李天佳，劉昌偉，黃澤彬，倪 冷，來志超，吳立飛，劉 暴

1中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)院血管外科，北京100032

2中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)國家重點實驗室，北京100005

動脈粥樣硬化是一種嚴(yán)重危害人類生命健康的疾病，隨著生活水平提高和高脂肪飲食習(xí)慣，現(xiàn)已成為主要的致病和致死原因。粥樣硬化的形成是多因素共同作用的結(jié)果，其主要的病理變化是內(nèi)皮細胞損傷和平滑肌細胞增生。流行病學(xué)分析表明吸煙是血管粥樣硬化發(fā)生的一個主要因素。香煙煙霧可引起血管內(nèi)皮功能紊亂、炎癥反應(yīng)、脂質(zhì)代謝紊亂、血管平滑肌細胞增生以及血栓形成，從而導(dǎo)致動脈粥樣硬化的形成。通過已有的資料分析香煙煙霧可能是通過影響內(nèi)皮細胞和平滑肌細胞的增殖活力而誘發(fā)粥樣硬化［1-2］。c-jun是細胞核內(nèi)重要的轉(zhuǎn)錄因子，外界刺激從上游信號通路傳遞至c-jun并激活其功能，進而與DNA區(qū)域結(jié)合并參與基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控，影響細胞的生理狀態(tài)。細胞周期蛋白D1(cyclinD1)是一種細胞周期調(diào)節(jié)蛋白，在G1-S轉(zhuǎn)換中發(fā)揮正調(diào)控作用。c-jun對 cyclinD1的啟動子具有激活作用，調(diào)節(jié)其表達［3］。本研究以c-jun和cyclinD1為切入點，探討吸煙誘發(fā)粥樣硬化的機制。

材料和方法

材料DMEM高糖細胞基礎(chǔ)培養(yǎng)液購自Hyclone公司，新生小牛血清購自Gibco公司，內(nèi)皮細胞培養(yǎng)基、內(nèi)皮細胞生長添加物、平滑肌細胞生長添加物、人臍靜脈內(nèi)皮細胞 (human umbilical vein endothelial cells，HUVEC)購自Sciencell公司，兔主動脈平滑肌細胞 (smooth muscle cells，SMC)購自北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院細胞中心，CCK-8(cell counting kit-8)試劑盒購自日本東仁化學(xué)研究所，抗c-jun抗體、抗p-c-jun(Ser 63)抗體、抗cyclinD1抗體、抗微管蛋白抗體購自Cell Signaling Technology公司，山羊抗鼠二抗、山羊抗兔二抗、抗GAPDH抗體購自北京中杉金橋公司，Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑購自Invitrogen公司，F(xiàn)lag-cjun、V5-c-jun過表達質(zhì)粒由中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所分子生物學(xué)實驗室惠贈。

煙霧染毒劑的制備香煙 (焦油含量10 mg、煙氣煙堿量0.9 mg、煙氣CO量12mg)經(jīng)完全燃燒通入到1×磷酸鹽緩沖液 (phosphate buffer saline，PBS)中，6只香煙燃燒煙霧共通入到500 ml PBS中，調(diào)pH至7.4，0.22 μl濾膜過濾，制備煙霧萃取劑 (cigarette smoke extract，CSE)。此液定為初始原液，－80℃保存待用［4］。

CCK-8測定細胞活力取處于對數(shù)生長期的細胞消化離心后計數(shù)，以每孔3000個細胞接種至96孔板，5%二氧化碳、37℃孵育箱培養(yǎng)24 h。吸棄舊培養(yǎng)基并加入含有CSE的新鮮培養(yǎng)基，并以相應(yīng)濃度加入磷酸鹽緩沖液作為對照，每組設(shè)3個復(fù)孔。5%二氧化碳、37℃孵育箱培養(yǎng)48 h后，吸棄培養(yǎng)基后加入含有10%CCK-8的培養(yǎng)基，并設(shè)置加入培養(yǎng)基和CCK-8溶液但無細胞的孔為調(diào)零孔。5%二氧化碳、37℃孵育箱培養(yǎng)2 h后，測定450nm處吸光度值 (absorbance，A)。細胞活力表示為:細胞活力=［A(CSE孔)－A(調(diào)零孔)］/［A(磷酸鹽緩沖液孔)－A(調(diào)零孔)］，實驗重復(fù)3次。

細胞培養(yǎng)及染毒細胞復(fù)蘇后，加入適宜培養(yǎng)基置于5%二氧化碳、37℃孵育箱培養(yǎng)至細胞融合率達到80%。隨機分為染毒組和PBS對照組，依據(jù)上述測定細胞活力時的濃度分組如下:40%T、20%T、10%T、5%T、2.5%T、1.25%T、0.625%T、40%P、20%P、10%P、5%P、2.5%P(T表示煙霧染毒，P表示PBS對照)，染毒處理48 h。

