吳二兵， 陳 鑫， 張?jiān)拢?施建生， 高志偉

氧化應(yīng)激在PD的發(fā)病機(jī)制中占有十分重要的地位，很多環(huán)節(jié)最后都通過氧化應(yīng)激這一共同通路起作用，因此，針對(duì)PD抗氧化治療的研究越來越多［1，2］。本研究探討依達(dá)拉奉對(duì)6-羥基多巴(6-OHDA)誘導(dǎo)的帕金森病大鼠模型黑質(zhì)紋狀體系統(tǒng)丙二醛(MDA)、一氧化氮(NO)含量的影響和神經(jīng)元保護(hù)作用。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 成年健康雄性SD大鼠，體重250～300g，由南通大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。標(biāo)準(zhǔn)環(huán)境飼養(yǎng)。

1.2 主要試劑和藥品 6-OHDA、抗壞血酸、阿樸嗎啡(apomophine，APO)、抗TH抗體、戊巴比妥鈉、DAB(Sigma公司，美國(guó))，SABC試劑盒(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)，依達(dá)拉奉(Edaravone，ED，必存)(南京先聲東元制藥有限公司)，MDA試劑盒(南京建成科技有限公司)NO試劑盒(南京建成科技有限公司)。

1.3 主要儀器 MICRO4型動(dòng)物腦立體定位儀(WPI公司，美國(guó))，5μl微量進(jìn)樣器(上海光正醫(yī)療儀器有限公司)，EL303電子天平(梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司)，CM1900冰凍切片機(jī)(LAICA，德國(guó))，BX50WI倒置顯微鏡(Olympus公司，日本)。

1.4 動(dòng)物分組 將實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分為神經(jīng)生化學(xué)和組織學(xué)兩組，各組分為:(1)正常對(duì)照組(n=6);(2)NS對(duì)照組(n=6);(3)依達(dá)拉奉組(n=24)，依達(dá)拉奉又分為0.3mg/kg 14d 組(n=6)，1mg/kg 14d 組(n=6)，3mg/kg 14d組(n=6)及3mg/kg 28d組(n=6)4個(gè)亞組。

1.5 模型的制備 模型組大鼠用復(fù)合麻醉劑(0.25ml/100g體重)腹腔注射麻醉，待大鼠后肢回縮反射及角膜反射消失后，將其頭部水平位固定在腦立體定位儀上(美國(guó)WPI公司)，剪除顱頂鼠毛，碘酒、酒精消毒皮膚，沿中線切開一長(zhǎng)約2cm切口，充分暴露前囟，參照Paxinos and Watson(1996)《大鼠腦立體定位圖譜》確定左側(cè)前腦內(nèi)側(cè)束(MFB)三維坐標(biāo)位置，選取mfb區(qū)坐標(biāo):前囟后2.8mm，中線左側(cè)2.0mm，硬膜下8.2mm。根據(jù)注射位點(diǎn)確定鉆顱部位，手術(shù)刀尖小心鉆開一直徑約2mm顱骨孔，微量進(jìn)樣器緩慢進(jìn)針至靶點(diǎn)，留針10min，以9ng/s的速度注入2μg/μl 6-OHDA 4μl(含0.02%抗壞血酸)，注射完畢后留針 10min，以1mm/min的速度退針。手術(shù)完畢，用明膠海綿堵塞顱骨孔，適量青霉素涂敷創(chuàng)口，消毒縫合皮膚，放回籠中飼養(yǎng)。并于2w、4w后分別檢測(cè)大鼠行為學(xué)和組織學(xué)的改變。假手術(shù)組同法予含0.02%抗壞血酸的生理鹽水4μl，正常組不作任何處理。正常對(duì)照組不進(jìn)行任何處理，其余5組均在大鼠MFB注射6-OHDA，方法同第一部分，術(shù)后30min即分別腹腔注射NS 1ml、依達(dá)拉奉0.3mg/kg、1mg/kg、3mg/kg，每天兩次，連續(xù)應(yīng)用 14d，其中3mg/kg 28d組大鼠在最末一次用藥后繼續(xù)飼養(yǎng)至術(shù)后28d。

