFs miRNA表達譜的影響

收集 0.5 μmol/L As2O3處理 48 h的 SHP-2D61G/+突變的 MEFs細胞，提取總 RNA，做 miRNAs芯片雜交分析，觀察miRNAs表達譜變化情況，篩選出表達差異明顯者，并選取二十個變異明顯的miRNAs做前期報道，如圖2所示，20個miRNA表達出現(xiàn)明顯變化，且變異亦皆在兩倍以上。

圖1 miRNAs表達譜芯片雜交分析結(jié)果Fig．1 The result of miRNAs expression profiling of SHP2+/+MEFs

圖2 miRNAs表達譜芯片雜交分析結(jié)果Fig．2 The result of miRNAs expression profiling of SHP2D61G/+MEFs

2.3 受環(huán)境因素和基因因素影響一致的miRNAs

在對miRNAs表達譜進行分析的過程中發(fā)現(xiàn)有的miRNA在三氧化二砷誘導和基因突變影響下出現(xiàn)一致的變化，如圖3，在 SHP2+/+MEFs、SHP2+/+MEFs+As、SHP2D61G/+MEFs、SHP2D61G/+MEFs+As四種細胞中mmu-miR-100表達遞減，mmu-miR-1907表達遞增。

2.4 聚合酶鏈式反應RT-PCR檢測mmu-miRNA-100和mmu-miRNA-1907表達

圖3 miRNAs變異趨勢分析Fig．3 The analysis of miRNAs trend

提取 SHP2+/+MEFs、SHP2+/+MEFs+As、SHP2D61G/+MEFs、SHP2D61G/+MEFs+As 四種細胞的總RNA，不同的引物擴增 mmu-miR-100和 mmumiR-1907，以5%的瓊脂糖凝膠電泳拍照分析，如圖4，mmu-miRNA-100 表 達 在 SHP2+/+MEFs、SHP2+/+MEFs+As、SHP2D61G/+MEFs、SHP2D61G/+MEFs+As四種細胞中表達遞減，mmu-miRNA-1907表達遞增。

3 討論

腫瘤是近幾年的一個研究熱點，是一類嚴重威脅人類健康的疾病，全世界每年有癌癥病人約4500萬，新發(fā)病例1300萬，每年因癌癥死亡的約800萬，我國的癌癥發(fā)病率居世界第二［12］。腫瘤從本質(zhì)上說是細胞的基因失去對正常生長和凋亡控制導致的異常增生，據(jù)衛(wèi)生部統(tǒng)計顯示，我國惡性腫瘤發(fā)病率一直呈上升趨勢，患病人數(shù)不斷增加，且有年輕化的趨勢，對人類健康的危害極大，因此，探討腫瘤發(fā)生機制是醫(yī)學研究領(lǐng)域的一個熱點問題。

諸多研究表明，腫瘤發(fā)生是環(huán)境因素和遺傳因素共同作用的結(jié)果，其中環(huán)境因素主要包括環(huán)境污染和不良生活習慣等，環(huán)境因素中的某些有害物質(zhì)如重金屬污染物、尼古丁和酒精等可通過誘發(fā)機體的氧化應激，產(chǎn)生大量氧自由基，損傷細胞遺傳物質(zhì)，激活體內(nèi)某些信號途徑，導致細胞的異常增殖和凋亡障礙［13，14］。隨著現(xiàn)代化進程的加速，環(huán)境污染日益嚴重，人們的面臨的生活壓力和生活習慣也發(fā)生了重大變化，致使腫瘤發(fā)病率不斷提高，但腫瘤早發(fā)的原因并不清楚，我們推斷:一方面環(huán)境污染通過促進基因突變致瘤，另一方面基因突變的機體或?qū)Νh(huán)境因素更加敏感，可能是導致腫瘤發(fā)病人群年輕化的主要原因，對于探討腫瘤發(fā)生發(fā)展的機制意義重大。

圖4 RT-PCR結(jié)果分析Fig．4 The results of RT-PCR analysis

MicroRNA是人類基因組計劃實施以來作為基因非編碼序列一員受到最多關(guān)注的一個，最早發(fā)現(xiàn)的 miRNA 是在線蟲中的 let-4和 let-7［15，16］。自被發(fā)現(xiàn)以來，諸多研究者通過實驗研究發(fā)現(xiàn)上千種miRNA。MiRNA表達上具有階段性和組織特異性，這種特異性對機體正常生長發(fā)育起到重要調(diào)節(jié)作用，對發(fā)揮其自身的調(diào)控作用也意義重大［17］，研究表明，它與多種腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)，如白血病、乳腺癌、宮頸癌等［18］。MiRs主要是通過與靶 mRNA的3’-UTR區(qū)完全或部分互補結(jié)合從而使靶基因降解或沉默，進而影響腫瘤的發(fā)生和發(fā)展，發(fā)揮了類似癌基因或抑癌基因作用。MiRs與多條信號通路密切相關(guān)，比如重要的抑癌基因P53，又如細胞抗凋亡BCL-2蛋白家族等［19］。在我們的研究中，首先是以miRNA芯片雜交技術(shù)篩選出數(shù)十種變異明顯的miRNA，并分析變化趨勢，有的miRNA在SHP2+/+MEFs、SHP2+/+MEFs+As、SHP2D61G/+MEFs、SHP2D61G/+MEFs+As四種細胞中呈現(xiàn)一致的變化趨勢，如 mmu-miR-100表達逐漸減少、mmu-miR-1907表達逐漸增多，通過RT-PCR實驗驗證得到的結(jié)果與芯片雜交分析結(jié)果一致，驗證了芯片雜交結(jié)果的可靠性。

三氧化二砷處理的 SHP2+/+MEFs細胞和SHP2D61G/+MEFs細胞中變化趨勢一致的兩個miRNA(mmu-miRNA-100、mmu-miRNA-1907)，其生物學功能在國內(nèi)外文獻中都尚未報道，這是我們尋找參考資料的一個難點，同時也是我們研究的一個創(chuàng)新所在，我們將通過生物學信息預測及熒光素酶報告基因等方法尋找其作用靶點，探討它們所參與的信號通路，進一步了解它們在細胞增殖、凋亡、遷移和侵襲等生物學行為中發(fā)揮的作用。此外，我們將探討這兩個miRNA在臨床病人癌組織相對癌旁組織中的表達差異，對其在人類腫瘤發(fā)生中的作用進行驗證，闡明它們在腫瘤形成、發(fā)展中的作用及機制，使得本文的研究有所新發(fā)現(xiàn)。

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