孫遠(yuǎn)征，許 娜，王雅青

(1.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第二醫(yī)院，黑龍江哈爾濱150001;2.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，黑龍江哈爾濱150040)

慢性腦供血不足是由多種原因引起的長期的腦供血不足導(dǎo)致的腦代謝障礙和功能衰退的一種病理過程，早期表現(xiàn)為一個或多個認(rèn)知領(lǐng)域功能障礙，最終進展為血管性癡呆(vascular dementia，VD)、動脈硬化性白質(zhì)腦病(Binswanger病)等多種腦血管疾病[1]。自上個世紀(jì)90年代以來關(guān)于慢性腦供血不足的病理機制及其治療的研究日益受到重視，有效干預(yù)慢性腦供血不足的進展對于預(yù)防上述腦血管疾病的發(fā)生有重大意義。而迄今的研究結(jié)果表明，現(xiàn)有治療手段多為針對血管性癡呆，而缺乏對本病理狀態(tài)的特異性治療手段[2]。本課題采用于致順老師的頭穴叢刺方法干預(yù)慢性腦缺血大鼠，觀察對學(xué)習(xí)記憶能力及相關(guān)蛋白表達(dá)的影響，為臨床干預(yù)慢性腦供血不足所致認(rèn)知功能障礙提供新的思路。

1 實驗材料

1.1 實驗動物

健康雄性Wistar大鼠65只，體重180～230 g，動物及飼料均由黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)動物實驗中心提供。實驗前適應(yīng)性馴養(yǎng)1周，室溫及濕度保持23℃、70%左右。

1.2 藥品及試劑

尼莫地平片(天津市中央藥業(yè)有限公司)，兔抗大鼠TH抗體(北京博奧森生物技術(shù)有限公司)，二步法免疫組化檢測試劑(北京中杉金橋試劑公司)。

1.3 儀器與設(shè)備

Morris水迷宮由安徽淮北正華生物儀器設(shè)備有限公司提供;華佗牌針灸針規(guī)格:0.30 mm×13 mm。

2 實驗方法

2.1 動物分組

65只大鼠中淘汰游泳能力差和智力低下的大鼠3只后，隨機分為假手術(shù)組10只和手術(shù)組52只。術(shù)后4周進行第2次Morris水迷宮實驗，統(tǒng)計大鼠逃避潛伏期及平臺所在象限游泳路程，淘汰超出空白對照組范圍的大鼠，剩余2VO手術(shù)組27只大鼠，隨機分為模型組9只、頭針組9只、藥物組9只。

2.2 造模方法

采用Sarti等[3]改良的2VO，分次結(jié)扎大鼠雙側(cè)頸總動脈。大鼠術(shù)前12 h禁食，4 h禁水。麻醉方法以大鼠每千克體重300 mg10%水合氯醛，給予腹腔注射。大鼠進入麻醉狀態(tài)后，將其仰臥位固定，依次于頸前術(shù)區(qū)去毛，碘伏消毒，手術(shù)側(cè)頸部切開約1～2 cm，鈍性分離頸總動脈，采用0號線依次結(jié)扎頸總動脈近心、遠(yuǎn)心端，確保結(jié)扎牢固后，用眼科剪將頸總動脈從兩個結(jié)扎點中間剪斷，以確保阻斷頸總動脈血流，剪斷后，局部消毒，逐層縫合。手術(shù)過程保證體溫及呼吸的穩(wěn)定。手術(shù)后動物置于保溫的單籠飼養(yǎng)。1周后采用同法結(jié)扎另一側(cè)頸總動脈。術(shù)后每日腹腔注射青霉素20萬單位/kg，連續(xù)7天。假手術(shù)組手術(shù)方法及術(shù)后飼養(yǎng)方法同手術(shù)組，但僅分離暴露頸總動脈而不結(jié)扎。

