任凌雁，何 燕，張 婷，王嬋娟，官志忠，單可人

(貴陽醫(yī)學院分子生物學重點實驗室，貴州貴陽 550004）

近年來，利用線粒體DNA(mitochondrial DNA，mtDNA)和Y染色體多態(tài)位點對不同人群進行比較，從而使人類進化和群體遺傳研究得到較大發(fā)展。人類mtDNA極少發(fā)生重組，有效群體小，能嚴格的執(zhí)行母系遺傳。單核甘酸多態(tài)性 (Single nucleotide polymorphism，SNP)是人類變異最常見的一種，由于其密度高，遺傳穩(wěn)定等特點，SNP被認為是第三代遺傳標記而廣泛應用［1］。mtDNA上COⅡ/tRNALys基因間的非編碼區(qū)Ⅴ中存在一個9 bp序列 (CCCCCTCTA)缺失的多態(tài)位點［2］，研究顯示不同地域人群mtDNA 9 bp缺失頻率有很大差別，是檢測人類群體多態(tài)性的主要標志之一。Y染色體是父系遺傳，并且大部分不發(fā)生重組，是分析人類起源、遷徙的重要工具。其中Y染色體DYS287位點是一個應用廣泛，具有較高研究價值的多態(tài)位點，檢測其陽性率可以研究不同民族群體的遺傳關(guān)系。貴州是一個多民族省份，世居少數(shù)民族達17個，本次研究就17個世居少數(shù)民族中的毛南族、畬族等9個民族作mtDNA Region V以及Y染色體DYS287位點的多態(tài)性檢測，分析這9個民族群體的遺傳多態(tài)性。

1 材料與方法

1.1 樣本采集

根據(jù)知情同意原則，分別采集貴州平塘毛南族、麻江畬族、黔西仡佬族、麻江仫佬族、威寧回族、剛邊壯族、黔西滿族、石阡蒙古族、江口羌族各60份血液標本，采血對象均3代內(nèi)無族外通婚，彼此間無親緣關(guān)系男性，EDTA·K2抗凝。

1.2 方法

1.2.1 DNA提取 按照酚氯仿法提取外周血白細胞DNA，定量標化至100 ng/μL后于－20℃保存。

1.2.2 mtDNA Region V的擴增及序列測定 引物序列:F 5-ACTTTCACCGCTACACGA-3，R 5-ATTTAGTTGGGGCATTTC-3，PCR反應體系為 25 μL，包括:10 × PCR Buffer 2.5 μL，25 mmol/L MgCl21.5 μL，2.5 mmol/L dNTP 2 μL，10 μmol/L上下游引物各0.4 μL，TaqDNA聚合酶0.4U(北京天根生化有限公司)，DNA模板100 ng。PCR循環(huán)參數(shù)為94℃ 5 min，94℃ 30 s，58℃ 30 s，72℃ 30 s，30個循環(huán)，72℃ 5 min。擴增產(chǎn)物用聚丙烯酰胺凝膠檢測。序列測定交由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司完成。

1.2.3 Y染色體DYS287位點的擴增及瓊脂糖凝膠電泳檢測 YAP引物序列F:5’-CAG GGG AAG ATA AAG AAA TA-3’，R:5’-ACT GCT AAA AGG GGA TGG AT-3’，25 μL PCR反應體系組成為:10× PCR buffer 2.5 μL，25 mmol/L MgCl21.5 μL，4×dNTP(每種10 mmol/L)2 μL，引物各 0.5 μL，DNA聚合酶1.0U(北京天根生化有限公司)，模板DNA 100 ng。PCR循環(huán)條件:94℃變性40 s，51℃退火40 s，72℃延伸30 s，循環(huán)30次。PCR產(chǎn)物用w=2%瓊脂糖凝膠電泳分離。

2 結(jié)果

2.1 mtDNA Region V缺失多態(tài)類型檢測與分析

在PCR檢測中未見非特異擴增，并且獲得2種帶型，即258(雙拷貝9 bp型)和249 bp(9 bp缺失型)，結(jié)果見圖1。擴增產(chǎn)物測序結(jié)果與相對應的劍橋序列一致，結(jié)果見圖2。檢測的9個民族(各60份):仡佬族、畬族、壯族、仫佬族、毛南族、蒙古族、回族、羌族、滿族mtDNA 9 bp缺失個數(shù)分別為:16、15、11、8、6、5、4、3。

圖3 貴州9個少數(shù)民族mtDNA Region V缺失頻率比較Fig.3 The comparison of mtDNA Region V deletion in 9 ethnic groups of Guizhou

2.2 Y染色體DYS287多態(tài)類型

在PCR－瓊脂糖凝膠電泳檢測中，未見非特異擴增，獲得2種帶型，455 bp(YAP+)和150 bp(YAP－)見圖4，即發(fā)現(xiàn)仡佬族、毛南族分別有12例、1例YAP+，其余民族均為YAP－。

圖4 Y染色體DYS287位點PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果Fig.4 The results of electrophoresis of PCR products of Y-chromosome DYS287 sites

