張治國 歐喜超 孫倩 杜春英 高鐵杰 趙雁林

我國是全球結(jié)核病高負(fù)擔(dān)國家之一，結(jié)核病患者數(shù)居世界第二位［1］。目前我國常規(guī)應(yīng)用的結(jié)核病實(shí)驗(yàn)室診斷方法如涂片顯微鏡檢查敏感度較低，雖然固體培養(yǎng)具有較高的敏感度但是至少需要3～8周的時(shí)間，耗時(shí)較長［2］。用于檢測(cè)Mtb的核酸擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)在速度上較傳統(tǒng)培養(yǎng)方法具有明顯的優(yōu)勢(shì)，但目前商品化的核酸擴(kuò)增檢測(cè)流程比較復(fù)雜，需要高精度設(shè)備、強(qiáng)大的技術(shù)支持和訓(xùn)練有素的工作人員，不太適合在大多數(shù)資源有限的結(jié)核病高負(fù)擔(dān)國家應(yīng)用。

利福平耐藥實(shí)時(shí)熒光定量核酸擴(kuò)增檢測(cè)技術(shù)（Xpert Mtb／RIF）整合了基于定量PCR分子遺傳檢測(cè)所需的3個(gè)步驟（樣品準(zhǔn)備、擴(kuò)增、檢測(cè)），將待檢樣品放入到Xpert Mtb／RIF反應(yīng)盒中，系統(tǒng)就會(huì)自動(dòng)按照相應(yīng)的程序運(yùn)行，實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)PCR運(yùn)行情況，一旦PCR完成，Xpert Mtb／RIF檢測(cè)系統(tǒng)全自動(dòng)化的軟件就會(huì)判斷出患者是否患有結(jié)核病，以及是否對(duì)利福平耐藥［3］。本研究通過用該方法檢測(cè)588例結(jié)核病患者痰標(biāo)本，研究該技術(shù)診斷結(jié)核分枝桿菌（Xpert Mtb）及利福平耐藥（Xpert RIF）的敏感度和特異度，探討其在基層實(shí)驗(yàn)室的應(yīng)用前景。

資料和方法

一、實(shí)驗(yàn)材料

試劑：Xpert Mtb／RIF Kit（Cepheid，USA），SR（sample reagent）（Cepheid，USA），分枝桿菌涂片鏡檢染色液和培養(yǎng)基均來自珠海貝索生物技術(shù)有限公司。

二、對(duì)象和方法

（一）研究對(duì)象

自2010年10月至2011年12月，連續(xù)納入588例來昌平區(qū)結(jié)核病防治所就診的具有肺結(jié)核可疑癥狀的初診患者，收集患者痰標(biāo)本分別進(jìn)行涂片、培養(yǎng)和Xpert Mtb／RIF檢測(cè)。其中涂陽338例、涂陰250例。338例涂陽患者中7例Xpert Mtb檢測(cè)結(jié)果為錯(cuò)誤，6例無效，3例Xpert RIF結(jié)果為無法判斷；250例涂陰患者中9例Xpert Mtb結(jié)果為錯(cuò)誤，34例無效，2例Xpert RIF結(jié)果為無法判斷。最終可進(jìn)行Xpert Mtb比對(duì)分析的患者為527例；527例患者中痰培養(yǎng)陽性363例，17例無Xpert RIF結(jié)果，最終可進(jìn)行Xpert RIF比對(duì)分析的患者為346例。

（二）研究方法

對(duì)所有入選標(biāo)本同時(shí)做涂片、羅氏固體培養(yǎng)、比例法藥敏試驗(yàn)和Xpert Mtb／RIF檢測(cè)。

1．痰涂片檢查：痰涂片檢查遵照文獻(xiàn)［4］中的標(biāo)準(zhǔn)化操作程序執(zhí)行。

2．分離培養(yǎng)：吸取2ml痰標(biāo)本至帶螺旋蓋的前處理管中，視樣本性狀，加入1～2倍體積4%氫氧化鈉前處理液，置渦旋振蕩器上振蕩30～60s至標(biāo)本充分混勻，室溫放置15min。前處理完成后，以無菌吸管吸取前處理液0．1ml，均勻接種在2支酸性羅氏培養(yǎng)基斜面上，保持斜面水平向上37℃培養(yǎng)24h后，直立放置37℃繼續(xù)培養(yǎng)。接種后第3、7天觀察培養(yǎng)情況，此后每周觀察1次，并在分離培養(yǎng)結(jié)果記錄本上記錄生長結(jié)果［5］。

