凌峰，王曉春，陳珵，余敏，朱虹，羅彩鳳，邵世和

(1.江蘇大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與醫(yī)學(xué)技術(shù)學(xué)院，江蘇鎮(zhèn)江212013;2.昆山市中醫(yī)醫(yī)院檢驗科，江蘇蘇州215300;3.江蘇大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院，江蘇鎮(zhèn)江212013)

幽門螺桿菌(Helicobacter pylori，H.pylori)為人類胃部常見致病菌之一，其感染在世界范圍內(nèi)流行。H.pylori感染與多種胃腸道疾病的發(fā)生密切相關(guān)，如胃炎、消化性潰瘍、胃癌和胃黏膜相關(guān)淋巴樣組織淋巴瘤［1］。高致病性H.pylori存在一個細(xì)胞毒素相關(guān)基因致病島(cytotoxin associated gene pathogenicity island，cag PAI)結(jié)構(gòu)，編碼重要的 H.pylori相關(guān)毒力蛋白和1種Ⅳ型分泌系統(tǒng)［2］。該Ⅳ型分泌系統(tǒng)中的部分蛋白與根癌農(nóng)桿菌 (Agrobacterium tumefaciens，A.tumefaciens)的經(jīng)典Ⅳ型分泌系統(tǒng)——VirB/D4系統(tǒng)存在同源性［3］。目前仍有許多cag PAI基因編碼蛋白僅存在于H.pylori中，且功能未知，cag1基因即為其中之一。

本研究以cag PAI首個編碼基因cag1作為研究對象，擬用同源重組技術(shù)構(gòu)建cag1基因缺陷的自殺質(zhì)粒;通過電擊轉(zhuǎn)化細(xì)菌，抗性篩選出cag1基因缺陷株，并將其破壞GES-1細(xì)胞的能力與野生株進(jìn)行比較。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株、細(xì)胞株與質(zhì)粒 H.pylori NCTC11637由中國疾病預(yù)防控制中心傳染病研究所張建中教授饋贈，人胃上皮GES-1細(xì)胞由江蘇大學(xué)周天戟教授饋贈，H.pylori自殺質(zhì)粒pBluescript SKⅡ(-)載體由韓國國立慶尚大學(xué)微生物學(xué)教研室Seung-chul Baik教授饋贈。大腸埃希菌(E.coli)DH5α由江蘇大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與醫(yī)學(xué)技術(shù)學(xué)院實驗室保存。

1.1.2 主要試劑 哥倫比亞培養(yǎng)基、微需氧袋、胰蛋白胨、酵母提取物購自O(shè)xoid公司;小牛血清購自杭州四季青生物工程材料生物公司;三羥甲基氨基甲烷(Tris)、SDS購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;平衡酚、RNA酶購自Generay生物公司;1 000 bp DNA標(biāo)準(zhǔn)參照物、限制性核酸內(nèi)切酶EcoR I、BamH I、Kpn I、Xho I購自 Thermo公司;DL2000 DNA 標(biāo)準(zhǔn)參照物、Taq DNA聚合酶、dNTP、T4DNA連接酶、膠回收試劑盒購自TaKaRa公司;引物由上海英濰捷基生物工程有限公司合成。

1.1.3 主要儀器 核酸檢測儀(Eppendorf公司);基因擴(kuò)增儀(Applied Biosystems公司);凝膠成像系統(tǒng)(Syngene公司);高速冷凍離心機(jī)(Heraeus公司);恒溫水箱(上海醫(yī)療器械公司);搖床(上海?，攲嶒炘O(shè)備有限公司);電穿孔儀(Bio-Rad公司);電泳儀(南京馳順科技有限公司);CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱(Thermo公司);倒置生物顯微鏡系統(tǒng)(Nikon公司)。

1.2 方法

1.2.1 cag1基因兩側(cè)同源臂的擴(kuò)增 根據(jù)基因庫中的H.pylori全基因組序列，設(shè)計cag1基因上游和下游同源臂序列F1、F2的引物(表1)，cag1基因全長348 bp，引物P1/P2用于擴(kuò)增F1，引物P3/P4用于擴(kuò)增F2。以H.pylori NCTC11637基因組DNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增條件:95℃ 5 min，95℃30 s，50 ℃ 30 s，72 ℃ 60 s，35 個循環(huán)，72 ℃10 min;PCR產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳，EB染色后通過凝膠電泳圖像分析系統(tǒng)分析鑒定，使用膠回收試劑盒回收產(chǎn)物，－20℃保存。

