劉 偉，陳 劍，宋 佳，宋滇文＊

（1.解放軍第113醫(yī)院 骨科，浙江 寧波315040；2.浙江大學醫(yī)學院附屬邵逸夫醫(yī)院 骨科，杭州310016；

3.第二軍醫(yī)大學附屬長征醫(yī)院 骨科，上海200003）

富血小板血漿（Platelet－rich plasma，PRP）是從自體血中提取出來的血小板濃縮物，來源于自體，無免疫排斥反應，制作方便，對機體創(chuàng)傷小。大量臨床研究報道，PRP能促進骨和軟組織的修復，近年來，PRP已經(jīng)被應用于骨科，頜面外科，神經(jīng)外科等多種學科。富血小板血漿凝膠（Platelet－rich plasma gel，PRG）是PRP被凝血酶等激活物激活后形成的膠凍狀物，含有大量的各種血小板源性細胞生長因子，具有促進多種組織修復的作用，PRG作為一種新的骨修復材料，其應用范圍日益擴大。PRG本身還呈現(xiàn)典型的多孔性結構[1]，并具有良好的粘附性，符合骨組織工程支架材料的要求，本實驗即研究PRG生物細胞支架的三維空間結構以及與兔骨髓間充質干細胞（BMSCs）共培養(yǎng)后的組織相容性，以為下一步構建組織工程骨奠定實驗基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 富血小板血漿激活劑的配制，取5 g 10%氯化鈣（Amersco）溶于50ml去離子水，0.2 μm濾膜過濾后分裝，－20℃保存。臨用時在0.5 ml 10%氯化鈣溶液中加入凝血酶500U（如吉生物）。

1.2 Lendersberg法制備PRP 取成年新西蘭大白兔，從其耳緣靜脈抽取靜脈血10ml，加入2ml 0.109M檸檬酸鈉抗凝；將抽取靜脈血200g離心10min；吸取全部上清液直至交界面下3mm，并將其移至另一離心管；平衡后200g離心10min；離心管中液體分為2層，吸取3／4上清液棄掉，剩余即為PRP，再取20μL PRP進行血小板計數(shù)；同時取20 μl全血作為對照。此步重復三次。

1.3 血小板計數(shù)方法 于清潔試管中加入稀釋液0.38ml。準確吸取待測標本20μl，擦去管尖外附著血液，置于血小板稀釋液內，立即充分混勻。待完全溶血后再次混勻1min。取上述均勻的血小板懸液1滴，注入計數(shù)池內，靜置10－15min，使血小板下沉。按以下公式計算：血小板數(shù)／L＝5個中方格內血小板數(shù)×5×10×20×106／L。

1.4 PRG生物細胞支架的構建 用2ml注射器依次吸入0.8ml PRP、0.2ml激活劑及少許空氣，搖勻，靜置5－10min，即制成PRG生物支架，并進行大體標本和掃描電鏡（日立S－520）觀察。

1.5 兔BMSCs在PRG生物細胞支架中的生長將通過全骨髓貼壁法培養(yǎng)獲得的第3代兔BMSCs以0.05%胰酶／0.02%EDTA消化后，調整細胞濃度為106左右，制成兔BMSCs細胞懸液；將前步制備的PRP和BMSCs細胞懸液以4∶1的比例混合；將PRP和BMSCs混合物500μl移入15ml離心管，混合均勻后加入80μl激活劑；待PRP形成凝膠后，加入2%FBS的DMEM－LG培養(yǎng)基2ml左右，隔日換液，培養(yǎng)1周后停止培養(yǎng)，并將部分標本取出后剪碎，以胰酶消化后再置于10%FBS的DMEMLG培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)，觀察其形態(tài)以及增殖能力。同時將培養(yǎng)至第3天的部分標本固定后行掃描電鏡觀察。

2 結果

2.1 PRP的制備 通過Lendersberg兩步離心法順利制得富血小板血漿（PRP），方法簡便快速，容易制備。

2.2 血小板計數(shù) 全血中血小板濃度三次測定結果分別為340×109／L、378×109／L和336×109／L（平均351×109／L），PRP中血小板濃度三次測定結果分別為1290×109／L、1321×109／L和1330×109／L（平均1314×109／L），與全血相比，PRP中的血小板濃度增加了3.74倍。

2.3 PRG生物支架大體標本和掃描電鏡結構PRP經(jīng)過激活劑激活后5－10min就形成膠凍狀的PRG。掃描電鏡掃描結果顯示其凝膠三維結構中，主要框架結構為纖維素，纖維素之間縱橫交錯并形成復雜的立體網(wǎng)狀結構，孔隙直徑約50－100微米，其中附著有大量的血小板細胞和少量的紅細胞（圖1）。