1.6 旋轉(zhuǎn)試驗(yàn) 實(shí)驗(yàn)大鼠在最后一次用藥后，腹腔注射AP0誘發(fā)旋轉(zhuǎn)行為。APO誘導(dǎo)旋轉(zhuǎn)試驗(yàn):模型組分別于術(shù)后2w、4w于動(dòng)物腹腔內(nèi)注射APO 0.5mg/kg誘發(fā)大鼠以健側(cè)后肢為支點(diǎn)，向右側(cè)(健側(cè))旋轉(zhuǎn)，于APO注射后5min開始記錄，共記錄30min。以2w、4w誘發(fā)旋轉(zhuǎn)次數(shù)大于210次/30min為合格模型。

1.7 組織學(xué)方法 各組大鼠在行為學(xué)檢測(cè)后，用復(fù)合麻醉劑將大鼠深度麻醉，快速灌注生理鹽水(37℃)150～200ml沖洗。隨即灌注4%甲醛(4℃)先快速灌注200ml，再緩慢灌注300ml。然后斷頭取腦，置于4%甲醛，放4℃冰箱固定4h，再依次置入20%及30%蔗糖磷酸鹽緩沖液內(nèi)4℃冰箱至腦塊沉入瓶底。取紋狀體及中腦組織塊進(jìn)行冠狀連續(xù)冰凍切片，片厚20μm。切片作尼氏體染色;高倍鏡下計(jì)數(shù)各組標(biāo)本兩側(cè)黑質(zhì)致密部(SNc)的尼氏體陽性細(xì)胞數(shù)，取每組黑質(zhì)區(qū)的冠狀切片各10張，每張切片連續(xù)計(jì)數(shù)3個(gè)互不重疊高倍視野內(nèi)陽性細(xì)胞數(shù)，求其平均值。

1.8 神經(jīng)生化學(xué)檢測(cè) 實(shí)驗(yàn)大鼠在最后一次用藥后次日，快速斷頭，迅速取出大腦，在冰臺(tái)上分離出紋狀體和中腦黑質(zhì)，用4℃生理鹽水沖洗除去血液，在干冰上用濾紙拭干，立即置于-80℃超低溫冰箱。待樣本收齊后，稱重并用眼科小剪剪碎組織塊，置于冰浴的玻璃勻漿器中充分勻漿，按照試劑盒操作要求，用酶標(biāo)儀檢測(cè)各組大鼠兩側(cè)紋狀體和黑質(zhì)部MDA、NO活性的變化。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 數(shù)據(jù)資料表達(dá)采用χ±s表示。用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件處理，兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，多組間比較采用方差分析，P＜0.05表示差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 依達(dá)拉奉對(duì)大鼠旋轉(zhuǎn)行為的影響 除空白對(duì)照組APO未誘發(fā)出旋轉(zhuǎn)外，其余各組均出現(xiàn)向健側(cè)旋轉(zhuǎn)(＞210次/min)，統(tǒng)計(jì)學(xué)差異顯著(P＜0.01);ED 3mg/kg 14d、28d 組較 NS、ED 0.3mg/kg 和 ED 1mg/kg組旋轉(zhuǎn)次數(shù)減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);ED 3mg/kg組大鼠14d后出現(xiàn)隨意爬行行為，NS、ED 0.3mg/kg和ED 1mg/kg組無此行為改變(見表1)。

