何榮軍，周菲，趙月鈞，孫培龍

(浙江工業(yè)大學(xué)生物與環(huán)境工程學(xué)院，浙江杭州，310014)

靈芝又叫靈芝草，屬于擔(dān)子菌綱，多孔菌目，多孔菌科，靈芝屬，含有多種藥理活性成分［1－4］。甾醇是其中比較重要的一類活性物質(zhì)，目前已從靈芝中分離出20多種［5］。靈芝甾醇具有抗腫瘤作用［5］，對大鼠局灶性腦缺血再灌注損傷有保護(hù)作用［6］。靈芝甾醇的傳統(tǒng)提取主要采用溶劑回流［7］和超聲法［8］，前者提取1.5h、復(fù)提3次后得率為0.080 8%，后者得率為0.051%。與之相比，閃式提取法［9－10］通過負(fù)壓、剪切、高速碰撞等各種外力作用使溶質(zhì)迅速進(jìn)入溶劑，能顯著降低提取時間和溫度，更適合甾醇的提取。本研究主要對靈芝甾醇的間歇式高速剪切閃式提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，并對提取得到的總甾醇進(jìn)行抗氧化活性研究。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

麥角甾醇標(biāo)準(zhǔn)品，上海源葉生物科技有限公司;靈芝，杭州市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院;ABTS，DPPH為sigma產(chǎn)品，其余都為國產(chǎn)試劑。

GF-1型控時-調(diào)速式高速分散機，江蘇海門麒麟醫(yī)用儀器廠;6890N/5975C氣相質(zhì)譜聯(lián)用儀，美國Agilent。

1.2 實驗方法

1.2.1 靈芝總甾醇提取工藝

取5 g靈芝粉于250 mL燒杯中→加入一定體積95%乙醇，室溫下剪切提取→抽濾得清液并濃縮至干→加入5 mL正己烷和5 mL水萃取→有機相濃縮至干→用10 mL無水乙醇溶解，測定總甾醇含量(以麥角甾醇計)。

1.2.2 靈芝甾醇提取條件優(yōu)化

1.2.2.1 單因素實驗

對乙醇濃度(體積分?jǐn)?shù)分別為 100%，95%，85%，75%，65%)、剪切時間(2，4，6，8，10 min)、液料比［(20，25，30，35，40)∶1］(mL∶g)，提取溫度(30，40，50，60，70 ℃)，轉(zhuǎn)速(2 800，5 600，8 400，11 200，14 000 r/min)進(jìn)行單因素實驗。

1.2.2.2 響應(yīng)面實驗

選取3個因素，根據(jù)Box-Beknhen中心組合實驗設(shè)計原理，設(shè)計實驗，獲取最佳提取工藝條件。

1.2.3 靈芝總甾醇組成及含量測定

1.2.3.1 GC-MS分析

參考何勝華［11］等對菜籽植物甾醇的GC-MS分析條件。

HP-5色譜柱(30 m ×0.25mm ×0.25 μm);載氣為高純度N2，體積流量1 mL/min;分流比20∶1;進(jìn)樣量1 μL;進(jìn)樣溫度300℃;柱溫285℃，溫升5℃/min，320℃保持 30 min。電離方式 EI，電子能量70eV;離子源溫度230℃;四級桿溫度150℃。

樣品前處理:取靈芝提取液濃縮至干，再用少量三氯甲烷溶解，用于GC-MS分析。

1.2.3.2 薄層色譜分析

在GF254硅膠板上點樣，展開劑是V(石油醚)∶V(乙酸乙酯)=6∶1，在254 nm波長下觀察。

1.2.4 靈芝總甾醇提取物的體外抗氧化活性實驗

1.2.4.1 清除DPPH·的能力

調(diào)整MarijanaKosani c′［12］的DPPH反應(yīng)體系，3.0 mL DPPH 溶液(1×10－4mol/L，無水乙醇配制)與200 μL樣品液混合反應(yīng)。