3 討論

3.1 貴州9個民族mtDNA的Region V區(qū)9 bp分布特點

mtDNA的Region V區(qū)是位于8272－8289核苷酸之間2個串聯(lián)的重復序列，其中一個由于DNA復制過程中滑鏈錯配而丟失。學者認為9 bp序列的缺失起源于亞洲并且是亞洲人群的特征［3］，并且其分布與種群、地域有關(guān)。就我國民族9 bp缺失頻率分析，臺灣漢族9 bp缺失頻率高達40%［4］，均高于本次研究的9個民族，而廣州漢族的缺失頻率 (20.8%)［5］與本次研究的蒙古族、回族、羌族、滿族相差較大;西北邊的一些少數(shù)民族，如朝鮮族 (9.43%)、維吾爾族 (3.3%)、塔吉克族 (1.43%)、現(xiàn)代羅布人 (8.3%)［6－9］與本次研究的回族、羌族、滿族、蒙古族的缺失頻率相近，與仡佬族等相差較大。這與姚永剛得出的結(jié)論是一致的。

從貴州世居民族的支系劃分來看，畬族據(jù)記載是屬于瑤族的一個分支，壯族、仡佬族、仫佬族、毛南族來源于古老的百越部落，其中仡佬族是貴州特有的少數(shù)民族，自商周時期就有記載。而蒙古族、回族、羌族、滿族則是屬于北方部落的民族。本次研究發(fā)現(xiàn)，起源于百越、苗瑤支系的民族9bp缺失頻率是高于北方起源的民族的。但是同為北方民族的西北蒙古族的缺失頻率 (4%)［4］低于貴州蒙古族，而貴州的滿族與遼寧的滿族 (6.67%)［4］缺失頻率相接近，究其原因可能是這些民族群體在遷徙過程中與其他群體發(fā)生基因融合造成的。

從中國民族的語系劃分來看，壯語、仫佬語、毛南語、仡佬語屬于壯侗語系;畬語屬于苗瑤語系;蒙古語、滿語屬于阿爾泰語系;羌語屬于漢藏語系;而回語屬于印歐語系。本次研究中，壯族、仫佬族、毛南族、仡佬族9 bp缺失頻率是接近的，畬族與苗瑤語系的苗族如雷山苗族 (25.27%)［10］的缺失頻率也相近，但是同為阿爾泰語系的蒙古族與滿族、同為漢藏語系的羌族與貴州漢族(11.43%)［4］的缺失頻率較大，盡管差異沒有達到顯著水平。

3.2 貴州9個民族Y染色體DYS287多態(tài)類型分析

DYS287位點是位于Y染色體長臂q11的一個Alu序列插入多態(tài)，是Y染色體特異區(qū)的雙等位基因位點，由于Alu插入事件在進化史中僅發(fā)生過一次，故YAP－被認為是祖先型［11］，可以用于鑒定穩(wěn)定的遺傳譜系關(guān)系。DYS287位點也是具有地理、種群分布的特異性，不同地區(qū)或者不同民族其DYS287位點的YAP+頻率不同。在我國藏族人群的 YAP+頻率為 41.5%［12］，普米族更是高達72.3%［13］，均遠高于本次研究。不同地區(qū)的同一個民族其YAP+表現(xiàn)也是有差異的，如蒙古族、回族。內(nèi)蒙古的蒙古族和甘肅回族YAP+頻率分別為4.3%［13］、3.23%［14］，而云南和貴州的蒙古族和回族 YAP+頻率均為0。

從民族起源來看，屬于北方部落的蒙古族、回族、羌族、滿族，他們中回族和滿族在其主要居住地發(fā)現(xiàn)YAP+，但是可能在遷徙過程中YAP+被稀釋以致于遷徙到貴州的民族群體中沒有發(fā)現(xiàn)YAP+;同屬百越系統(tǒng)的壯族、仡佬族、仫佬族、毛南族中，本次研究發(fā)現(xiàn)了仡佬族和毛南族攜帶YAP+，其余民族 YAP+均為零，分析其原因可能是仡佬族和毛南族作為一個獨立的群體與當時遷入的南方的漢族群體發(fā)生了基因交流所致，而其他百越系統(tǒng)的民族群體由于其古代部落沒有攜帶YAP+，加上地理環(huán)境與周圍隔絕造成了奠基者效應。從語言學分類上看，蒙古族、滿族的YAP+攜帶率與同屬阿爾泰語系的鄂倫春族［15］、哈薩克族的頻率一樣均為零;毛南族和仫佬族都屬于壯侗語系侗水語支，其親緣關(guān)系應該很近，本次研究中毛南族 YAP+的頻率為1.67%，仫佬族未發(fā)現(xiàn)YAP+，可能是由于實驗中抽樣誤差所致。畬族雖然與苗族同屬苗瑤語系，但是各自的YAP+攜帶率是有較大差異的，苗族 YAP+頻率為11.8%［13］，畬族為零，推測由于奠基者效應在本次研究的畬族群體中起到了作用。

總之，通過本次實驗，獲得了貴州9個世居少數(shù)民族mtDNA Region V以及Y染色體DYS287位點多態(tài)型數(shù)據(jù)，為我省少數(shù)民族的起源及遷徙提供了一定的遺傳背景資料。

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