質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細胞置于6 cm培養(yǎng)皿中至細胞融合率達到80%。3 μg質(zhì)粒加入到180 μl DMEM高糖細胞基礎(chǔ)培養(yǎng) 液，5 μl Lipofectamine 2000 加 入 到 180 μl DMEM高糖細胞基礎(chǔ)培養(yǎng)液，上述兩種液體混合后室溫靜置15 min。待轉(zhuǎn)染細胞用DMEM高糖細胞基礎(chǔ)培養(yǎng)液沖洗2次后，加入DMEM高糖細胞基礎(chǔ)培養(yǎng)液2 ml，再加入上述質(zhì)粒和Lipofectamine 2000的混合液，置于5%二氧化碳、37℃孵育箱培養(yǎng)6 h后換為完全培養(yǎng)基。

Western blot蛋白檢測收集細胞裂解蛋白，BCA法測定蛋白濃度，加入上樣緩沖液制成上樣樣品。采用30%聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，以濕法轉(zhuǎn)PVDF膜。5%BSA室溫封閉1 h，依據(jù)抗體工作濃度加入一抗，4℃過夜孵育，Tris-Tween 20緩沖液洗滌3次，每次5 min。加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗，室溫孵育1 h，Tris-Tween 20緩沖液洗滌3次，每次5 min。增強化學(xué)發(fā)光法底物發(fā)光，X光片曝光顯影。實驗重復(fù)3次。

統(tǒng)計學(xué)處理應(yīng)用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件，組間比較采用方差分析，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

細胞增殖活力平滑肌增殖活力在CSE濃度0.625%～10%時呈現(xiàn)波峰，CSE濃度太高表現(xiàn)毒性作用，染毒濃度太低則不起作用。血管內(nèi)皮細胞增殖活力隨煙霧染毒濃度增加而逐漸降低，在≤5%染毒濃度時，由于染毒濃度較低，內(nèi)皮細胞活力維持在一個平臺上 (圖1)。

血管平滑肌細胞的c-jun、p-c-jun與cyclinD1表達血管平滑肌煙霧染毒或PBS處理48 h后，染毒組和PBS對照組相比，c-jun的表達差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。p-c-jun在各PBS對照組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義 (P＞0.05)。p-c-jun染毒組相對于PBS處理組明顯增高 (P＜0.05)，其中10%T至0.625%T染毒濃度組p-c-jun水平呈現(xiàn)波峰，與SMC的CCK-8檢測的細胞增殖活力趨勢吻合。平滑肌細胞的各PBS對照組內(nèi)cyclinD1差異無統(tǒng)計學(xué)意義 (P＞0.05)。平滑肌細胞的染毒組和PBS對照組相比，cyclinD1明顯增高(P＜0.05)(圖2)。

圖1 煙霧染毒時血管平滑肌細胞和內(nèi)皮細胞的增殖活力Fig 1 Viabilities of vascular smooth muscle cells and endothelial cells exposured to cigarette smoke extract

血管內(nèi)皮細胞的c-jun、p-c-jun與cyclinD1表達在48 h后，HUVEC的染毒組和PBS對照組相比，c-jun差異無統(tǒng)計學(xué)意義 (P＞0.05)。p-c-jun在各PBS對照組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義 (P＞0.05)。染毒組的p-c-jun相對于PBS對照組明顯降低 (P＜0.05)，而CCK-8測定的內(nèi)皮細胞活力在5%～40%時才顯著降低，在≤5%染毒濃度時細胞活力處于平臺狀態(tài)。HUVEC染毒組和PBS對照組相比，cyclinD1明顯降低(P＜0.05)(圖3)。

質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后c-jun、p-c-jun與cyclinD1的表達轉(zhuǎn)染過表達c-jun的平滑肌細胞較空白對照組 c-jun、p-c-jun和cyclinD1表達明顯增高 (P＜0.05)。V5-cjun和Flag-c-jun兩種標(biāo)簽分別標(biāo)記c-jun過表達組的c-jun、p-c-jun和cyclinD1均比空白對照組明顯增高(P＜0.05)(圖4)。

圖2 Western blot檢測煙霧萃取劑對平滑肌細胞的影響Fig 2 Effects of cigarette smoke extract on smooth muscle cells by Western blot

圖3 Western blot檢測煙霧萃取劑對內(nèi)皮細胞的影響Fig 3 Effects of cigarette smoke extract on endothelial cells by Western blot

討 論

血管內(nèi)皮細胞受損、平滑肌細胞異常增殖是動脈粥樣硬化發(fā)生發(fā)展的主要過程。流行病研究表明吸煙是粥樣硬化的一個主要誘因。因此，筆者推測吸煙與動脈粥樣硬化中的內(nèi)皮細胞損傷和平滑肌細胞增殖具有密切聯(lián)系。研究表明在上述兩種細胞的增殖過程中，c-jun和cyclinD1發(fā)揮了重要作用［5］。