1.2.4.2 清除ABTS+·的能力

參照AnetaWojdy c′o［13］的ABTS法，加入樣品改為10 μL，避光反應(yīng)1h后測定734 nm處的吸光度。

1.2.4.3 清除羥自由基的能力

參照 Xiaoqin Huang［14］的方法作調(diào)整，所有試劑調(diào)整為0.5 mL并加入2 mL無水乙醇稀釋，加入樣品為 100 μL。

1.2.4.4 還原力測定

針對漏層承壓堵漏制訂現(xiàn)場方案：（1）下鉆至堵漏目的層下部（推薦不攜帶鉆頭及止回閥等鉆具）；（2）注、替堵漏漿過程中保持施工平穩(wěn)，防止堵塞鉆具水眼，使用20L·s-1排量注入配好的堵漏漿并提出鉆具水眼。注意整個過程需專人觀察返出情況，定時（不超過15min）記錄一次泥漿量變化；（3）隨后行關(guān)井、環(huán)空憋壓擠注（擠注時套壓不大于2MPa，多次憋注，檢驗地層承壓能力的同時，也在逐漸提高地層承壓能力）；（4）在泄壓時，不宜一次性卸完壓力，應(yīng)分多次逐漸泄壓，以防鉆井液返吐造成井壁人為破壞；（5）泄壓開井后靜止等停6h后進(jìn)行驗堵，下鉆時分段循環(huán)，緩慢、逐漸提高泵循環(huán)，循環(huán)2周再將排量提高至鉆進(jìn)時排量。

參照傅茂潤［15］的方法，試劑調(diào)整為 2.0 mL，加入樣品液 400 μL。

2 結(jié)果與分析

2.1 響應(yīng)面試驗結(jié)果與分析

2.1.1 響應(yīng)面分析因素水平的選取

單因素實驗結(jié)果表明，加大乙醇濃度和提取溫度有助于提高總甾醇得率，但綜合考慮成本及溶劑揮發(fā)等因素，最終選取95%乙醇和70℃。另選取轉(zhuǎn)速、液料比、剪切時間3個因素，運用Box-Benhnken中心組合實驗設(shè)計原理，進(jìn)行響應(yīng)面設(shè)計(RSA)，試驗因素與水平設(shè)計見表1。

表1 響應(yīng)面分析因素與水平Tab.1 Analytical factors and levels for RSA

2.1.2 響應(yīng)面試驗設(shè)計與結(jié)果

根據(jù)Design Expert軟件的Box-Behnken試驗設(shè)計原理，一共17個試驗點，12個析因點，自變量取值在A、B、C所構(gòu)成的三維頂點;5個零點，是區(qū)域的中心點，零點試驗重復(fù)5次，用于估計試驗誤差。響應(yīng)面試驗方案及結(jié)果見表2。

2.1.3 回歸方程的建立與顯著性分析

以麥角甾醇含量(Y)為響應(yīng)值，對表3數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸分析，得到回歸方程為:

表2 響應(yīng)面設(shè)計方案及實驗結(jié)果Tab.2 Box-Behnken design arrangement and experimental results

對方程進(jìn)行分析，結(jié)果見表3。回歸模型的F=3.83，P=0.045 3，說明模型顯著;失擬項F=2.06，P=0.248 7，說明失擬項不顯著。R2=0.8311，R2Adj=0.614 0，該回歸方程可以用來確定最佳提取工藝。方差分析結(jié)果表明，A2，B2對麥角甾醇含量影響顯著。

表3 回歸分析結(jié)果Tab.3 Results of regression analysis

圖1～圖3反映了各因素的交互作用對響應(yīng)值的影響，等高線圖中橢圓在范圍內(nèi)，響應(yīng)面呈凸面，故可以確定最佳工藝點。從響應(yīng)面圖可以看出轉(zhuǎn)速和剪切時間對麥角甾醇得率的影響差不多，但比液料比顯著。

圖1 Y=f1(A，B)等高線圖和響應(yīng)面圖Fig.1 Contour plot and response surface plot of Y=f1(A，B)

圖2 Y=f2(A，C)等高線圖和響應(yīng)面圖Fig.2 Contour plot and response surface plot of Y=f2(A，C)

圖3 Y=f3(B，C)等高線圖和響應(yīng)面圖Fig.3 Contour plot and response surface plot of Y=f3(B，C)

2.1.5 最佳工藝條件

由Design Expert軟件分析得到最優(yōu)工藝條件為轉(zhuǎn)速9 098 r/min、液料比 25∶1(mL∶g)、剪切時間 9 min，預(yù)測麥角甾醇得率為0.073 5%?？紤]到實際操作的局限性，確定最佳工藝條件為轉(zhuǎn)速8 400 r/min、液料比25∶1(mL∶g、剪切時間9 min。在此條件下進(jìn)行驗證實驗，結(jié)果麥角甾醇得率為0.072 1%。從結(jié)果可見，此回歸方程是可靠的，采用響應(yīng)面分析法優(yōu)化麥角甾醇提取工藝條件是可行的。

