劉慶華，馬云飛，羅小靜，張 婷

(中南民族大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院醫(yī)學(xué)生物研究所，武漢430074)

全球每年約有1700萬人死于心血管疾病，因急性心肌梗死和慢性心功能不全而導(dǎo)致的死亡占心血管病死亡率50%以上.

20世紀(jì)90年代以來，胚胎干細(xì)胞技術(shù)的出現(xiàn)和發(fā)展，給心血管疾病的治療帶來了突破性的進(jìn)展，在某些特殊條件下，胚胎干細(xì)胞可分化為心肌細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞，恢復(fù)血流灌注，對心肌缺血和肢體缺血的治療具有十分重要的意義.但是胚胎干細(xì)胞在體外自然分化為心肌細(xì)胞的效率很低，如何進(jìn)一步提高胚胎干細(xì)胞源心肌細(xì)胞的分化率以確保充足的心肌細(xì)胞來源是目前亟需解決的首要問題.

中藥具有數(shù)千年臨床應(yīng)用的歷史，具有廣泛的藥理作用，包括保護(hù)缺血心肌，減少再灌注損傷，調(diào)節(jié)機(jī)體的免疫，抗免疫排斥，抗細(xì)胞凋亡，促進(jìn)蛋白的表達(dá)等.與細(xì)胞因子和化學(xué)誘導(dǎo)劑相比較而言，中藥更具有廉價、安全和長效性的特點(diǎn)，本文綜述了近年來中藥誘導(dǎo)干細(xì)胞向心肌細(xì)胞分化和調(diào)控的研究進(jìn)展，并探討了胚胎干細(xì)胞向心肌細(xì)胞定向分化所亟需解決的關(guān)鍵問題.

1 胚胎干細(xì)胞分化為心肌細(xì)胞的研究

ES細(xì)胞先是由干細(xì)胞分化為中胚層，再分化為心肌前體細(xì)胞，最終形成心肌終末細(xì)胞(圖1).研究者們嘗試通過基因重組和轉(zhuǎn)染或各種誘導(dǎo)因子，如TGF-β［1］，BMP，F(xiàn)GF，Wnt［2］和干細(xì)胞生長因子，維甲酸，維生素C，5-氮胞苷［3］等誘導(dǎo)干細(xì)胞向心肌細(xì)胞分化，但在干細(xì)胞分化不同時間點(diǎn)加入誘導(dǎo)劑，產(chǎn)生的效應(yīng)不盡相同，說明分化過程中細(xì)胞因子的時程表達(dá)對細(xì)胞分化方向起著決定性作用，在優(yōu)化的時間點(diǎn)采用細(xì)胞因子組合促進(jìn)ES細(xì)胞的心肌分化被證明較單一因子更為有效.

圖1 胚胎干細(xì)胞分化為心肌細(xì)胞的過程圖Fig.1 The process diagram of embryonic stem cells differentiation into myocardial cells

2 中藥誘導(dǎo)干細(xì)胞定向分化為心肌細(xì)胞的研究

2.1 黃芩苷

黃芩苷(baicalin)是從植物黃芩根中提取出來的一種黃酮類化合物對心血管系統(tǒng)有保護(hù)作用，可減小心肌缺血再灌注時的心肌梗死區(qū)域，移植心肌細(xì)胞的凋亡，保護(hù)心肌缺血再灌注引起的損傷［4，5］.唐美林等［6］發(fā)現(xiàn)黃芩苷能抑制ES細(xì)胞的增殖，使細(xì)胞之間聯(lián)系更加密切，促進(jìn)ES細(xì)胞向心肌細(xì)胞分化，同時黃芩苷通過調(diào)控Wnt/β-catenin信號通路實現(xiàn)促進(jìn)晚期心肌細(xì)胞的分化，特別是工作肌細(xì)胞的產(chǎn)生，說明黃芩苷可作為促進(jìn)心肌細(xì)胞分化的誘導(dǎo)劑和心肌細(xì)胞移植治療中的細(xì)胞保護(hù)劑.

2.2 葛根素

葛根素由葛根提取而成，有保護(hù)心肌，抗心律失常，降低血壓和腦血管阻力，抗氧化和雌激素樣作用［7］等.臨床普遍用于治療冠心病、心絞痛、心肌梗死、心率失常和高血壓等疾病.程穎等［8］發(fā)現(xiàn)葛根素能通過PI3K/Akt通路影響EB大小，進(jìn)而影響ES細(xì)胞的分化方向，促進(jìn)心肌細(xì)胞的分化，提高心室樣心肌細(xì)胞的分化率，通過調(diào)節(jié)TGF-β和Wnt信號途徑促進(jìn)ES細(xì)胞的心肌分化和心室肌特化.