圖1 掃描電鏡下PRG的三維結構圖?？紫吨睆郊s50－100微米，附著有大量的血小板和少量紅細胞。

2.4 兔BMSCs在PRG中的生長 兔BMSCs在PRG中培養(yǎng)3天，行掃描電鏡觀察，結果顯示：在PRG三維結構中，兔BMSCs在纖維素支架構成的纖維網(wǎng)絡中附著良好（圖2）。培養(yǎng)1周后將兔BMSCs和PRG構成的復合物消化后再于10%FBS的DMEM－LG中培養(yǎng)，1d后見培養(yǎng)皿底可見有梭形以及多角形細胞貼壁，1周后細胞生長良好并繼續(xù)增殖（圖3），證明兔BMSCs可以在PRG中存活和生長。

圖2 兔BMSCs附著于PRG三維網(wǎng)狀結構中。

圖3 兔BMSCs和PRG共培養(yǎng)1周并消化后再培養(yǎng)：A，1d后見培養(yǎng)皿底可見有梭形以及多角形細胞貼壁；B，1周后細胞生長良好并繼續(xù)增殖。

3 討論

PRP的制作方法主要有血漿分離法、一次離心和兩次離心技術。血漿分離法需要專業(yè)的血漿分離機，費用昂貴，過程復雜，難以普及。一次離心法制備PRP對血液只經(jīng)過一次離心，血小板回收率低，難以得到高濃度PRP，激活后亦不能分泌足量細胞生長因子。兩次離心法是目前獲取PRP的主要途徑，即對抽取的血液經(jīng)過兩次離心，有較高的血小板回收率，可獲取高濃度PRP。

大多數(shù)研究證實了PRP具有促進骨修復的作用[2，3]，因此PRP目前被越來越多的應用到骨修復和骨組織工程中。PRP促進骨缺損修復可能主要基于以下兩種機制：一種為PRP在激活劑作用下活化為PRG，其中含有大量纖維蛋白原，能封閉創(chuàng)面，促進組織收縮和愈合；另一種為聚合過程中血小板收縮、脫顆粒釋放多種高濃度生長因子，包括PDGF、TGFβ、VEGF、IGF和 EGF等，這些生長因子在骨與軟組織的修復過程中發(fā)揮重要作用，可以加速細胞分化[4]，促進成骨細胞和成纖維細胞的增殖[5]。這些細胞因子中中最重要的是為PDGF和TGFβ，PDGF可以促進成骨細胞生長和微血管形成，同時還能增強巨噬細胞的活性[6]，TGF－β則可促進前成骨細胞增殖并抑制骨吸收[7，8]，PRG中其他生長因子也同時具有良好的促進骨與軟骨修復和再生的作用[9]。Yamada等[10]研究認為PRP和間充質干細胞混合物注射到骨缺損部位后，其骨修復作用與自體松質骨顆粒移植效果相當。當然，PRP需來源于自體，并具有一定的濃度才能達到預期效果，若采用異體血制備得到的PRP，則會因為免疫反應而得到陰性結果[11]。同時，已有大量研究結果證實PRP應用于骨組織工程時，其釋放的多種生長因子亦具有明確的促進BMSCs增殖的作用[12]，因此其應用于組織工程具有其他支架材料無法具備的獨特優(yōu)點。

PRG在組織工程中的應用不僅作為細胞生長和分化的誘導因子，其具有特殊的三維空隙結構，孔隙直徑從10μm[1]至200－1000μm[13]不等，孔隙率約80%左右，符合骨組織工程支架材料的要求。目前以PRG作為細胞支架的組織工程研究還十分有限，Del Bue等[14]將其作為支架材料用在馬肌腱的組織工程重建，結果顯示87.5%取得了良好效果。Drengk等[15]研究顯示PRG作為細胞支架能明顯促進軟骨細胞與間充質干細胞的增生和向軟骨細胞分化。本實驗制備的自體PRG生物細胞支架孔隙直徑約50－100微米，具有完整的三維結構和良好的組織相容性，與兔BMSCs復合培養(yǎng)后種子細胞與纖維素附著良好，血小板顆粒分布均勻，經(jīng)體外培養(yǎng)后消化再培養(yǎng)仍有大量細胞生長，說明PRP與種子細胞有良好的生物相容性，與其他細胞支架相比具有諸多優(yōu)點：（1）PRG生物支架材料有良好的孔隙率，本身具有豐富的細胞生長因子如 TGF－β、PDGF、IGF等，能明顯促進種子細胞的增殖和轉化，這是其它支架材料所沒有的；（2）富PRP和自體BMSCs均來源于自體，無免疫源性；（3）與其他支架材料相比，PRG生物細胞支架材料不需要將支架與細胞在體外培養(yǎng)，構建組織工程骨時已與干細胞充分混勻，避免了細胞只附著于支架材料表面或長入支架材料不充分的缺點；（4）對組織損傷小，費用低，易于應用和推廣；（5）將種子細胞復合PRG生物細胞支架構建的組織工程材料可經(jīng)皮體外注入，操作方便。本實驗結果表明自體富血小板血漿凝膠是一種優(yōu)良的組織工程細胞支架，具有良好的應用前景。

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