邱奕 趙善民 師長宏 史皆然

結核?。╰uberculosis，TB）是由結核分枝桿菌（Mycobacterium tuberculosis，Mtb）所引起的一種慢性傳染病，絕大部分以呼吸系統(tǒng)感染為主。據(jù)估計全世界約有1／3人口感染了Mtb，其中，10%的人會發(fā)展為活動性TB，而大部分以潛伏感染形式存在［1］。疫苗用于傳染病的預防可以達到事半功倍的效果，卡介苗（BCG）是目前惟一用于預防TB的疫苗，但其存在保護期短、免疫應答較弱及對潛伏感染者無效等問題，因此急需開發(fā)新型疫苗。結核疫苗根據(jù)用途可分為兩類：一是預防性疫苗，主要應用于新生兒和未感染的正常人群，保護其不被Mtb感染。二是治療性疫苗，主要應用于己感染Mtb的無癥狀攜帶者，使其不發(fā)?。换蛴糜谝呀?jīng)發(fā)病的患者，促進其早日痊愈［2］。

復蘇促生長因子（resuscitation-promoting factor，Rpf）功能類似于真核生物的生長因子［3］，由藤黃微球菌（Micrococcus luteus，M．luteus）分泌，可以促進休眠菌復蘇和生長。GenBank數(shù)據(jù)庫中查詢到34個與Rpf同源性較高的蛋白質信息，在Mtb H37Rv株和牛分枝桿菌基因組中，5個基因與M．luteus菌Rpf蛋白編碼基因同源，分別為Rv0867C（Rpf A）、Rv1009C（Rpf B）、Rv1884C（Rpf C）、Rv2389C（RpfD）和Rv2450C（RpfE），推測這些基因編碼的蛋白也具有與Rpf相類似的生物學活性——促細菌生長作用［4-5］。這些基因編碼蛋白稱為Rpf樣蛋白。

本實驗室前期制備了Rpf蛋白、Rpf結構域蛋白及Rpf結構域突變體蛋白，并對其生物學功能進行了研究。結果發(fā)現(xiàn)，原核表達的Rpf蛋白、Rpf結構域蛋白具有復蘇休眠菌的功能，而Rpf結構域突變體蛋白則具有拮抗復蘇休眠菌的功能［6］。為此，筆者從2011年11月到2012年2月，進一步觀察原核表達的Rpf結構域蛋白及Rpf結構域突變體蛋白刺激小鼠產(chǎn)生特異性抗體及IFN-γ／IL-2水平，以評價該系列蛋白作為疫苗的免疫原性及其對感染Mtb小鼠的免疫保護效力，以期為TB新型疫苗的研制提供實驗依據(jù)［7］。

材料和方法

一、材料和試劑

6～8周齡雄性SPF級BALB／c小鼠70只由第四軍醫(yī)大學實驗動物中心提供。表達谷胱甘肽巰基轉移酶（glutathione S-transferase，GST）融合蛋白包涵體的重組質粒PGEX-4T1-Rpfd、PGEX-4T1-Rpfd1、PGEX-4T1-Rpfd2為本實驗室前期制備［6］。Mtb的H37Rv株由陜西省結核病防治研究所王瑞惠贈。7H9液體培養(yǎng)基和7H10固體培養(yǎng)基（美國DIFCO公司）。分枝桿菌培養(yǎng)增強劑ADC和OADC（德國Beckton Dickinson公司）。RPMI 1640培養(yǎng)基（美國Gibco公司）。小鼠IFN-γELISA試劑盒、小鼠IL-2ELISA試劑盒（上海西唐生物科技有限公司）。P0009BCA蛋白濃度測定試劑盒（江蘇碧云天生物技術研究所）。96孔酶標板（杭州維特潔生化技術有限公司）。實驗過程中對動物的處置符合動物倫理學標準。

二、方法

1．Rpf結構域蛋白及其突變體蛋白的純化與鑒定：采用親和色譜法純化目的蛋白并用Rpfd的單克隆抗體（monoclonal antibody，mAb）對表達的目的蛋白進行Western-blot鑒定，證實表達的融合蛋白具有生物活性［6］。