2.3 淫羊藿苷

淫羊藿苷(ICA)能夠影響內(nèi)分泌和心血管系統(tǒng)，具有免疫調(diào)節(jié)，抗腫瘤等多種中藥的生物學(xué)活性［9］.朱丹雁等［10］研究了淫羊藿苷對 ES 細(xì)胞的誘導(dǎo)作用，發(fā)現(xiàn)經(jīng) ICA處理48h，多數(shù) ES細(xì)胞處于G0/G1期，而少數(shù)細(xì)胞處于S期，在ES細(xì)胞分化為心肌細(xì)胞的早期，ICA能提高 ES細(xì)胞中cAMP/cGMP的比值，上調(diào)內(nèi)源性NO含量，增加心肌發(fā)育依賴性基因的表達(dá).丁玲等［11］繼續(xù)研究發(fā)現(xiàn)在分化的第5～8d給予ICA，能最有效地誘導(dǎo)ES細(xì)胞體外分化為心肌細(xì)胞.證實ICA能在心肌分化信號源頭上增加ROS相關(guān)酶的表達(dá)，在促心肌分化過程中，ROS及其介導(dǎo)的p38MAPK信號通路發(fā)揮重要作用.同時ICA促進(jìn)ES心肌分化過程中線粒體形成相關(guān)蛋白過氧化物酶體增生物激活受體γ共激活子-1α的表達(dá)，提高了心肌特異性蛋白α-輔肌動蛋白、肌鈣蛋白 T 的表達(dá)［12］.

2.4 黃芪

黃芪具有抗氧化作用，能刺激骨髓基質(zhì)細(xì)胞的增殖，促進(jìn)其分泌TNF-α和白細(xì)胞介素，黃芪甲苷，黃芪含藥血清［13］和黃芪注射液能誘導(dǎo)MSCs分化為心肌細(xì)胞，誘導(dǎo)后MSCs表達(dá)心肌特異性蛋白結(jié)蛋白(Desmin)、肌鈣蛋白(cTnI)、心肌特異性基因α-心肌肌球蛋白重鏈(α-MHC)和β-心肌肌球蛋白重鏈(β-MHC)增強(qiáng).

2.5 丹參和丹酚酸B

丹參能夠改善心肌供血情況，具有抑制血小板聚集、抗凝、抗血栓形成，降血脂并延緩冠狀動脈硬化發(fā)生等藥理學(xué)作用.丹參聯(lián)合(5-aza)［14］和復(fù)方丹參滴丸含藥血清［15］能誘導(dǎo)干細(xì)胞分化為心肌細(xì)胞.丹參水溶性成分中最主要的活性成分是丹酚酸B(SalB)，具有抗氧化作用，和一些誘導(dǎo)劑相似.SalB能改善心肌梗塞大鼠的心臟功能，并能使心肌基因表達(dá)譜發(fā)生改變.陳嘉等［16］研究發(fā)現(xiàn)用30mg/L SalB的低糖DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)MSCs 24 h后，能增強(qiáng)NKX2.5和GATA-4mRNA的表達(dá)，誘導(dǎo)后分化的第14 d出現(xiàn)α-actin mRNA的表達(dá).SalB聯(lián)合5-aza對MSCs進(jìn)行聯(lián)合誘導(dǎo)24 h，能提供心肌特異性蛋白cTnT的表達(dá)，能增強(qiáng)心肌早期分化基因NKX2.5和GATA-4表達(dá)［17］，能明顯增強(qiáng) Desmin和 α-actin mRNA表達(dá)［18］，說明丹參和SalB對MSCs向心肌細(xì)胞分化具有一定誘導(dǎo)和促進(jìn)作用.