表1 引物序列Tab 1 Sequence of primers

1.2.2 自殺質(zhì)粒 pBluescript/Δcag1 ∶∶Kmr的構(gòu)建

膠回收上下游同源臂片段與pMD-18T載體，通過T4DNA連接酶4℃連接16 h。將連接后的混合物，通過熱擊轉(zhuǎn)化入 E.coli DH5α，然后涂布于含100 μg/mL氨芐西林的LB固體培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)12 h。長出陽性菌落后，挑下繼續(xù)接種于含100 μg/mL氨芐西林的LB液體培養(yǎng)基內(nèi)，37℃振搖過夜，按照分子克隆指南中堿裂解法抽提細(xì)菌質(zhì)粒，并進(jìn)行酶切鑒定。膠回收上下游同源臂F1與F2，酶切兩個片段與含卡那霉素抗性(Kmr)片段的pBluescript載體，分步進(jìn)行連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至E.coli DH5α感受態(tài)細(xì)胞，轉(zhuǎn)化后涂布于含50 μg/mLKmr的LB平板上，37℃培養(yǎng)12 h，挑取單個菌落接種于含50 μg/mLKmr的LB液體培養(yǎng)基，37℃振搖過夜后抽提質(zhì)粒，進(jìn)行酶切鑒定，構(gòu)建自殺質(zhì)粒pBluescript/Δcag 1 ∶∶Kmr。

1.2.3 cag1基因缺陷株的構(gòu)建 H.pylori NCTC11637在哥倫比亞固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)72 h后，刮取細(xì)菌至1 mL 10%蔗糖與甘油的混合溶液，4℃ 5 000 r/min離心10 min(重復(fù)3次);沉淀重懸于100 μL 10%蔗糖甘油混合溶液中，4℃或冰上孵育10～15 min;加自殺質(zhì)粒約25 μg，4℃或冰上再次孵育5～10 min;移入冰預(yù)冷的0.2 cm規(guī)格大小的電擊杯，準(zhǔn)備點擊轉(zhuǎn)化。將電擊杯放入電擊儀器上的正確位置，確保正負(fù)極連接正確，將儀器工作條件設(shè)為25 F，2.5 kV，200 Ω，電擊5 s后，立即將電擊杯中的液體全部均勻涂布于含12.5 μg/mL卡那霉素的哥倫比亞平板上，37℃微需氧培養(yǎng)72 h。

收集培養(yǎng)細(xì)菌后進(jìn)行尿素酶以及細(xì)菌革蘭染色鑒定，提取基因組DNA進(jìn)行PCR鑒定。以上游同源臂F1的上游引物P1和下游同源臂F2的下游引物P4，進(jìn)行 PCR擴(kuò)增。反應(yīng)條件:94℃ 5 min，94 ℃ 30 s，50 ℃ 30 s，72 ℃ 60 s，35個循環(huán)，72 ℃10 min，以野生株作為PCR擴(kuò)增對照。擴(kuò)增結(jié)果送上海英濰捷基生物工程公司測序。鑒定無誤后，證明突變株構(gòu)建成功，將其命名為Δcag1。

1.2.4 胃上皮 GES-1細(xì)胞與 H.pylori野生株及cag1基因缺陷株共培養(yǎng) 胃上皮GES-1細(xì)胞按照常規(guī)方法培養(yǎng)2 d，H.pylori野生株和缺陷株Δcag1按照微需氧方法培養(yǎng)3 d，然后按照MOI=300∶1的比例，于細(xì)胞中加入細(xì)菌，培養(yǎng)8 h。倒置顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)。

2 結(jié)果

2.1 cag1基因兩側(cè)同源臂的制備

以H.pylori NCTC11637基因組DNA為模板，引物P1/P2、P3/P4分別用于擴(kuò)增上游同源臂F1(598 bp)和下游同源臂F2(737 bp)。擴(kuò)增產(chǎn)物見圖1。

圖1 cag1基因上下游同源臂PCR產(chǎn)物Fig 1 PCR amplification of F1 and F2 fragments of cag1 gene

2.2 cag1基因缺陷自殺質(zhì)粒的構(gòu)建與酶切鑒定

自殺質(zhì)粒 pBluescript/Δcag1∶∶Kmr由上下游同源臂與pBlueKM40載體連接后構(gòu)建完成，進(jìn)行酶切鑒定。經(jīng)KpnⅠ、XhoⅠ雙酶切后，出現(xiàn)約598 bp片段，即為F1片段;經(jīng)EcoRⅠ、BamHⅠ雙酶切后，出現(xiàn)約737 bp片段，即為F2片段;經(jīng)KpnⅠ、BamHⅠ酶切后，出現(xiàn)約2 700 bp大小的片段，即為F1、F2、Kmr基因相加片段。符合設(shè)計結(jié)果。見圖2。

圖2 自殺質(zhì)粒的酶切鑒定Fig 2 Identification of the suicide vector by restricted enzyme digestion

2.3 cag1基因缺陷株的鑒定

使用野生株、經(jīng)卡那霉素篩選的陽性細(xì)菌為模板，通過cag1基因同源臂F1上游引物P1和F2下游引物P4作PCR鑒定。結(jié)果顯示，野生株P(guān)CR產(chǎn)物約為1 400 bp，缺陷株P(guān)CR產(chǎn)物約為2 700 bp，與設(shè)計結(jié)果相符。擴(kuò)增產(chǎn)物測序結(jié)果也符合預(yù)期結(jié)果，證明cag1基因缺陷株構(gòu)建成功。見圖3。