2．蛋白濃度測定：根據(jù)二辛可酸（bicinchoninic acid，BCA）法蛋白濃度測定試劑盒說明書進行操作，以標準品蛋白（5mg／ml胎牛血清蛋白）濃度為縱坐標，標準品A562值為橫坐標繪制標準曲線，得出回歸方程：y＝789．08x2＋1243．4x-163．75（R2＝0．9951，y代表待測蛋白濃度，x代表待測蛋白A562值），并計算出每種待測蛋白濃度。

3．待測抗原Rpfd、Rpfd1、Rpfd2蛋白的濃度：1．400mg／ml、2．438mg／ml、3．882mg／ml（圖1）。

圖1 562nm波長下測定吸光度A值所繪制的標準曲線

4．免疫小鼠：將70只小鼠采用數(shù)字表法隨機分為5組，每組14只。Rpfd免疫組（A組）、Rpfd1免疫組（A1組）、Rpfd2免疫組（A2組）、BCG免疫組（B組）和生理鹽水組（C組）。每只小鼠采用腹部皮下多點注射分別含有50μg蛋白（Rpfd、Rpfd1、Rpfd2）的200μl生理鹽水，間隔2周免疫1次，共3次；B組采用腹部皮下多點注射含有BCG 1×105CFU的200μl生理鹽水，C組注射200μl生理鹽水。末次免疫后4周，采用尾靜脈注射的方式，用劑量為1×105CFU的毒株H37Rv攻擊各組小鼠。

5．免疫小鼠血清抗體水平檢測：（1）3種抗原板的包被和封閉：根據(jù)測得的3種蛋白的濃度，用配制好的0．05mol／L碳酸鹽包被緩沖液（pH 值為9．6），分別將3種蛋白稀釋至終濃度為10μg／ml，包被96孔板所有反應孔，每反應孔0．1ml，4℃過夜。用洗滌液PBST（pH 值為7．4；組分：NaHPO4、KH2PO4、KCl、NaCl、0．5%Tween-20）洗滌3次。用含0．5%BSA的PBS（pH值為7．4）液37℃封閉2h。同上洗滌后，-20℃保存?zhèn)溆?。?）ELISA法檢測免疫小鼠體內抗體水平：末次免疫后1周，隨機選取每組小鼠7只，采用摘眼球法取外周血500×g 20min離心分離血清。用稀釋液（0．1%BSA的PBS，pH值為7．3）將每組血清依次按1∶10、1∶50、1∶100、1∶200、1∶400、1∶800、1∶1600、1∶3200比例稀釋，分別加入3種蛋白包被的抗原板中，每個樣本設3個復孔，同時設置稀釋液空白對照孔、生理鹽水陰性對照孔和BCG陽性對照孔，37℃孵育1h。用PBST洗滌3次，用稀釋液將HRP標記的山羊抗小鼠IgG 1∶5000稀釋，37℃孵育1h，再次用PBST洗滌3次，加入鄰苯二胺（OPD）和過氧化氫（H2O2）底物顯色液，37℃顯色10～20min。用2mol／L的H2SO4終止反應，測定450nm處的吸光度。取3孔平均值作為每個樣本的終結果。

6．免疫小鼠感染Mtb前后血清IFN-γ水平檢測：末次免疫后1周、攻毒后1周，每組取7只小鼠的外周血500×g20min離心分離血清，采用夾心ELISA法檢測IFN-γ含量。操作步驟按照相應試劑盒說明書進行。

7．免疫小鼠感染 Mtb前后血清IL-2水平檢測：末次免疫后1周，攻毒后1周，每組取7只小鼠的外周血500×g20min離心分離血清，采用夾心ELISA法檢測IL-2含量。操作步驟按照相應試劑盒說明書進行。

8．統(tǒng)計學處理：采用SPSS 13．0軟件進行統(tǒng)計學分析，計量資料以均數(shù)±標準差（x±s）表示，經(jīng)K-S正態(tài)性檢驗確定每組數(shù)據(jù)均為正態(tài)分布（P值均＞0．05），多組的差異性比較采用單因素方差分析，組間的兩兩比較采用LSD-t法，以P＜0．05為差異有統(tǒng)計學意義。

結 果

1．免疫小鼠血清抗體水平檢測結果：免疫小鼠血清特異性抗體含量在A、A1、A2、B及C五組之間不完全相同。A、A1、A2三組蛋白免疫組分別與B、C兩組比較，血清抗體含量差異有統(tǒng)計意義，具體見表1。