3．比例法藥敏：用接種環(huán)取一環(huán)培養(yǎng)基上的菌落，研磨后與標(biāo)準(zhǔn)麥?zhǔn)瞎鼙葘?duì)制成1mg／ml菌懸液，梯度稀釋為10-2mg／ml和10-4mg／ml，接種到含利福平（40μg／ml）的羅氏固體培養(yǎng)基和空白對(duì)照管培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)4周，觀察結(jié)果［5］。

4．Xpert Mtb／RIF核酸擴(kuò)增檢測(cè)：取1ml痰標(biāo)本置放到有螺旋蓋的前處理管中，然后加入相當(dāng)于2倍痰標(biāo)本體積的SR痰標(biāo)本處理液，旋緊前處理管，在渦旋振蕩器上渦旋振蕩15～30s，室溫靜置15min，使痰標(biāo)本充分液化。打開反應(yīng)盒，取2ml處理后樣品由加樣孔緩慢加入反應(yīng)盒，然后將反應(yīng)盒放置到檢測(cè)模塊，儀器開始進(jìn)行自動(dòng)化檢測(cè)。反應(yīng)結(jié)束后，在檢測(cè)系統(tǒng)窗口下可直接觀察測(cè)試結(jié)果。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 13．0對(duì)Xpert Mtb／RIF檢測(cè)和檢測(cè)金標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行一致性檢驗(yàn)（Kappa檢驗(yàn)），Kappa≥0．75認(rèn)為兩者一致性較好

結(jié) 果

一、Xpert Mtb／RIF對(duì)痰標(biāo)本Mtb的檢測(cè)

使用Xpert Mtb／RIF檢測(cè)527例就診患者是否為結(jié)核病患者，其中涂陽322例，涂陰205例。與傳統(tǒng)固體培養(yǎng)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行比較，結(jié)果見表1。

SPSS 13．0統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，以固體培養(yǎng)結(jié)果為金標(biāo)準(zhǔn)，Xpert Mtb／RIF檢測(cè)涂陽患者M(jìn)tb的敏感度為98．1%（309／315）、特異度為14．3%（1／7）；檢測(cè)涂陰患者 Mtb的敏感度為75．0%（36／48）、特異度為93．0%（146／157）；全部患者檢測(cè)的敏感度為95．0%（345／363）、特異度為89．6%（147／164）。對(duì)Xpert Mtb／RIF和固體培養(yǎng)進(jìn)行Kappa檢驗(yàn)，K＝0．845，兩者具有較好的一致性。

二、Xpert Mtb／RIF檢測(cè)痰標(biāo)本中Mtb對(duì)利福平的耐藥性分析

使用Xpert Mtb／RIF方法檢測(cè)346例患者痰標(biāo)本中的Mtb對(duì)利福平的耐藥性，其中涂陽309例，涂陰37例。與比例法藥敏結(jié)果進(jìn)行比較，結(jié)果見表2。

SPSS 13．0統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，以比例法藥敏結(jié)果為金標(biāo)準(zhǔn)，Xpert Mtb／RIF方法檢測(cè)涂陽患者利福平耐 藥 的 敏 感 度 為 91．0% （39／43）、特 異 度 為96．6%（257／266）；檢測(cè)涂陰患者利福平耐藥的敏感度為66．7%（2／3）、特異度為94．1%（32／34）；全部患者檢測(cè)的敏感度為89．1%（41／46）、特異度為96．3%（289／300）。對(duì)Xpert Mtb／RIF和比例法藥敏進(jìn)行Kappa一致性比較，K＝0．810，兩者具有較好的一致性。

表1 Xpert Mtb／RIF檢測(cè)Mtb效能分析（以固體培養(yǎng)試驗(yàn)為金標(biāo)準(zhǔn)）

表2 Xpert Mtb／RIF檢測(cè)痰標(biāo)本中的Mtb對(duì)利福平耐藥的結(jié)果分析（以比例法藥敏試驗(yàn)為金標(biāo)準(zhǔn)）