圖4 過表達c-jun質(zhì)粒對p-c-jun和細胞周期蛋白D1表達的影響Fig 4 Effect of over-expression c-jun on p-c-jun and cyclinD1

c-jun蛋白屬于激活蛋白-1(activator protein-1，AP-1)家庭成員之一，與AP-1家族轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合形成二聚體，并調(diào)控下游基因的轉(zhuǎn)錄活性［6］。c-jun的調(diào)控范圍十分廣泛，能接受多種外界物質(zhì)的影響并被激活，使細胞對外界刺激作出適應(yīng)性反應(yīng)。研究指出c-jun是細胞增殖的正調(diào)節(jié)物，可以促進肺動脈內(nèi)皮細胞增殖和血管生成［7］。c-jun蛋白在大多數(shù)靜息態(tài)細胞中表達，以便于快速誘導(dǎo)激活。本研究SMC和HUVEC的c-jun蛋白水平在染毒組和PBS對照組差異無統(tǒng)計學(xué)意義，表明煙霧染毒對c-jun的基礎(chǔ)表達量無明顯作用。c-jun需要磷酸化N端第63和73位絲氨酸的磷酸化位點以發(fā)揮轉(zhuǎn)錄激活作用［8］。本研究顯示PBS對SMC和HUVEC的p-c-jun表達均無影響，而煙霧染毒卻可以影響c-jun的磷酸化，并且煙霧染毒組的血管平滑肌細胞p-c-jun較對照組明顯增高，而煙霧染毒后內(nèi)皮細胞p-c-jun表達顯著降低。這與兩種細胞CCK-8細胞增殖活力檢測結(jié)果相符，表明煙霧染毒促進平滑肌增殖與p-c-jun有密切聯(lián)系。p-c-jun在很多研究中都表明可促進平滑肌細胞的增殖［9］。此外，在SMC中，p-c-jun在染毒濃度1.25%時即達到峰值，而其CCK-8檢測顯示的細胞活力峰值在2.5%濃度處才達到峰值。在HUVEC中，染毒組的p-c-jun在低染毒濃度時即出現(xiàn)明顯降低，而CCK-8測定的內(nèi)皮細胞活力在5%～40%時才顯著降低，表明p-c-jun的變化早于細胞活力的變化，推測在p-c-jun變化致細胞活力改變的過程中有其他分子的參與。

cyclinDl是一種細胞周期蛋白，保證細胞順利由Gl期進入S期，促進細胞分裂增殖［10］。c-jun可以調(diào)節(jié)cyclinD1的表達，其對 cyclinD1的啟動子具有激活作用，c-jun與cyclinD1是細胞周期的正調(diào)節(jié)因子［11］。本研究顯示PBS不影響兩種細胞的cyclinD1表達，而經(jīng)香煙煙霧染毒后，平滑肌細胞cyclinD1明顯增加，而內(nèi)皮細胞cyclinD1表達降低，此結(jié)果與CCK-8檢測的細胞增殖活力結(jié)果相符，表明煙霧在促進平滑肌細胞增殖和抑制內(nèi)皮細胞增殖的過程中，周期蛋白cyclinD1發(fā)揮了重要作用。推測煙霧染毒可能是通過上調(diào)血管平滑肌細胞cyclinD1表達來促進其增殖，這可能是吸煙誘發(fā)粥樣硬化的一個重要因素。因此，推論煙霧通過作用于不同細胞c-jun的磷酸化，進而影響周期蛋白cyclinD1的表達，最終調(diào)節(jié)細胞的增殖活力。本研究過表達c-jun后，cyclinD1表達明顯增高，并且cyclinD1的啟動子上也有AP-1的結(jié)合位點［12］。已知c-jun的磷酸化上游激酶是c-jun N末端激酶，香煙煙霧是否影響JNK磷酸化c-jun的進程需要進一步研究。

綜上，目前認為內(nèi)皮細胞損傷和SMC過度增殖是動脈粥樣硬化啟動和發(fā)展的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。因此，保護內(nèi)皮細胞并抑制SMC過度增殖，對于抑制動脈粥樣病變的發(fā)展具有重要作用。本研究煙霧染毒可抑制血管內(nèi)皮細胞增殖而促進平滑肌細胞增殖，并且發(fā)現(xiàn)在此過程中轉(zhuǎn)錄因子c-jun磷酸化水平和周期蛋白cyclinD1表達有明顯的變化，表明二者在吸煙導(dǎo)致的血管粥樣硬化中可能發(fā)揮重要作用。因此針對p-c-jun和cyclinD1在吸煙誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細胞和平滑肌細胞活力改變上，對血管粥樣硬化的預(yù)防和治療有重要意義。

(志謝:感謝中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)國家重點實驗室的老師和工作人員提供的指導(dǎo)和幫助)

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