圖3 H.pylori cag1基因缺陷株的產(chǎn)物鑒定Fig 3 Identification of H.pylori cag1 gene mutant

2.4 H.pylori野生株和cag1基因缺陷株與GES-1細(xì)胞共培養(yǎng)后細(xì)胞形態(tài)的變化

H.pylori NCTC11637野生株和cag1基因缺陷株分別與GES-1細(xì)胞共培養(yǎng)8 h的結(jié)果顯示，野生株感染后的細(xì)胞幾乎都被破壞，無正常形態(tài)，出現(xiàn)破碎、分散、延長和不規(guī)則變化的現(xiàn)象;而cag1基因缺陷株感染的細(xì)胞更接近于未感染細(xì)胞，仍存在大量梭形的正 常細(xì)胞，較少出現(xiàn)細(xì)胞破壞的現(xiàn)象。見圖4。

圖4 GES-1細(xì)胞與H.pylori野生株和cag1基因缺陷株共培養(yǎng)后的形態(tài)學(xué)觀察Fig 4 Morphological image of GES-1 cells infected with the H.pylori wild-type strain and cag1 gene mutant strain

3 討論

H.pylori是胃部疾病的重要病原體，其全球感染率高達(dá)50%，已成為世界重大公共衛(wèi)生問題。國際癌癥研究機(jī)構(gòu)(IARC)將其列為第一類致癌原［4］。近期文獻(xiàn)報道了cag PAI及其編碼的相關(guān)毒力蛋白CagA 在 H.pylori感染致病中的重要性［5－6］。流行病學(xué)研究證明，cag PAI陽性的H.pylori菌株致病性明顯高于cag PAI陰性株［7］。整個cag PAI區(qū)域長達(dá)35 000 ～40 000 bp，包含29 ～31 個基因［8－9］。其編碼蛋白構(gòu)成一種類似菌毛樣結(jié)構(gòu)的Ⅳ型分泌系統(tǒng)，該結(jié)構(gòu)伸出細(xì)菌表面，可將毒力因子注入宿主細(xì)胞［10］。該Ⅳ型分泌系統(tǒng)的蛋白中有11個與A.tumefaciens中的經(jīng)典 VirB/D4系統(tǒng)同源［3］。

目前，關(guān)于cag1基因功能的研究甚少。但在H.pylori感染的胃組織標(biāo)本中，cag1基因表達(dá)水平極高。與其相似的高表達(dá)基因還有尿素酶基因和過氧化氫酶基因等，上述基因功能與細(xì)菌存活和生長密切相關(guān)，說明在惡劣環(huán)境下cag1基因可能對維持細(xì)菌存活具有重要的作用［11］。生物信息學(xué)分析結(jié)果顯示，cag1編碼蛋白存在信號肽，在N端第21和22個氨基酸位置有切割位點，并且預(yù)測其可能是一種新型的分泌蛋白［12］。

本研究以cag PAI首個編碼基因cag1作為研究對象，利用同源重組原理，構(gòu)建cag1基因的缺陷株。選用克隆質(zhì)粒 pBluescript SKⅡ(-)構(gòu)建自殺質(zhì)粒，并在載體中插入一個含啟動子的Kmr基因片段，采用PCR方法擴(kuò)增得到cag1基因兩側(cè)片段F1(598 bp)與F2(737 bp)，作為同源臂連接于載體抗性基因片段的上下游，成功構(gòu)建cag1基因缺陷自殺質(zhì)粒［13］。采用電擊轉(zhuǎn)化技術(shù)將該質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入野生株。由于pBluescript SKⅡ(-)在H.pylori中無法復(fù)制，但具有自殺性，致細(xì)菌染色體與載體發(fā)生同源重組，使Kmr基因置換野生株的cag1基因，通過 Kmr篩選cag1基因敲除的缺陷株 pBluescript/Δcag1∶∶Kmr得以建立，并用 PCR方法鑒定該缺陷株。H.pylori感染宿主細(xì)胞后，會誘導(dǎo)細(xì)胞形態(tài)發(fā)生變化，導(dǎo)致細(xì)胞死亡。這種細(xì)胞形態(tài)延長的變化稱為蜂鳥樣改變。為了檢測cag1基因缺失對細(xì)菌毒力的影響，在獲得cag1基因缺陷株后，觀察H.pylori野生株和cag1基因缺陷株與GES-1細(xì)胞共培養(yǎng)后細(xì)胞形態(tài)的變化。結(jié)果顯示，野生株感染細(xì)胞后8 h，細(xì)胞破碎、分散、延長且形態(tài)不規(guī)則;而cag1基因缺陷株感染后，細(xì)胞大多形態(tài)正常。以上結(jié)果說明，cag1基因缺失后，共培養(yǎng)的GES-1細(xì)胞破壞減少。因此，我們認(rèn)為cag1基因缺失使H.pylori的毒力減弱，但毒力減弱的具體機(jī)制尚有待進(jìn)一步研究。

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