張麗平，蔣 旎，余曉琴

(1.成都紡織高等?？茖W(xué)校染化系，四川 成都 611731;2.四川省食品藥品檢驗所，四川 成都 610097)

松茸、又名松蕈，被譽為“食用菌之王”，營養(yǎng)豐富，含多種氨基酸和維生素，同時具有防輻射、降血脂、增強免疫等功效[1]。松茸具有的生理功能與其含有多種抗氧化活性物質(zhì)有一定的相關(guān)性。

目前，雖然有多種生物的、化學(xué)的鑒別天然抗氧化劑的抗氧化活性的方法，但大多數(shù)方法都是從一個角度來評價天然抗氧化物在食品和生物體體系中的多功能作用。合理有效的評價抗氧化活性的方案，需要幾種建立在不同作用機理上的方法來進(jìn)行抗氧化評價[2]。

超臨界流體萃取是一種殘留小、污染少的新型分離提取技術(shù)，被廣泛用于真菌活性成分的提取和制備[3－5]，但松茸超臨界CO2萃取還鮮有報道。本文擬采取超臨界CO2萃取技術(shù)提取松茸中的抗氧化成分，并從抗脂質(zhì)氧化和自由基清除兩方面研究該提取物的抗氧化活性，為松茸的有效利用提供技術(shù)支持。

1 實驗材料

1.1 材料

新鮮松茸，購自四川東億食品有限公司，產(chǎn)自云南省松茸野生基地，原料要求色澤純正、無損傷的新鮮樣品，除泥后待用;2，2－二苯基苦基苯肼 (DPPH)，美國Sigma－aldrich公司;蘆丁色譜純，中國生物制品檢定所;β－胡蘿卜素、亞油酸，美國NU－CHEK公司;其他試劑均為分析純。

1.2 儀器

0.5 L超臨界CO2萃取儀，四川德陽四創(chuàng)科技有限公司;UV－2000型紫外可見分光光度計，上海尤尼柯儀器有限公司;RE－2000型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海亞榮生化儀器廠;UFREEZE DRYIN G－03型凍干試驗機，廈門聯(lián)友冷凍設(shè)備有限公司;A－2004型電子分析天平，上海恒平科學(xué)儀器有限公司。

2 實驗方法

2.1 原料預(yù)處理

新鮮松茸經(jīng)冷凍干燥后粉碎過篩放置于干燥器中待用[6]。

2.2 松茸超臨界CO2萃取物的制備

準(zhǔn)確稱取松茸粉末250 g，裝入0.5 L萃取釜中。對萃取釜、分離釜分別進(jìn)行加熱，升到所需溫度后，泵進(jìn)CO2氣體，當(dāng)萃取釜壓力升高到一定壓力后，調(diào)節(jié)進(jìn)氣量，保持恒溫恒壓進(jìn)行循環(huán)萃取，每隔15 min從分離釜進(jìn)行取料，總萃取時間1.5 h，超臨界狀態(tài)下的CO2流量為15 L·h－1。以乙醇作為夾帶劑，夾帶劑用量2.0 mL·g－1樣品，壓力30 MPa，溫度65℃。收集超臨界流體萃取物，用真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀進(jìn)行濃縮。濃縮物用氮氣吹掃，除去殘留的乙醇。濃縮后的樣品置4℃下冷藏備用[3]。

2.3 松茸萃取物抗脂質(zhì)氧化能力

將2.4 mL含有2.6 mmol·L－1亞油酸的β－胡蘿卜素乳化溶液加入到比色管中，于37℃下恒溫放置，同時做不含亞油酸的空白對照管和加入標(biāo)準(zhǔn)BHT(0.01 mg·mL－1)管。20 min后，待比色皿中的溶液熱平衡后，加入0.5 mol·L－1偶氮二異丁基脒二鹽酸鹽進(jìn)行油脂的自動氧化，15 min后加入不同體積 (0.5 μL單位體積)的松茸超臨界CO2萃取濃縮物，并于470 nm下進(jìn)行比色，通過吸光度的變化來反映萃取物的濃度－反應(yīng)關(guān)系[7，8]。

2.4 松茸萃取物對DPPH自由基的清除能力

將精確配制好的5 mmol·L－1的DPPH溶液1 mL，加入到3 mL 不同濃度 (50 μg·mL－1、100 μg·mL－1、200 μg·mL－1、500 μg·mL－1、1 000 μg·mL－1)的松茸提取物溶液中，混合好后，于室溫下放置30 min后，測定517 nm下吸光度的值，DPPH自由基清除率 (P)公式為[9－11]:

式中:A空白為未加多糖溶液的空白試驗 (以蒸餾水代替)的吸光度;A樣品為不同濃度反應(yīng)液的吸光度。

同時測定Vc和蘆丁水溶液的DPPH自由基清除率。

3 結(jié)果與分析

3.1 抗脂質(zhì)氧化能力

β－胡蘿卜素亞油酸體系在偶氮二異丁基脒二鹽酸鹽的作用下發(fā)生自動氧化，β－胡蘿卜素氧化后會逐漸褪色，褪色的程度反應(yīng)氧化的程度，吸光度會越來越小。添加抗氧化物質(zhì)后會延緩氧化的進(jìn)行，抗氧化能力越強，吸光度下降越慢，與標(biāo)準(zhǔn)的BHT溶液比較可計算出抗氧化能力的BHT當(dāng)量，結(jié)果見圖1。

由圖1可以看出，添加松茸萃取物最初幾分鐘內(nèi)，油脂的氧化抑制并沒有表現(xiàn)出來，隨著松茸萃取物的消耗，抗氧化活性開始表現(xiàn)出來，空白組沒有表現(xiàn)出氧化抑制的現(xiàn)象。

通過實驗測定，發(fā)現(xiàn)每克松茸樣品中所含有的抗氧化活性物質(zhì)相當(dāng)于4 mg的BHT，說明松茸萃取物具有優(yōu)良的抗脂質(zhì)氧化能力。

3.2 DPPH自由基清除能力

DPPH自由基清除能力見圖2。

圖2結(jié)果表明，Vc對DPPH自由基的清除作用最強，200 μg·mL－1的Vc清除率即可達(dá)到90%以上。在實驗質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，松茸萃取物對DPPH自由基的清除率隨其質(zhì)量濃度的增加而提高，在0.1 mg·mL－1～1 mg·mL－1范圍內(nèi)清除率呈現(xiàn)平穩(wěn)提升的趨勢，最高可達(dá)73%。質(zhì)量濃度在0.2 mg·mL－1～1 mg·mL－1范圍內(nèi)，松茸萃取物的DPPH自由基清除率高于蘆丁對照品。說明松茸的超臨界CO2萃取物有明顯的清除自由基的能力。

4 討論

天然抗氧化物在食品和生物體體系中的作用是多方面的，可能是通過抑制脂肪氧化來起作用，也可能是通過自由基猝滅來達(dá)到抗氧化的效果。本次實驗顯示松茸超臨界CO2萃取物具有較強的清除DPPH自由基的能力，最高可達(dá)73%的清除率，同時可以有效抑制亞油酸的自動氧化。表明松茸的超臨界CO2萃取物具有一定的體外抗氧化作用，這可以為松茸保健品的開發(fā)提供一定的科學(xué)依據(jù)和參考。

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