胡 鑫，齊艷菲，王興云，盤 妮，劉麗娜，王 麗，王德彬，徐 婧，楊光忠

(中南民族大學 藥學院，武漢430074)

糖尿病是一種與遺傳因素和多種環(huán)境因素相關的慢性全身性疾病，由于體內(nèi)胰島素的絕對或相對分泌不足而引起的糖、脂肪、蛋白質(zhì)的代謝紊亂［1］，常用胰島素注射(I型)和口服降糖藥物(II型)治療.對II型糖尿病的病人，在采用控制飲食的方法不能有效控制血糖時，需要口服降糖藥物［2］，其中α-糖苷酶抑制劑如阿卡波糖已證明其單獨用藥或與其他降糖藥物合用時能明顯降低血糖水平，并以降低餐后血糖為主［2，3］.但其引起的不良反應較多見，如胃腸道反應(約58%)，典型表現(xiàn)包括胃脹，腹脹，腹瀉，胃腸痙攣性疼痛，頑固便秘等，而具有降糖作用的民族藥物如傣藥等效果顯著，毒副作用輕微，并能同時治療并發(fā)癥.本文研究了對我國8種傣藥植物中不同部分的不同提取物對α-糖苷酶的抑制活性，旨在尋找其中的降糖有效成分，為深入開發(fā)以及合理利用降糖傣藥提供科學依據(jù).

1 試劑與儀器

1.1 植物材料

8種傣藥材料如表1，由云南西雙版納民族醫(yī)藥研究所提供和鑒定.

表1 8種傣藥植物的拉丁文名Tab.1 Latin name of eight Dai Nationality Medicine tested plant

1.2 儀器與試劑

酶標儀(美國 Thermo Electron公司)，PH S-25型酸度計(上海偉業(yè)儀器廠)，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器RE-52(上海亞榮生化儀器廠)，WH-3微型漩渦混合儀(上海滬西分析廠有限公司)，電子天平(梅特勒-托利多儀器上海有限公司)，α-葡萄糖苷酶(Sigma)，4-硝基苯-α-D-吡喃葡萄糖苷(4-N-trophenyl-α-D-glucopyranoside，pNPG，Sigma)，阿卡波糖(Sigma)，DMSO(國藥集團)，所用溶劑均為分析純(上海試一化學試劑有限公司).

2 實驗方法

2.1 8種傣藥提取物的制備

取植物藥材(50g)粉碎后，室溫下用甲醇浸泡3次，甲醇用量每次約1L，每次浸泡72h，合并3次甲醇提取液.真空抽濾(3層濾紙)得濾液，減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)得甲醇浸膏.將甲醇浸膏溶解在甲醇和水(體積比9︰1)的混合溶劑中，用石油醚萃取脫脂，石油醚處于上層，萃取12次，萃取液與母液體積比約為1︰1，減壓濃縮回收石油醚循環(huán)使用，得石油醚提取物(P)少量，然后減壓濃縮甲醇層溶液成浸膏.用超純水將甲醇全部浸膏溶解，用乙酸乙酯萃取，萃取液與母液體積比為1︰1，萃取12次，減壓濃縮成浸膏;乙酸乙酯萃取完后用正丁醇繼續(xù)萃取，體積比為1︰1，萃取6次，減壓濃縮成浸膏.這樣每種植物材料就獲得了石油醚(P)，乙酸乙酯(E)，正丁醇(NBA)和水(W)4個提取物.將各提取物用DMSO配制成1mg/mL溶液，即得樣品液.

2.2 酶活性測定方法和酶活性抑制率的計算

2.2.1 測定樣品溶液的配制

分別配制0.2mol/L Na2HPO4溶液(A)250mL，0.2mol/L KH2PO4溶液(B)250mL，將 A 液和 B液按49︰5l的體積比例配成0.2 mol/L磷酸鹽緩沖液(pH6.8).用pH6.8的磷酸鹽緩沖液將標準底物pNPG 配成3mM，冰箱保存.300U α-葡萄糖苷酶用1000 mL濃度為0.05 mol/L的PB緩沖液配制成3 U/mL的保存液，并分裝，置于低溫下凍存(－20℃)，使用時稀釋成0.3 U/mL.

2.2.2 酶活性測定方法

［4］，將待測樣品與α-葡萄糖苷酶溶液(50μL，0.3 U/mL)，0.2mol/L 磷酸二氫鉀緩沖液(pH6.8，50μL)充分混合，37℃預先孵育 15min后，加入 3mM pNPG 溶液 100 μL，37℃ 反應 10min后加入0.1mol/L Na2CO3溶液(750μL)終止反應，在波長405nm處測定在酶作用下釋放出的對硝基酚(PNP)光吸收值.酶活力單位定義為:在 37℃，pH6.8條件下，1min內(nèi)水解 pNPG 釋放 1μmol PNP所需的酶量.抑制劑活力單位定義:在相同條件下降低1個酶活力單位所需的抑制劑量.

2.2.3 樣品酶活性抑制率的測定

參考文獻［5］，96孔板每孔依次加入50μL磷酸緩沖液(0.2mol/L，pH6.8)，50 μL α-葡萄糖苷酶溶液(0.3U/mL)，DMSO 或 10 μL 樣品溶液(10個濃度).37℃培養(yǎng)箱反應15min后，每孔加入100 μL pNPG(3mM)溶液，37℃培養(yǎng)箱反應10min后終止反應，酶標儀 405nm波長測 A值(吸光度值，Absorbance).實驗設置空白(Blank，10 μL 不含樣品DMSO)，背景孔(Backgroud，50 μL 緩沖液代替酶液)，每個樣品孔(sample)設3個復孔.各傣藥提取物樣品均設平行空白對照.

