王曉鋒， 季孔庶， 何衛(wèi)龍

(1.南京林業(yè)大學， 江蘇 南京 210037； 2.湖南省林業(yè)科學院， 湖南 長沙 410004)

基于松屬不同樹種EST序列的馬尾松SSR引物開發(fā)

王曉鋒1,2， 季孔庶1， 何衛(wèi)龍1

(1.南京林業(yè)大學， 江蘇 南京 210037； 2.湖南省林業(yè)科學院， 湖南 長沙 410004)

利用松屬5個樹種的EST序列，分別樹種查找SSR位點，采用Primer3.0軟件進行引物設計。設計的5個樹種的EST-SSR引物中：所占比例最高的均為三核苷酸重復，其次是六核苷酸重復，兩者之和都達到了64%以上；四核苷酸重復所占比例均為最低。從設計的引物中分別不同樹種各選取20對進行引物合成和通用性檢測以及馬尾松群體檢測，結果表明：松屬5個樹種的EST序列開發(fā)的馬尾松SSR引物，其在馬尾松中的擴增成功率為60%～80%；最高的是輻射松，最低的是海岸松，平均為72%。通用性最好的為輻射松，屬內的通用性為94%；屬間和科間通用性也分別達到75%和44%。不同樹種序列來源的EST-SSR引物，其擴增成功率在10%～30%；最高的是北美短葉松，其次是輻射松，最低的是扭葉松和火炬松；平均為17%。

松屬； 馬尾松； EST； SSR

馬尾松(PinusmassonianaLamb.)是松科(Pinaceae)松屬(Pinus)的多年生常綠樹種，也是我國南方荒山綠化和工業(yè)用材的重要樹種。分子標記輔助育種是解決馬尾松育種中一些技術難題的重要途徑，可以顯著縮短育種周期[1]。SSR標記具有多態(tài)性高、重復性好、共顯性遺傳等特點，已成為一種人們推崇的分子標記方法。馬尾松SSR引物開發(fā)已有報道，如李炟[2]采用磁珠富集法開發(fā)了17對有多態(tài)性的SSR引物。但這種基因組來源的SSR引物開發(fā)費時費力，成本高，難以滿足馬尾松分子標記及相關研究的需求，因此，尋求更好的方法極有必要。近年來，隨著網上公共數據庫中EST序列的快速增長，為SSR引物開發(fā)提供了豐富的資源。EST-SSR具有SSR標記的特點，如共顯性遺傳、重復性好、多態(tài)性豐富等，同時，還具有其自身的特性： ①屬功能性分子標記，來自表達的基因，可能與控制某一性狀的基因相關。 ②通用性好。其兩端的序列保守性高，在不同物種之間具有較高的通用性。在親緣物種之間矯正基因組連鎖圖譜和比較作圖方面有很高的利用價值[3]。 ③開發(fā)過程簡單、快速、成本低。目前許多樹種如楊樹[4]、桉樹[5]、鵝掌楸[6]、松樹[7-9]等已開發(fā)出了EST-SSR引物，并應用于遺傳作圖、遺傳多樣性分析、分子系統(tǒng)進化等研究[10-12]。松樹是林木中為數不多的EST序列十分豐富的樹種。劉公秉[7]利用松屬EST序列開發(fā)了39對馬尾松SSR引物。閻毛毛[9]利用松屬1萬條EST序列開發(fā)了12對在馬尾松和黃山松上表現多態(tài)性的SSR引物。我們利用松屬5個樹種的EST序列分別開發(fā)馬尾松的SSR引物，并檢測其在松屬內、屬間和科間的通用性，以比較不同樹種來源的EST序列開發(fā)得到的SSR引物對馬尾松的成功擴增率和在其他樹種上的通用性之間的差異，為以后松屬或近緣樹種通用性引物的開發(fā)、比較基因組研究提供重要的信息。

1 材料與方法

1.1材料

馬尾松球果采自福建省龍巖市上杭縣白沙林場的馬尾松實生種子園。同時，還選用了本試驗室收集的松屬中扭葉松、濕地松、樟子松、高山松以及落葉松屬的落葉松和杉科的杉木、柳杉種子。

將種子置于人工氣候箱里發(fā)芽。氣候箱條件設為

16h光照，溫度為22℃。培養(yǎng)2周左右，取幼苗作為初篩材料。進行引物群體檢測的胚乳材料取自馬尾松實生種子園的1個家系種子。將種子置于人工氣候箱培養(yǎng)4～5d，待其萌動時，剝去種皮和胚，挑取胚乳，放入2mL離心管中備用。