表3 Xpert Mtb／RIF方法及測(cè)序聯(lián)合檢測(cè)痰標(biāo)本的Mtb及利福平耐藥

三、16例傳統(tǒng)藥敏和Xpert Mtb／RIF檢測(cè)結(jié)果不一致患者菌株rpoB基因測(cè)序

16例不一致患者中，涂陽患者13例，涂陰患者3例，測(cè)序結(jié)果與傳統(tǒng)藥敏結(jié)果一致的有5例，測(cè)序結(jié)果與Xpert RIF結(jié)果一致的有11例，以比例法藥敏和測(cè)序結(jié)果為判斷標(biāo)準(zhǔn)，Xpert Mtb／RIF方法檢測(cè)涂陽患者利福平耐藥的敏感度為93．9%（46／49）、特異度為97．0%（258／266）；檢測(cè)涂陰患者利福平耐藥的敏感度為100．0%（2／2）、特異度為94．3%（33／35）；全部患者檢測(cè)的敏感度為94．1%（48／51）、特異度為98．6%（291／295）。對(duì)兩種方法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，進(jìn)行kappa一致性比較，K＝0．920，兩種方法具有較好的一致性，結(jié)果見表3。

討 論

結(jié)核病的早期診斷及其耐藥性的檢測(cè)，對(duì)于很好地控制耐藥結(jié)核病的傳播具有十分重要的意義。隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，近年來涌現(xiàn)出很多方法用于Mtb的鑒定及其耐藥性檢測(cè)。GeneXpert核酸擴(kuò)增檢測(cè)系統(tǒng)是將樣品準(zhǔn)備、定量PCR擴(kuò)增和熒光檢測(cè)集于一身的核酸擴(kuò)增檢測(cè)分析系統(tǒng)。只需要在獨(dú)立的反應(yīng)孔中加入待檢測(cè)的生物樣品，2h內(nèi)便能快速檢測(cè)出患者是否患有結(jié)核病，以及是否對(duì)利福平耐藥。同時(shí)由于使用可以密封的一次性反應(yīng)盒將樣品準(zhǔn)備所需的所有試劑都提前裝入其中，減少了操作過程中污染及環(huán)境因素導(dǎo)致的實(shí)驗(yàn)結(jié)果不精確的可能性。目前，GeneXpert檢測(cè)系統(tǒng)已開始應(yīng)用于白血病，以及腸病毒和鏈球菌等多種病原微生物的檢測(cè)。

一、Xpert Mtb／RIF檢測(cè)原理及國外評(píng)估結(jié)果

本研究使用的Xpert Mtb／RIF核酸檢測(cè)方法采用GeneXpert檢測(cè)系統(tǒng)，是一種半巢式實(shí)時(shí)熒光定量PCR體外診斷技術(shù)，針對(duì)rpoB基因81bp利福平耐藥核心區(qū)間（RRDR）設(shè)計(jì)引物、探針，檢測(cè)其是否發(fā)生突變，進(jìn)而用于診斷患者是否感染了Mtb，以及是否對(duì)利福平耐藥（rpoB序列存在突變）［6］。Helb等［6］研究結(jié)果顯示，Xpert Mtb／RIF在痰標(biāo)本中的檢測(cè)極限為131CFU（菌落形成單位）／ml，靈敏度遠(yuǎn)高于涂片檢測(cè)。在越南選取的29例涂陽患者采用Xpert Mtb檢測(cè)Mtb，敏感度達(dá)到100．0%；78例涂陰患者Xpert Mtb檢測(cè)敏感度和特異度為71．7%和100．0%。在烏干達(dá)選取的84例涂陽患者，Xpert Mtb檢測(cè)敏感度和特異度為98．4%和100．0%；以傳統(tǒng)藥敏作為金標(biāo)準(zhǔn)，9例耐藥患者均被Xpert RIF檢測(cè)為耐藥，55例敏感患者有1例被檢測(cè)為耐藥，通過測(cè)序發(fā)現(xiàn)該例菌株rpoB基因511位點(diǎn)發(fā)生突變，證實(shí)為耐藥。2010年，在南美洲、非洲和亞洲的多個(gè)國家級(jí)結(jié)核病實(shí)驗(yàn)室納入1843例患者對(duì)Xpert Mtb／RIF檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行了驗(yàn)證評(píng)估，研究結(jié)果表明：該方法檢測(cè)Mtb的敏感度和特異度分別為96．0%和98．6%，檢測(cè)利福平耐藥的敏感度和特異度為97．6%和98．1%，不一致者經(jīng)測(cè)序更正后，利福平耐藥檢測(cè)的敏感度和特異度達(dá)到99．1%和100．0%［7］。