各組大鼠予以相同環(huán)境、飼料、供水條件飼養(yǎng)4周。

2.3 水迷宮測試

采用英國心理學(xué)家Morris于20世紀(jì)80年代設(shè)計并應(yīng)用于學(xué)習(xí)記憶腦研究的水迷宮系統(tǒng)[4]，分別于術(shù)前、術(shù)后4周、術(shù)后8周對各組大鼠進行水迷宮試驗。水迷宮試驗共4天，前3天定位航行，記錄各組每只大鼠逃避潛伏期(s)，即從大鼠入水到找到并爬到平臺上的時間，最長時間記為120 s，逃避潛伏期越短，說明大鼠的學(xué)習(xí)能力越好;第4天空間探索，記錄撤出平臺后于平臺所在象限游泳路程。

2.4 各組處理

假手術(shù)組、模型組:不予以任何處理，飼養(yǎng)方法同前。

頭針組:術(shù)后第5周開始治療，以頭穴叢刺理論為核心，參照《實驗動物穴位圖譜》取大鼠的百會穴，并取百會左右各旁開2 mm共3個穴位，從后向前平刺6～8 mm，每15 min捻針1次，100轉(zhuǎn)/min左右，每次持續(xù)捻轉(zhuǎn)3 min，留針30 min，每日1次，每天同一時段治療，共治療4周。

藥物組:術(shù)后第5周開始，進行尼莫地平灌胃治療。0.5%羧甲基纖維素鈉溶液溶解尼莫地平片，配成尼莫地平濃度為 0.02%的懸浮液，按大鼠體重1 mg/kg灌胃，每天1次，與頭針組同一時段進行，連續(xù)治療4周。

2.5 灌注取材

術(shù)后8周后，采用Morris水迷宮，定向航行試驗與空間探索試驗分別檢測各組大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力，數(shù)據(jù)整理后，采用多聚甲醛對各組大鼠進行固定處理，斷頭取腦，石蠟包埋，切片，分別進行HE染色及免疫組化驗查。

2.6 統(tǒng)計分析

所有數(shù)據(jù)均采用SPSS17.0統(tǒng)計軟件包處理，進行方差齊性分析，單樣本t檢驗，數(shù)據(jù)以±s表示，P＜0.05為具有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 行為學(xué)結(jié)果分析

3.1.1 造模結(jié)果 術(shù)后4周除假手術(shù)組外各組大鼠逃避潛伏期均明顯延長，與假手術(shù)組相比(P＜0.05)差異具有統(tǒng)計學(xué)意義;平臺所在象限游泳路程明顯縮短，與假手術(shù)組相比(P＜0.05)，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。說明造模成功。見表1、表2。

表1 術(shù)后4周各組大鼠逃避潛伏期比較(±s，s)

表1 術(shù)后4周各組大鼠逃避潛伏期比較(±s，s)

注:與假手術(shù)組比較，*P ＜0.05。

分組 例數(shù) 術(shù)后4周假手術(shù)組9 9.21 ±2.31模型組 10 20.39 ±4.53*頭針組 9 23.21 ±3.89*藥物組 9 21.15 ±4.31*

表2 術(shù)后4周各組大鼠平臺所在象限游泳路程比較(±s，cm)

表2 術(shù)后4周各組大鼠平臺所在象限游泳路程比較(±s，cm)

注:與假手術(shù)組比較，*P ＜0.05。

周路程假手術(shù)組分組 例數(shù) 術(shù)后4 9 1119.85 ±150.04模型組 10 979.88 ±101.20*頭針組 9 953.63 ±90.69*藥物組 9 876.65 ±77.15*

3.1.2 治療后行為學(xué)結(jié)果 ①學(xué)習(xí)能力方面:頭針組和藥物組較模型組大鼠逃避潛伏期明顯縮短，有明顯的統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01);頭針組與藥物組相比大鼠逃避潛伏期無明顯差異，無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。②記憶能力方面:頭針組、藥物組與模型組比較大鼠原平臺所在象限游泳路程明顯延長，具有明顯的統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01);頭針組與藥物組比較大鼠原平臺所在象限游泳路程無顯著差異(P＞0.05)。見表3、表4。