1.2基因組DNA提取

基因組DNA的提取采用改進的CTAB-SDS法[13]。

1.3序列搜索及SSR位點查找

登陸NCBI的dbEST數據庫(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/dbEST/index. html)，以Pinus為關鍵詞搜索EST序列。選擇其中植物EST序列，分別不同樹種(火炬松、扭葉松、北美短葉松、海岸松、輻射松)下載。獲得松屬EST序列454455條，其中火炬松328662條、扭葉松40483條、北美短葉松36379條、海岸松34061條、輻射松8717條(截止2011年4月)。

SSR位點查找采用MISA程序(http://www. pgrc.ipk-gatersleben.de/misa)，設定MISA配置文件(misa.ini)中SSR查找參數。查找參數分別為二核苷酸重復不少于9次，三核苷酸重復不少于6次，四核苷酸重復不少于5次，五核苷酸重復和六核苷酸重復不少于4次。

1.4SSR引物設計及合成

SSR引物設計采用Primer3.0程序(http://frodo.wi.mit.edu/primer3)。引物設計原則為：引物長度18～24bp；Tm值為50～60℃，上下游引物的Tm值相差不大于5℃；GC含量40%～60%，最適為50%；PCR擴增產物大小100～300bp；SSR位點的開始和結束位置距離5’和3’端均不少于30bp；引物采用位于SSR上游和下游各150個堿基范圍內的序列；避免引物二級結構以及6個連續(xù)堿基配對的出現。設計完成后，送往上海捷瑞生物工程有限公司合成。

1.5SSR-PCR擴增反應

1.5.1 SSR-PCR擴增反應體系 馬尾松SSR引物PCR擴增反應體系見表1。

表1 SSR-PCR擴增反應體系Tab1 ConentsofSSR?PCRamplification反應成分體積最終濃度模板DNA1μLstock20ng10×PCRBuffer(Mg2+free)1μLof10×stock1×PCRBufferMg2+08μLof25mMstock2mMdNTP12μLof25mM03mMTaqDNA聚合酶016μL5units/μLstock08units上游引物015μLof10μMstock015μM下游引物015μLof10μMstock015μMddH2O63μL

1.5.2 SSR-PCR擴增反應程序 馬尾松SSR引物PCR擴增反應程序見表2。

1.6引物的篩選及通用性檢測

將擴增產物用8%的聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測，挑選出有擴增條帶的引物。對挑選出的引物，采用松屬5個種、落葉松屬1個種、杉科2個種進行通用性檢測。

表2 SSR—PCR擴增反應程序Tab2 ProcedureofSSR?PCRamplification反應程序循環(huán)次數溫度(℃)時間預變性1cyc944min9430sec梯度降溫擴增20cyc60(-05℃/cyc)30sec7230sec9430sec一般性擴增20cyc5030sec7230sec延伸1cyc7210min保存4forever

1.7引物群體篩選

隨機選取馬尾松1個家系的8粒種子的胚乳，對有擴增條帶的引物進行群體篩選，采用8%聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測PCR產物。

2 結果與分析

2.1SSR引物設計及特征分布

采用當前常用的Primer 3.0軟件分別對松屬5個樹種中檢索到的EST-SSR進行引物設計，然后按照不同重復基元長度加以統(tǒng)計，結果見表3。

表3中數據顯示：設計的100對北美短葉松引物中，三核苷酸重復所占比例最高，為68%；其次是六核苷酸重復，為17%；三核苷酸重復和六核苷酸重復共占85%；四核苷酸重復和五核苷酸重復較少，分別為5%和3%。設計的20對輻射松引物中，三核苷酸重復所占比例最高，為40%；六核苷酸重復僅次于三核苷酸重復，為35%；三核苷酸重復和六核苷酸重復之和為75%；所占比例最低的為四核苷酸和五核苷酸重復，均為0。設計的116對海岸松引物中，三核苷酸重復所占比例最高，為37.07%；其次是六核苷酸重復，為29.31%；三核苷酸重復和六核苷酸重復之和為66.38%；最少的為四核苷酸重復，僅為5.17%。扭葉松也有類似的規(guī)律，在設計的85對引物中，所占比例最高的為三核苷酸重復，達到54.12%；其次是六核苷酸重復，為25.88%；三核苷酸重復和六核苷酸重復共占到80%；比例最低的為四核苷酸重復，為2.35%?；鹁嫠稍O計出1142對引物，其中三核苷酸重復所占比例最高，為42.12%；其次是六核苷酸重復，為22.59%；三核苷酸重復和六核苷酸重復之和為64.71%；四核苷酸重復比例最低，僅為1.75%。