2.2 依達(dá)拉奉對(duì)大鼠黑質(zhì)內(nèi)尼氏體細(xì)胞數(shù)的影響 高倍鏡下可見NS和ED組大鼠左側(cè)Cpu(尾狀核)和SNc(黑質(zhì)紋狀體致密部)神經(jīng)細(xì)胞均有不同程度的損傷，NS和ED組左側(cè)SNc尼氏體陽性細(xì)胞較對(duì)照組減少(P＜0.05)，NS和ED組左側(cè)SNc尼氏體陽性細(xì)胞比右側(cè)減少(P＜0.05);ED 3mg/kg 14d、28d組左側(cè) SNc尼氏體陽性細(xì)胞較 NS、ED 0.3mg/kg和ED1mg/kg組增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0.05)，14d、28d兩組間結(jié)果無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(見表2、圖1)。

2.3 依達(dá)拉奉對(duì)NO含量的影響 ED3mg/kg組黑質(zhì)紋狀體NO含量較NS、ED0.3mg/kg和ED1mg/kg組減少(P＜0.05)，ED3mg/kg 14d組與28d組間比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(見表3)。

2.4 依達(dá)拉奉對(duì)MDA含量的影響 ED 3mg/kg組黑質(zhì)紋狀體MDA含量較NS、ED 0.3mg/kg和ED 1mg/kg組減少(P ＜0.05)，ED 3mg/kg 14d組與28d組間比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(見表4)。

表1 依達(dá)拉奉對(duì)大鼠旋轉(zhuǎn)行為的影響(次/30min)(χ±s)

表2 依達(dá)拉奉對(duì)大鼠黑質(zhì)內(nèi)尼氏體細(xì)胞數(shù)的影響(個(gè)/高倍視野)(χ±s)

表3 依達(dá)拉奉對(duì)大鼠左側(cè)黑質(zhì)紋狀體NO含量的影響(μmol/gprot)(χ±s)

表4 依達(dá)拉奉對(duì)大鼠左側(cè)黑質(zhì)紋狀體MDA含量的影響(nmol/mgprot)(χ±s)

3 討論

氧化應(yīng)激是由于過多的氧自由基和過氧化合物超過了機(jī)體自身的抗氧化能力，引起細(xì)胞膜脂質(zhì)過氧化鏈?zhǔn)椒磻?yīng)和膜的流動(dòng)性改變而破壞細(xì)胞的過程。任何進(jìn)行需氧代謝的細(xì)胞都處于氧化應(yīng)激狀態(tài)中，隨著機(jī)體的老齡化，抗氧化能力不斷下降，最終導(dǎo)致機(jī)體重要結(jié)構(gòu)和功能分子的氧化損傷。多巴胺(DA)神經(jīng)元胞質(zhì)內(nèi)的DA可被單胺氧化酶B(MAO-B)所降解，生成H2O2、醌、半醌和氨，在正常黑質(zhì)高水平鐵存在的條件下，H2O2通過Fenton反應(yīng)產(chǎn)生毒性更強(qiáng)的羥自由基，影響多種細(xì)胞內(nèi)成分(如酶、轉(zhuǎn)運(yùn)體、蛋白、脂肪酸及DNA等)的功能，攻擊生物膜中的不飽和脂肪酸，引起脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，從而導(dǎo)致細(xì)胞器裂解、DA神經(jīng)元死亡。DA自氧化產(chǎn)生的高活性分子，作用于細(xì)胞成分后被吸收或形成更多的ROS，形成惡性循環(huán)。

應(yīng)用左旋多巴仍是治療PD最重要的方法之一，但其僅僅是對(duì)癥治療，不能從根本上防治PD及延緩病情的進(jìn)展，長(zhǎng)期用藥后療效減退，可出現(xiàn)運(yùn)動(dòng)波動(dòng)、異動(dòng)癥和精神癥狀。因此，新的治療策略提出神經(jīng)保護(hù)治療，以減緩甚至阻止神經(jīng)元變性的進(jìn)展。依達(dá)拉奉的主要成分為3-甲基-1-苯基-2-吡唑啉-5-酮，通過轉(zhuǎn)移一個(gè)電子給自由基而產(chǎn)生MCI-186基團(tuán)從而打斷脂質(zhì)過氧化反應(yīng)鏈來保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞;也能防止由花生四烯酸的代謝中間體脂質(zhì)過氧化物15-HPETE引起的氧化性細(xì)胞損害，抑制神經(jīng)元死亡;還能防止血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷，保護(hù)線粒體功能，發(fā)揮有益的抗自由基損傷作用［3］。依達(dá)拉奉具有親脂基團(tuán)，其血腦屏障穿透率約為60%，靜脈給藥之后可以清除大腦內(nèi)的具有高度細(xì)胞毒性的羥自由基，抑制腦細(xì)胞血管內(nèi)皮細(xì)胞和神經(jīng)細(xì)胞的過氧化作用，減少缺血半暗帶發(fā)展成梗死的體積，延遲神經(jīng)細(xì)胞死亡，減輕腦缺血以及腦缺血引起的腦水腫和組織損傷。