二、Xpert Mtb／RIF檢測(cè)Mtb效能分析

本研究在區(qū)縣級(jí)結(jié)核病防治機(jī)構(gòu)采用臨床就診的肺結(jié)核可疑癥狀患者的痰標(biāo)本，通過Xpert Mtb／RIF檢測(cè)Mtb及其利福平耐藥性，結(jié)果顯示，Xpert Mtb／RIF檢測(cè)Mtb的敏感度達(dá)到95．0%，特異度為89．6%，特異度略低于國外相關(guān)報(bào)道，可能是由于作為金標(biāo)準(zhǔn)的傳統(tǒng)固體培養(yǎng)試驗(yàn)本身的敏感度并不是很高所致（國外多以液體培養(yǎng)作為金標(biāo)準(zhǔn)）。35例培養(yǎng)和Xpert Mtb診斷結(jié)果不一致患者通過查找相關(guān)臨床信息，17例培養(yǎng)陰性而Xpert Mtb檢測(cè)為陽性患者中，6例為涂片陽性，并且17例患者臨床診斷結(jié)果均為繼發(fā)性肺結(jié)核，Xpert Mtb診斷與臨床診斷結(jié)果一致。18例培養(yǎng)陽性而Xpert Mtb陰性患者中，6例為涂片陽性，考慮這18例患者可能為非結(jié)核分枝桿菌感染所致。

三、Xpert Mtb／RIF檢測(cè)利福平耐藥效能分析

以比例法藥敏試驗(yàn)為金標(biāo)準(zhǔn)，Xpert Mtb／RIF檢測(cè)Mtb對(duì)利福平耐藥的敏感度和特異度分別為89．1%、96．3%。通過對(duì)16例不一致患者菌株進(jìn)行rpoB耐藥基因核心區(qū)間測(cè)序，將比例法藥敏試驗(yàn)和差異菌株測(cè)序結(jié)果聯(lián)合作為金標(biāo)準(zhǔn)，Xpert Mtb／RIF方法檢測(cè)利福平耐藥的敏感度為94．1%（48／51）、特異度為98．6%（291／295），此結(jié)果與國外報(bào)道結(jié)果基本一致［7］，Xpert Mtb／RIF檢測(cè)可以很好地診斷初診患者是否對(duì)利福平耐藥。

總之，Xpert Mtb／RIF是一種可以快速、直接可靠、高特異地檢測(cè)出結(jié)核病患者及是否對(duì)利福平耐藥的新診斷技術(shù)。2010年12月，WHO推薦使用該方法對(duì)耐多藥可疑者和可疑Mtb與HIV雙重感染患者進(jìn)行結(jié)核病診斷［8］。本研究通過對(duì)Xpert Mtb／RIF進(jìn)行臨床應(yīng)用評(píng)估，證明該方法在我國基層實(shí)驗(yàn)室對(duì)于結(jié)核病診斷及利福平耐藥患者的篩查方面具有一定的應(yīng)用前景。

［1］World Health Organization．Global tuberculosis control：surveillance，planning，financing：WHO report 2008．Geneva：World Health Organization，2008．

［2］趙雁林，尚美．我國當(dāng)前結(jié)核病實(shí)驗(yàn)室診斷的現(xiàn)狀．中華檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志，2007，30（7）：97-98．

［3］Varma-Basil M，El-Hajj H，Colangeli R，et al．Rapid detection of rifampin resistance in Mycobacterium tuberculosis isolates from India and Mexico by a molecular beacon assay．J Clin Microbiol，2004，42（12）：5512-5516．

［4］趙雁林，姜廣路．痰涂片鏡檢標(biāo)準(zhǔn)化操作及質(zhì)量保證手冊(cè)．北京：中國協(xié)和醫(yī)科大學(xué)出版社，2009．

［5］中國防癆協(xié)會(huì)基礎(chǔ)專業(yè)委員會(huì)．結(jié)核病診斷實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)規(guī)程．北京：中國教育文化出版社，2006．

［6］Helb D，Jones M，Story E，et al．Rapid Detection of Mycobacterium tuberculosis and rifampin resistance by use of on-demand，near-patient technology．J Clin Microbiol，2010，48（1）：229-237．

［7］Boehme CC，Nabeta P，Hillemann D，et al．Rapid molecular detection of tuberculosis and rifampin resistance．N Engl J Med，2010，363（9）：1005-1015．

［8］World Health Organization．Roadmap for rolling out Xpert Mtb／RIF for rapid diagonisis of TB and MDR-TB．Geneva：World Health Organization，2010．