2.6 人參皂苷和三七皂苷

人參皂苷(GS)是從人參的根、莖、葉中提取精制而成，具有抗氧化作用，對缺血心肌有保護(hù)作用.人參皂苷Rg1能通過刺激心肌局部組織分泌粒細(xì)胞集落刺激因子(G-CSF)而誘導(dǎo)骨髓細(xì)胞游走至心肌組織進(jìn)而向血管內(nèi)皮細(xì)胞分化.三七總皂苷(PNS)是三七提取的活性有效成分.三七皂苷以濃度依賴方式減少 S期細(xì)胞，阻滯細(xì)胞于 G0/G1期［19］，經(jīng) GS/PNS 組，5-aza 組，GS/PNS+5-aza 組誘導(dǎo)后的MSC，心肌樣細(xì)胞的特異性蛋白結(jié)蛋白和肌鈣蛋白陽性細(xì)胞增多，心肌細(xì)胞特征性基因α-MHC和 β-MHC 的表達(dá)增強(qiáng)［20，21］.

2.7 雙龍方

中藥復(fù)方雙龍方(主要成分人參皂苷Rb1，丹參酚酸B)，具有益氣養(yǎng)血，活血通脈之功效，并在治療心肌梗塞上有顯著作用.有研究小組利用基因芯片技術(shù)［22］和二維電泳分離技術(shù)［23］檢測雙龍方誘導(dǎo)ES細(xì)胞分化過程中差異表達(dá)的基因和蛋白變化，發(fā)現(xiàn)雙龍方能誘導(dǎo)ES細(xì)胞分化為心肌細(xì)胞，其所引起的差異基因變化與5-aza相似.綜上不同中藥的藥理作用和研究進(jìn)展匯總見表1.

表1 不同中藥的藥理作用和研究進(jìn)展Fig.1 Pharmacological effects and the research progresses of different of traditional Chinese medicine(TCM)

3 中藥誘導(dǎo)小鼠胚胎干細(xì)胞分化為心肌細(xì)胞存在的問題及前景

隨著ES細(xì)胞的建系和培養(yǎng)技術(shù)，ES細(xì)胞自我更新和定向分化的調(diào)控機(jī)制方面有了更深入的研究.如何充分利用ES細(xì)胞分化的心肌細(xì)胞，更清楚地了解心肌分化的機(jī)制，多能干細(xì)胞的臨床應(yīng)用和干細(xì)胞移植仍然面臨許多問題需要解決:1)明確誘導(dǎo)心肌分化的信號調(diào)控機(jī)制，尋找合適的誘導(dǎo)條件使ES細(xì)胞有效地分化為心肌細(xì)胞;2)控制合適的移植心肌細(xì)胞的數(shù)目和遷移定位;3)保證移植后細(xì)胞的存活率和增殖狀態(tài);4)促使移植后的心肌細(xì)胞在電生理上與受體組織協(xié)調(diào)一致，安全長效的發(fā)揮正常生理作用［24，25］.

對ES細(xì)胞移植治療心肌梗死而言，若能發(fā)現(xiàn)有效促進(jìn)心肌分化的中藥，將大大提高治療效果，其原因如下:1)選擇臨床運(yùn)用廣泛的中藥，促進(jìn)干細(xì)胞分化為足量健康的心肌細(xì)胞，同時配合移植治療心臟疾病;2)中藥能為體外培養(yǎng)的心肌細(xì)胞提供良好的培養(yǎng)環(huán)境，利于心肌細(xì)胞生長;3)中藥可直接刺激自體干細(xì)胞本身分泌調(diào)控因子，啟動心肌分化程序;4)中藥與其他藥物配合，相互作用，能提高誘導(dǎo)效率，高效微量，毒副作用少.

［1］Watabe T，Miyazono K.Roles of TGF-beta family signaling in stem cell renewal and differentiation［J］.Cell Res，2009，19(1):103-115.

［2］Nakamura T，Sano M，Songyang Z，et al.A Wnt-and betacatein-dependent pathway for mammalian cardiac myogeneses［J］.Proc Nat1 Acad Sci USA，2003，100(1):5834-5839.

［3］Wang Y，Chen G，Song T，et al.Enhancement of cardiomyocyte differentiation from human embryonic stem cells［J］.Sci China Life Sci，2010，53(1):581-589.

［4］Chang W T，Shao Z H，Yin J J，et al.Comparatative effects of flavonoids on oxidant scavenging and ischemia-reperfusion injury in cardiomyocytes［J］.Eur J Pharmacol，2007，566(1):59-66.

［5］Lin L，Wu X D，Davey A K，et al.The anti-inflammatory effect of baicalin on hupoxia/reoxygenation and TNF-alpha induces injury in cultural rat cardiomyocytes［J］.Phytother Res，2010，24(1):429-437.