以上結果表明：設計的松屬5個樹種的引物中，所占比例最高的均為三核苷酸重復，其次是六核苷酸重復，兩者之和都達到64%以上；而四核苷酸重復所占比例均為最低。研究發(fā)現，SSR重復基元的長度與其多態(tài)性有關。由短重復基元組成的SSR獲得(或失去)重復基元的速率要比長重復基元組成的SSR快，將具有更高的多態(tài)性[5]。

表3 松屬不同樹種EST—SSR引物設計及特征分布Tab3 DesigningtheEST?SSRprimersofPinusspeciesandanalyzingthedistributionofthem重復基元長度北美短葉松輻射松海岸松扭葉松火炬松引物數(對)百分比(%)引物數(對)百分比(%)引物數(對)百分比(%)引物數(對)百分比(%)引物數(對)百分比(%)二核苷酸77005250024206944712051795三核苷酸686800840004337074654124824221四核苷酸550000006517223520175五核苷酸3300000097761112941771550六核苷酸171700735003429312225882582259總計10010020100116100851001142100

2.2引物篩選及通用性檢測

分別不同樹種對設計的SSR引物各選取20對(共計100對)進行合成，并進行引物篩選及通用性檢測。結果見表4。

表4 SSR引物篩選及通用性檢測Tab4 ScreeningtheSSRprimersanddetectingthetransferabilityofthem樹種引物對數擴增數(對)百分比(%)屬內通用性屬間通用性科間通用性通用數(對)百分比(%)通用數(對)百分率(%)通用數(對)百分比(%)北美短葉松20147014100750536輻射松20168015941275744海岸松2012601192542325扭葉松2015751387853213火炬松201575128053317平均值2014472139074513625

引物初篩采用馬尾松1個家系種子培養(yǎng)的幼苗提取DNA進行檢測。表4中數據顯示，設計的各樹種的20對SSR引物中，北美短葉松的14對可以在馬尾松中成功擴增，擴增率為70%；輻射松的20對引物中有16對成功擴增，擴增率達到80%；海岸松、扭葉松、火炬松的擴增率分別為60%、75%、75%。SSR引物擴增成功率最高的為輻射松，其次是扭葉松、火炬松，最低的為海岸松。松屬5個樹種開發(fā)的馬尾松SSR引物擴增成功率平均為72%，說明用松屬EST序列開發(fā)馬尾松SSR引物的效率很高。這一結果與閻毛毛[9]所報道的72.4%基本一致。

利用松屬5個種、屬間的落葉松屬1個種、科間的杉科2個種，檢測成功擴增的SSR引物的通用性。結果顯示：松屬5個樹種開發(fā)的馬尾松SSR引物在屬內的通用性為80%～100%，平均達90%，說明初篩出的馬尾松SSR引物具有很高的屬內通用性；屬間通用性為42%～75%，平均為51%，說明篩選出的馬尾松SSR引物也具有較高的屬間通用性；科間通用性為7%～44%，最高的為輻射松，達到44%；其次是北美短葉松，也達36%；平均為25%。以上結果表明，從松屬EST序列開發(fā)的馬尾松SSR引物具有很好的通用性，尤其是從輻射松的序列開發(fā)的SSR引物，屬內的通用性為94%，屬間和科間的也分別達到75%和44%；從北美短葉松的序列開發(fā)的SSR引物，屬內通用性達到100%，屬間和科間的分別為50%和36%；通用性最差的是火炬松序列開發(fā)的引物。SSR引物通用性可以反映不同樹種之間基因組的差別及親緣關系，在開發(fā)引物時選擇與開發(fā)樹種基因組接近、親緣關系近的植物的EST序列，可提高其效率。

2.3引物群體篩選

利用初篩出來的引物，隨機選取馬尾松1個家系的8粒種子的胚乳進行群體檢測，篩選出擴增條帶清晰的引物。馬尾松胚乳為單倍體，在每1個位點擴增出來的等位基因與該位點是一一對應的，方便了后期遺傳圖譜構建中擴增條帶的判讀。篩選結果見表5。

表5 SSR引物群體篩選Tab5 ScreeningtheSSRprimerswithgroup樹種引物對數擴增數(對)群體擴增數(對)百分比(%)北美短葉松2014630輻射松2016420海岸松2012315扭葉松2015210火炬松2015210平均值20144317