表3 術(shù)后8周各組大鼠逃避潛伏期比較(±s，s)

表3 術(shù)后8周各組大鼠逃避潛伏期比較(±s，s)

注:與模型組比較，*P ＜0.01;與藥物組比較，ΔP ＞0.05。

分組 例數(shù) 逃避潛伏期假手術(shù)組9 8.04 ±2.72模型組 10 28.47 ±6.19頭針組 9 17.53 ±5.02*藥物組 9 18.09 ±3.75＊△

表4 術(shù)后8周各組大鼠第一象限游泳路程比較(±s，cm)

表4 術(shù)后8周各組大鼠第一象限游泳路程比較(±s，cm)

注:與模型組比較，ΔP ＜0.01;與假手術(shù)組比較，*P ＜0.05。

分組 例數(shù) 術(shù)后8周假手術(shù)組9 1153.19 ±107.66模型組 10 835.49 ±86.33*頭針組 9 988.63 ±105.34Δ藥物組 9 978.37 ±99.35Δ

3.2 病理學(xué)結(jié)果

3.2.1 HE染色結(jié)果 假手術(shù)組:額葉皮層及海馬細(xì)胞數(shù)目多，排列緊密有序，形態(tài)正常，細(xì)胞質(zhì)染色均勻而色淺，核仁清晰。模型組:額葉皮層及海馬細(xì)胞數(shù)目明顯減少，排列疏松，形態(tài)不規(guī)則，細(xì)胞周圍間隙明顯，胞質(zhì)不均而著色較深，可見空泡形成，核仁固縮顯示不清，并見碎片形成。頭針組及藥物組:額葉皮層及海馬細(xì)胞數(shù)目較多，排列緊密，染色均勻而淺，少見形態(tài)不規(guī)則、胞質(zhì)不均、著色較深、核仁欠清晰的固縮細(xì)胞。見圖1～8。

3.2.2 免疫組化結(jié)果 在400倍顯微鏡下，按顯色的比例統(tǒng)計陽性細(xì)胞占細(xì)胞總數(shù)的百分比。以胞漿內(nèi)粉紅色至棕黃色染色為陽性表達(dá)。模型組TH的表達(dá)較假手術(shù)組明顯上調(diào)(P＜0.05);頭針組、藥物組TH的表達(dá)較模型組明顯上調(diào)(P＜0.05);頭針組與藥物組TH的表達(dá)無顯著差異(P＞0.05)。見表5及圖9～16。

表5 術(shù)后8周各組大鼠TH陽性細(xì)胞數(shù)百分比(±s，%)

表5 術(shù)后8周各組大鼠TH陽性細(xì)胞數(shù)百分比(±s，%)

注:與假手術(shù)組相比，*P ＜0.05;與模型組相比，＊＊P ＜0.05。

cortex hippocampus假手術(shù)組分組 例數(shù)9 0.00 ±0.00 0.00 ±0.00模型組 10 48.3 ±2.7* 45.8 ±3.1*頭針組 9 78.6±5.1＊＊ 81.2±4.7＊＊藥物組 9 79.4±3.6＊＊ 74.4±4.3＊＊

圖1 假手術(shù)組大鼠額葉HE染色

圖2 假手術(shù)組大鼠海馬HE染色400

圖3 模型組大鼠額葉HE染色

圖4 模型組大鼠海馬HE染色400

圖5 頭針組大鼠額葉HE染色

圖6 頭針組大鼠海馬HE染色400

圖7 藥物組大鼠額葉HE染色

圖8 藥物組大鼠海馬HE染色400

圖9 假手術(shù)組大鼠額葉TH表達(dá)

圖10 假手術(shù)組大鼠海馬TH表達(dá)

圖11 模型組大鼠額葉TH表達(dá)