［6］唐美林.黃芩苷促進(jìn)小鼠胚胎干細(xì)胞向功能性心肌細(xì)胞分化及其調(diào)控機(jī)制［D］.武漢:華中科技大學(xué)，2012.

［7］Malaixijitnond S，Tungmunnithum D，Gittarasanee S，et al.Puerarin exhibits weak estrogenic activity in female rats［J］.Fitoterapia，2010，81(1):569-576.

［8］程 穎.葛根素促進(jìn)小鼠胚胎干細(xì)胞源工作心肌細(xì)胞的分化及其調(diào)控機(jī)制［D］.武漢:華中科技大學(xué)，2011.

［9］劉雪花.淫羊藿苷藥理研究進(jìn)展［J］.中國現(xiàn)代醫(yī)生，2009，21(1):49-50.

［10］Zhu D Y，Lou Y J.Inducible effects of icariin，icaritin and desmethylicaritin on directional differentiation of embryonic stem cells into cardiomyocytes in vitro［J］.Acta Pharmacol Sin，2005，26(4):477-485.

［11］Ding L，Liang X G，Hu Y，et al.Involvement of p38MAPK and reactive oxygen species in icariin-induced cardiomyocyte differentiation of murine embryonic stem cells in vitro［J］.Stem Cells Dev，2008，17(4):751-760.

［12］Ding L，Liang X G，Zhu D Y，et al.Icariin promotes expression of PGC-1 alpha，PPARalpha，and NRF-1 during cardiomyocyte differentiation of murine embryonic stem cells in vitro［J］.Acta Pharmocol Sin，2007，28(10):1541-1549.

［13］楊慶有，冼紹祥，孫慧茹，等.黃芪含藥血清誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分化為心肌樣細(xì)胞的實驗研究［J］.遼寧中醫(yī)雜志，2008，35(6):832-834.

［14］王芳潔，易豈建，郭鵬飛.小鼠胚胎干細(xì)胞分化為心肌細(xì)胞的體外實驗［J］.第四軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報，2009，9(1):808-811.

［15］武重陽，孫蘭軍，趙英強(qiáng)，等.復(fù)方丹參滴丸含藥血清誘導(dǎo)大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分化為心肌樣細(xì)胞［J］.中國老年學(xué)雜志，2010，16(1):2328-2330.

［16］陳 嘉，孫京臣，鄒移海，等.丹酚酸b誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向心肌樣細(xì)胞分化［J］.第四軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報，2007，23(1):2152-2155.

［17］孫連勝，徐秀梅，郭茂娟，等.丹酚酸B體外干預(yù)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分化過程中cTnT的表達(dá)［J］.天津中醫(yī)藥，2007，4(1):49-51.

［18］華聲瑜，趙桂峰，郭茂娟，等.丹酚酸B在大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分化過程對心肌早期基因Nkx2.5 GATA-4 mRNA表達(dá)的影響［J］.遼寧中醫(yī)雜志，2008，8(1):409-412.

［19］龐榮清，潘吳覃.三七總皂苷對兔血管平滑肌細(xì)胞核因子 κappaB 和細(xì)胞周期的影響［J］.中國微循環(huán)，2004，3(1):154-156.

［20］汪朝暉，冼紹祥，楊忠奇，等.人參總皂苷誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分化為心肌樣細(xì)胞的實驗研究［J］.廣州中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報，2006，2(1):100-103.

［21］李志泉，冼紹祥，汪朝暉，等.三七總皂苷對骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞增殖和向心肌樣細(xì)胞分化的影響［J］.廣州中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報，2007，6(1):470-475.

［22］王金津，錢夕元，李 雪，等.雙龍方有效成分誘導(dǎo)干細(xì)胞分化過程中差異表達(dá)基因的篩選和聚類分析［J］.世界科學(xué)技術(shù)-中醫(yī)藥現(xiàn)代化，2007，3(1):39-42.

［23］Fan X，Li X，Lü S，et al.Comparative proteomics research on ratMSCsdifferentiation induced by Shuanglong Formula［J］.J Ethnopharmacol，2010，131(3):575-580.

［24］Menasche P.Stem cell therapy for heart failure:are arrhythmias a real safety concern?［J］.Circulation，2009，119(20):2735-2740.

［25］Segers V F，Lee R T.Stem cell therapy for cardiac disease［J］.Nature，2008，451(7181):937-942.