根據(jù)抑制百分率的定義與本實驗的實際方法，樣品提取物對α-葡萄糖苷酶活性的抑制率按下式計算:Inhibitory rate/%=

2.2.4 樣品濃度對酶活性抑制率的影響

將1-1樣品液與1 mg/mL阿卡波糖分別稀釋至原濃度的 0.02 倍、0.04 倍、0.06 倍、0.08 倍，依次類推直至 0.2倍，測定其對 α-葡萄糖苷酶的抑制率.

3 結果

3.1 8種傣藥提取物對α-葡萄糖苷酶的抑制活性

8種傣藥提取物對α-葡萄糖苷酶的抑制活性如表2所示.由表2可知，8種傣藥中大部分提取物對α-葡萄糖苷酶有較好的抑制活性，32個提取物中有16個提取物的IC50值低于對照阿卡波糖.其中野花椒的石油醚提取部位(IC50=40.71 μg/mL)，黑皮跌打藤莖的乙酸乙酯和正丁醇提取部位(IC50分別為26.33 μg/mL、17.74 μg/mL)小于 50 μg/mL.

8種植物中白花丹根和黑皮跌打藤莖的4個提取部位對α-葡萄糖苷酶均有較好的抑制活性.其中黑皮跌打藤莖提取物中乙酸乙酯、正丁醇和水提取物的 IC50分別為26.33，17.74，54.58 μg/mL(石油醚部 IC50為183.33 μg/mL)，顯著高于阿卡波糖(P＜0.01)和其他7種傣藥(P ＜0.05).此外，白花丹根乙酸乙酯(E)、正丁醇(NBA)部較阿卡波糖抑制活性較強(P＜0.01);山雞椒、野花椒、登臺樹去皮莖木、野山椒果實僅石油醚(P)部較阿卡波糖抑制活性較強(P＜0.01).因黑皮跌打藤莖正丁醇部抑制活性最強，因此選取該部分進行后續(xù)研究.

表2 8種植物不同提取物對α-葡萄糖苷酶的抑制活性IC50Tab.2 α-Glucosidase inhibitory activities IC50of the extracts from eight kinds of plants

3.2 提取物濃度對α-葡萄糖苷酶抑制活性的影響

6個抑制活性較好的樣品提取物濃度對α-葡萄糖苷酶抑制率的影響結果見圖1.由圖1可見，各提取物對α-葡萄糖苷酶抑制活性呈劑量依賴性，當提取物 1-1，3-1，5-2，6-2，6-3，6-4 濃度分別低于 80，100，80，120，40，120 μg/mL 時 α-葡萄糖苷酶抑制率隨樣品濃度的增加而顯著增加，呈明顯的線性關系.當抑制率達到80%后，樣品濃度增加對抑制率的影響不大.其他26個提取物物濃度對α-葡萄糖苷酶抑制率的影響呈現(xiàn)如表2所示的相似效應.特別是黑皮跌打藤莖正丁醇提取部位(點線1)活性最高，在樣品濃度為50 μg/mL時，對α-葡萄糖苷酶的抑制活性約達85%.

圖1 6種提取物及阿卡波糖濃度對α-葡萄糖苷酶活性的影響Fig.1 Effects of the concentration of six extracts and acarbose on α-glucosidase activity

4 討論

α-葡萄糖苷酶抑制劑競爭性抑制位于小腸的各種α-葡萄糖苷酶，使淀粉類分解為葡萄糖的速度減慢，從而減緩腸道內(nèi)葡萄糖的吸收，降低餐后高血糖.目前臨床上應用的α-葡萄糖苷酶抑制劑主要為西藥如阿卡波糖等，價格較貴且副作用常見.目前對于民族藥物抗糖尿病研究較少，其對α-糖苷酶抑制活性研究亦不多見.本文對8種傣藥提取物的α-葡萄糖苷酶抑制活性進行研究，發(fā)現(xiàn)提取物均有一定的α-葡萄糖苷酶抑制活性，且大部分提取物的抑制活性高于阿卡波糖.其中黑皮跌打藤莖4種溶劑提取物均具有α-葡萄糖苷酶抑制活性，正丁醇提取物活性最好(IC50=17.74 μg/mL)，優(yōu)于阿卡波糖(P＜0.01).黑皮跌打藤為番荔枝科植物，主要用于接骨續(xù)筋，除風，活血止痛［6］，含有生物堿［7-9］，黃酮［10，11］等結構類型.野花椒為蕓香科植物，主要含有生物堿、酰胺、木脂素、香豆素、揮發(fā)油和脂肪酸等化學成分［6］.多羥基生物堿類化合物是一類具有顯著抑制葡萄糖苷酶活性的化合物［12］.黃酮，香豆素均能顯著抑制 α-葡萄糖苷酶抑制活性［13，14］.8 種傣藥特別是黑皮跌打藤莖中的單體活性成分的α-葡萄糖苷酶抑制活性，及其在胰島素抵抗細胞模型及動物模型中藥理作用和具體機制，有待進一步研究.

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