圖12 模型組大鼠海馬TH表達(dá)

圖13 頭針組大鼠額葉TH表達(dá)

圖14 頭針組大鼠海馬TH表達(dá)

圖15 藥物組大鼠額葉TH表達(dá)

圖16 藥物組大鼠海馬TH表達(dá)

4 討論

學(xué)習(xí)記憶能力與復(fù)雜的神經(jīng)生理及生物化學(xué)機制相關(guān)，其中神經(jīng)遞質(zhì)對于學(xué)習(xí)記憶的形成和維持具有非常重要的作用。蘭光明[5]經(jīng)過研究發(fā)現(xiàn)，多巴胺系統(tǒng)功能紊亂是認(rèn)知功能障礙發(fā)病的重要機制之一。而酪氨酸羥化酶TH主要分布在多巴胺能神經(jīng)元和去甲腎上腺素能神經(jīng)元，是哺乳動物體內(nèi)兒茶酚胺(catecholamines，CA)類神經(jīng)遞質(zhì)體內(nèi)生物合成過程中的限速酶。其活性受體內(nèi)外多重因素影響，有短周期調(diào)節(jié)與長周期調(diào)節(jié)兩種機制[6]。慢性腦供血不足使大腦處于缺血缺氧的狀態(tài)而導(dǎo)致神經(jīng)元變性，通過短周期調(diào)節(jié)機制即負(fù)反饋作用，使TH表達(dá)上調(diào)。本實驗中，頭穴叢刺對TH表達(dá)的影響可能與長周期調(diào)節(jié)機制有關(guān)。國內(nèi)外研究表明[7－8]，低氧狀態(tài)可提高TH mRNA轉(zhuǎn)錄速率和TH mRNA的穩(wěn)定性，增強胞漿蛋白與TH mRNA 3'端未翻譯區(qū)域的結(jié)合，保護mRNA免受核酸酶的作用而降解，從而上調(diào)TH的表達(dá)，使多巴胺等兒茶酚胺類神經(jīng)遞質(zhì)合成增多，作為自發(fā)性保護學(xué)習(xí)記憶能力。已有研究[9]表明，鈣離子通道阻滯劑尼莫地平有一定的神經(jīng)保護作用，可以改善認(rèn)知功能，并已經(jīng)被有效地運用于臨床實踐中。

頭穴叢刺法是我校于致順老教授從事針灸事業(yè)40余年從臨床實踐中總結(jié)出來的，對中風(fēng)等各種中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病有顯著療效，于教授[10]認(rèn)為，針具刺入后，產(chǎn)生一定的“場”，直接作用干大腦皮層及有關(guān)部位，改善了這些部位的病理變化。并經(jīng)過研究證明，針捻轉(zhuǎn)后能產(chǎn)生運動誘發(fā)電位，對相關(guān)神經(jīng)功能的遠(yuǎn)端部位產(chǎn)生點沖動刺激。近年來關(guān)于頭穴叢刺治療范圍的研究以及機理的研究也日益增多[11－15]。筆者在本次研究中認(rèn)識到:①分次結(jié)扎雙側(cè)頸總動脈術(shù)可以成功制作慢性腦缺血大鼠，并且死亡率較低;②頭穴叢刺可以明顯保護慢性腦缺血大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力，其機制可能與上調(diào)TH的表達(dá)有關(guān);③頭穴叢刺法與尼莫地平治療慢性腦缺血大鼠的療效相當(dāng)，其差異不具有統(tǒng)計學(xué)意義。

本實驗在眾多研究的基礎(chǔ)上，采用頭穴叢刺方法干預(yù)慢性腦缺血模型大鼠，觀察其學(xué)習(xí)記憶能力以及TH表達(dá)的變化。經(jīng)實驗可以推論，頭穴叢刺確有保護慢性腦缺血大鼠學(xué)習(xí)記憶能力的作用，其機制可能與上調(diào)TH的表達(dá)有關(guān)。

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