吳冠會(huì)等［4］用γ放射性計(jì)數(shù)儀測(cè)定6-OHDA誘導(dǎo)的PD大鼠雙側(cè)紋狀體、大腦皮質(zhì)、小腦多巴胺轉(zhuǎn)運(yùn)體(dopamine transporter，DAT)的含量，結(jié)果顯示，大劑量依達(dá)拉奉腹腔注射能阻止損傷側(cè)的DAT放射性計(jì)數(shù)的減少，與對(duì)照組相比差異有顯著性(P＜0.05)，提示依達(dá)拉奉能增強(qiáng)組織的抗氧化能力。

本研究除空白對(duì)照組APO未誘發(fā)出旋轉(zhuǎn)外，其余各組均出現(xiàn)向健側(cè)旋轉(zhuǎn)(＞210次/min)，統(tǒng)計(jì)學(xué)差異顯著(P ＜0.01);ED 3mg/kg 14d、28d 組較 NS、ED0.3mg/kg和ED1mg/kg組旋轉(zhuǎn)次數(shù)減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。依達(dá)拉奉(3mg/kg)能夠減少APO誘發(fā)的旋轉(zhuǎn)次數(shù)，且對(duì)大鼠自發(fā)的行為變化也有改善作用。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，3mg/kg組大鼠在治療14d時(shí)雖然動(dòng)作緩慢，但能隨意爬行，其他治療組大鼠無此改變，仍向損傷側(cè)自發(fā)緩慢旋轉(zhuǎn)或少動(dòng)，對(duì)此目前國(guó)內(nèi)外尚未見報(bào)道。這一結(jié)果可能與依達(dá)拉奉阻止了自由基對(duì)DA神經(jīng)元的損傷，減少DA的丟失，從而延緩或阻止病情的進(jìn)一步發(fā)展，提示依達(dá)拉奉可改善6-OHDA誘導(dǎo)的PD大鼠行為學(xué)變化。

一氧化氮(NO)是一種重要的生物信使分子，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)中參與調(diào)節(jié)一系列生理過程，如神經(jīng)突觸的發(fā)生以及腦血流量的調(diào)節(jié)等。但過量的NO則表現(xiàn)出神經(jīng)毒性作用，介導(dǎo)神經(jīng)變性的病理過程。

(iNOS)［5］編碼 NOS 的基因(NOS1，NOS2A，and NOS3)可能會(huì)引起NO過剩，從而促成PD的神經(jīng)元變性發(fā)生。Carbone 等［6］研究發(fā)現(xiàn)，低濃度的1-甲基-4-苯基-1，2，3，6-四氫吡啶(MPTP)、腫瘤壞死因子(TNF-α)和干擾素(INF-γ)能激活初原星型膠質(zhì)細(xì)胞，選擇性誘導(dǎo)NOS1 mRNA及其蛋白，增加NO的生成，并顯著提高球蛋白的硝基化。Hancok等［7］研究認(rèn)為，NOS1和NOS2A可作為PD的基因危險(xiǎn)因子，并可與已知的環(huán)境因子相互作用而調(diào)制環(huán)境效應(yīng)。MPTP可使酪氨酸羥化酶硝基化而失活，導(dǎo)致神經(jīng)元中DA水平下降。研究發(fā)現(xiàn)［8］，與野生鼠相比，nNOS基因敲除的小鼠對(duì)MPTP的毒性有抵抗力，提示NO可能使DA能神經(jīng)元易損性增加。NO主要通過過氧化亞硝基陰離子(ONOO-)發(fā)揮神經(jīng)毒性作用，NO與超氧陰離子(O2