2.2 GC-MS分析

經(jīng)GC-MS分析，圖4中保留時間6.688、6.816、7.061、7.727、8.084 min的峰通過與數(shù)據(jù)庫匹配，結(jié)果見表4。

圖4 靈芝醇提總甾醇的總離子流圖Fig.4 Totalionchromatogramof the ethanol extracts from Ganoderma

表4 靈芝甾醇提取物中的主要成分Tab.4 The major components of sterol inGanoderma

2.3 TLC分析

圖5是在254nm下觀察的結(jié)果，從圖5上可以看出靈芝總甾醇提取物中主要含有麥角甾醇。

圖5 靈芝醇提物的TLC(左為麥角甾醇標(biāo)準(zhǔn)品，右為靈芝總甾醇醇提物)Fig.5 The TLC of ethanol extracts from Ganoderma(Left for ergosterol standard，right for the ethanol extracts from Ganoderma)

2.4 抗氧化實驗結(jié)果與分析

2.4.1 清除DPPH·的結(jié)果與分析

從圖6可見，靈芝總甾醇提取物濃度在1 000 μg/mL時，對DPPH·的清除率達(dá)95.16%稍低于Vc(96.66%)。

2.4.2 清除ABTS+·的結(jié)果與分析

圖6 靈芝總甾醇提取物對DPPH·的清除能力Fig.6 The scavenging activity of the ethanol extracts from Ganodermatotal sterol against DPPH·

從圖7可見，靈芝總甾醇提取物濃度在100 μg/mL時，對ABTS+·的清除率為29.46%高于VC對ABTS+·的清除率(21.39%);濃度在1 000 μg/mL時，對 ABTS+·的清除率達(dá) 81.33%低于 VC(94.44%)，其增長趨勢依然明顯，而VC趨緩。

圖7 靈芝總甾醇提取物對ABTS+·的清除能力Fig.7 The scavenging activity of the ethanol extracts from Ganodermatotal sterol against ABTS+·

2.4.3 清除羥自由基的實驗結(jié)果與分析

從圖8可見，靈芝總甾醇提取物濃度在200 μg/mL時，對·OH的清除率為13.83%低于VC對·OH的清除率(15.33%);濃度大于200 μg/mL時，對·OH的清除率大于VC，其增長隨著濃度的的增加而顯著增加，而VC增長緩慢。濃度在1 000 μg/mL時，靈芝總甾醇提取物對·OH的清除率達(dá)55.41%。相比較DPPH·和ABTS+·的清除率，靈芝總甾醇提取物清除·OH的能力較弱。

2.4.4 還原力實驗結(jié)果與分析

從圖9可見，靈芝總甾醇提取物濃度在500 μg/mL以下時，還原力高于VC;濃度達(dá)到500 μg/mL以上時，還原力低于VC;濃度為1 000 μg/mL時，還原力吸光度達(dá)1.746，VC還原力吸光度為2.139。

3 結(jié)論

圖8 靈芝總甾醇提取物對·OH的清除能力Fig.8 The scavenging activity of the ethanol extracts from Ganodermatotal sterol against·OH

圖9 靈芝總甾醇提取物的還原力Fig.9 The reducing power of the ethanol extracts from Ganodermatotal sterol

本研究采用閃式提取法分離靈芝中的甾醇，經(jīng)TLC和GC-MS分析都表明靈芝總甾醇提取物中含有大量麥角甾醇。通過響應(yīng)面設(shè)計優(yōu)化，確定了最佳提取工藝為:轉(zhuǎn)速8 400 r/min，液料比25 mL/g，剪切時間9 min。在此條件下麥角甾醇實際得率為0.072 1%。總甾醇提取物對DPPH·的清除率為95.16%，對ABTS+·的清除率為81.33%，對·OH的清除率為55.41%，還原力吸光度為1.746，表明其具有較強的體外抗氧化能力。相對于傳統(tǒng)的甾醇提取工藝，閃式提取技術(shù)所需提取時間更短、溫度更低，在維持天然產(chǎn)物的生物活性上更有優(yōu)勢。采用管線式高速剪切提取裝置后可以實現(xiàn)連續(xù)提取，易于工業(yè)化放大。

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