表5結果顯示：利用松屬5個樹種的EST序列開發(fā)的馬尾松SSR引物的群體擴增比率平均為17%，合成的各樹種的20對引物中，北美短葉松的有6對具有清晰的群體擴增帶型，比率最高，達到30%；其次是輻射松，擴增條帶好的有4對引物，比率為20%；比率最低的為扭葉松和火炬松，僅有2對，比率僅為10%。這一結果低于其他樹種的有關報道，如胥猛[6]報道的鵝掌楸EST-SSR的多態(tài)性比率為37.5%，但是高于貫春雨[8]的落葉松EST-SSR的多態(tài)性比率(僅為4.8%)；也高于閻毛毛[9]的松屬的結果。該結果與劉公秉[8]研究的馬尾松的結果(其群體擴增率為28.9%)基本相似。以上結果表明，利用松屬不同樹種EST序列開發(fā)馬尾松SSR引物的群體擴增比率是有差別的。

3 結論與討論

通過松屬5個樹種的EST序列開發(fā)馬尾松SSR引物，其擴增成功率平均為72%。經通用性檢測發(fā)現，這些引物在松屬內具有很高的通用性，平均達到90%；在屬間和科間也具有較高的通用性，分別為51%和25%。不同樹種的引物，在馬尾松中的擴增成功率不同，最高的為輻射松，達到了80%；其次是扭葉松和火炬松，均為75%；最低的為海岸松，為60%。群體擴增成功率最高的是北美短葉松，達到30%；其次是輻射松，為20%；最低的是扭葉松和火炬松，僅為10%。松屬內通用性最高的是北美短葉松，達到了100%；其次是輻射松，為94%；最低的是火炬松，為80%。屬間和科間通用性最高的均為輻射松，分別為75%和44%；最低的均為火炬松，分別為33%和7%。閻毛毛[9]是利用松屬樹種混合的EST序列開發(fā)馬尾松和黃山松SSR引物，其中90%具有屬內通用性，與本研究的結論一致；30%具有屬間通用性，比本研究的結果明顯低，說明序列來源不同，開發(fā)出來的EST-SSR引物的通用性也不同。對比其他樹種，胥猛[6]從鵝掌楸EST序列中開發(fā)的SSR引物，有85%在中國馬褂木中有擴增(為屬內的通用性)，比松屬的略低，54%在白玉蘭中有擴增(為屬間的通用性)，比松屬的略高。這對人們開發(fā)馬尾松EST-SSR引物以及松屬通用性引物具有一定的借鑒。同時，也為松屬不同樹種比較基因組的研究提供了重要信息。

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(文字編校：唐效蓉)

DevelopmentoftheSSRprimersforPinusmassonianabasedontheESTsequencesfromPinusspecies

WANG Xiaofeng1,2， JI Kongshu1，HE Weilong1

(1.Nanjing Forestry University, Nanjing 210037, China;2.Hunan Academy of Forestry, Changsha 410004, China)

The EST sequences from 5 species (P.banksiana,P.radiata,P.pinaster,P.contortaandP.taeda) ofPinuswere analyzed and the SSR locus were found respectively, and the primers of the SSR found above were designed using Primer 3.0 software. The types of EST-SSR primers designed from the 5 species ofPinuswere compared and it showed that trinucleotide repeat had the highest proportion in all species, followed by hexanucleotide repeat, and the sum of them reached to 64%, the lowest was tetranucleotide repeat. 20 pairs of SSR primers of each species were selected to detect the transferability and the rate of success amplification inP.massoniana. The results showed that the rate of success amplification was 60%～80% for primers designed from the 5 species ofPinus, the highest rate of success amplification wasP.radiata, the lowest wasP.pinaster, and the average rate was 72%. The best transferability inPinuswasP.radiata, with the transferability of 94%, and the transferability in intergeneric and interfamilial were 75% and 44% respectively. The EST-SSR primers designed by sequences from different species were tested inP.massonianagroups, it showed that the amplification rate was 10%～30%, the highest wasP.banksiana, followed byP.radiata, the lowest wereP.contortaandP.taeda, and the average rate was 17%.

Pinus;Pinusmassoniana; EST; SSR

2012-12-20

2013-01-20

林業(yè)公益性行業(yè)科研專項經費資助(201104010)；國家“十二五”科技支撐項目(2012BAD01B02)和江蘇高校優(yōu)勢學科建設工程項目資助。

王曉峰(1986-)，男，河南省鞏義市人，碩士，主要從事林木遺傳育種研究工作。

S 791.248

A

1003-5710(2013)01-0014-04

10. 3969/j. issn. 1003-5710. 2013. 01. 004