圖1 依達(dá)拉奉對(duì)各組大鼠左側(cè)黑質(zhì)NISSL小體的影響(×400)

-)相互作用形成ONOO-，后者是一種極其活躍的強(qiáng)氧化劑，它不僅自身有細(xì)胞損傷作用，還可與H+形成ONOOH，并迅速分解成許多毒性代謝產(chǎn)物如·OH、NO2-和NO3-等，而毒性更強(qiáng)的·OH則進(jìn)一步對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生損傷作用。此外，NO還可通過抑制線粒體呼吸鏈的功能和介導(dǎo)谷氨酸興奮性毒性作用而使神經(jīng)細(xì)胞損傷。

6-OHDA損傷大鼠黑質(zhì)紋狀體后，可多種氧化應(yīng)激產(chǎn)物形成，如MDA、NO等，它們可進(jìn)一步對(duì)神經(jīng)細(xì)胞發(fā)揮損傷作用。MDA是生物膜中的多不飽和脂肪酸受到氧自由基攻擊后，形成的一種脂質(zhì)過氧化物。在PD中，隨谷光甘肽(GSH)含量下降，神經(jīng)元清除自由基能力降低，引起黑質(zhì)脂質(zhì)過氧化增強(qiáng)，其產(chǎn)物MDA增加，同時(shí)游離鐵又參與DA的自身氧化應(yīng)激反應(yīng)，導(dǎo)致自由基增多，從而損傷黑質(zhì)神經(jīng)元。NO是一種重要的生物信使分子，參與調(diào)節(jié)一系列生理過程。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，6-OHDA導(dǎo)致MDA、NO含量增加(P＜0.05)，依達(dá)拉奉3mg/kg可阻止此增加，而依達(dá)拉奉0.3mg/kg和1mg/kg對(duì)此變化影響不顯著，表明依達(dá)拉奉對(duì)PD大鼠的保護(hù)作用呈劑量依賴性，這種作用主要可能與其抑制自由基的活性有關(guān)。為觀察依達(dá)拉奉對(duì)DA神經(jīng)元的遠(yuǎn)期保護(hù)作用，本實(shí)驗(yàn)檢測(cè)了依達(dá)拉奉停藥后14d大鼠行為學(xué)、形態(tài)學(xué)及神經(jīng)生化方面的改變，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，此時(shí)其對(duì)6-OHDA導(dǎo)致的黑質(zhì)紋狀體損傷的保護(hù)作用與治療4d時(shí)效果相當(dāng)，說明依達(dá)拉奉對(duì)神經(jīng)元損傷后較遠(yuǎn)期仍有保護(hù)作用。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，依達(dá)拉奉(3mg/kg)阻止了6-OHDA損傷后黑質(zhì)尼氏體陽性細(xì)胞減少，表明依達(dá)拉奉可能通過抑制自由基的損傷對(duì)6-OHDA損傷后黑質(zhì)的神經(jīng)細(xì)胞產(chǎn)生保護(hù)作用，且呈劑量依賴性。

雖然目前PD的確切發(fā)病機(jī)制尚不清楚，但氧化應(yīng)激機(jī)制參與了6-OHDA導(dǎo)致的大鼠黑質(zhì)紋狀體的損傷。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，大劑量的依達(dá)拉奉通過減少6-OHDA大鼠黑質(zhì)和紋狀體中MDA、NO含量而對(duì)神經(jīng)元起保護(hù)作用，目前國(guó)內(nèi)外尚未見類似報(bào)道。

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