2．免疫小鼠感染Mtb前后血清IFN-γ水平檢測結果：感染前后，免疫小鼠血清IFN-γ含量在A、A1、A2、B及C五組之間不完全相同。三組蛋白免疫組分別與B、C兩組比較，血清IFN-γ含量差異有統(tǒng)計意義，具體見表2。

3．免疫小鼠感染Mtb前后血清IL-2水平檢測結果：感染前后，免疫小鼠血清IL-2含量在A、A1、A2、B及C五組之間不完全相同。三組蛋白免疫組分別與B、C兩組比較，血清IL-2含量差異有統(tǒng)計意義，具體見表3。

討 論

Rpf由M．luteus分泌，在10-12g水平以自分泌和旁分泌形式促進休眠菌的復活和生長。實驗證明，M．luteus Rpf蛋白的A42～L118的77個氨基酸殘基是高度保守的區(qū)域，稱為Rpf結構域，該Rpf結構域是Rpf發(fā)揮復蘇作用的核心，M．luteus Rpf蛋白與Rpf結構域蛋白具有一致的生物學功能。本實驗室前期研究發(fā)現(xiàn)，100pmol／L的Rpf結構域蛋白刺激Mtb H37Ra休眠菌復蘇和生長作用明顯，這種作用在加入抗Rpf結構域蛋白的單克隆抗體mAb后被明顯抑制［8-9］，說明封閉這種蛋白可以抑制Mtb的增殖。

表1 免疫小鼠血清中抗體含量（A450值，±s）

表1 免疫小鼠血清中抗體含量（A450值，±s）

注 血清稀釋倍數(shù)為1∶100，試驗中對血清做了不同比例稀釋，各個比例血清檢測結果趨勢一致，故選擇稀釋比例1∶100血清檢測結果作為代表；a：與C組比較；b：與B組比較

組別抗原包被A450值 t值 P值 A450值 t值 P值 A450值 t值 P值Rpfd抗原包被 Rpfd1抗原包被 Rpfd2 A組0．652±0．2120．283b 5．701a＞0．05＜0．05 1．030±0．3045．276b 7．544a＜0．05＜0．05 0．542±0．2400．144b 2．775a＞0．05＝0．05 A1組0．990±0．2724．635b 10．973a＜0．05＜0．05 1．368±0．17117．20b 20．962a＜0．05＜0．05 1．055±0．2028．009b 11．908a＜0．05＜0．05 A2組1．470±0．4556．634b 9．963a＜0．05＜0．05 2．766±0．24531．643b 34．113a＜0．05＜0．05 1．605±0．5448．192b 9．744a＜0．05＜0．05 B組 0．631±0．180 0．573±0．004 0．538±0．100 C組 0．284±0．100 0．370±0．033 0．368±0．006 F值0．020 0．003 0．013 4．846 8．722 5．492 P值

表2 小鼠血清IFN-γ（pg／ml）檢測結果（±s）

表2 小鼠血清IFN-γ（pg／ml）檢測結果（±s）

注 a：與C組比較；b：與B組比較

感染Mtb H37Rv前感染Mtb H37Rv后組別IFN-γ含量 t值 P值 IFN-γ含量 t值 P值A組553．47±132．003．150b 6．625a＜0．05＜0．05 371．65±78．550．099b 3．110a＞0．05＜0．05 A1組484．85±288．931．089b 3．590a＞0．05＜0．05 492．41±211．742．874b 3．680a＜0．05＜0．05 A2組506．54±378．931．094b 3．840a＞0．05＜0．05 543．09±223．073．150b 6．304a＜0．05＜0．05 B組 385．28±129．07 335．36±207．72 C組 262．19±76．89 260．57±95．47 F值11．002 0．002 10．099 P值0．001

表3 小鼠血清IL-2（pg／ml）檢測結果（±s）

表3 小鼠血清IL-2（pg／ml）檢測結果（±s）

注 a：與C組比較；b：與B組比較

組別感染Mtb H37Rv前 感染Mtb H37Rv后IL-2含量 t值 P值 IL-2含量 t值 P值A組1490．05±215．357．763b 11．122a＜0．05＜0．05 806．81±306．394．627b 4．789a＜0．05＜0．05 A1組1738．91±358．407．903b 10．061a＜0．05＜0．05 1373．22±143．7515．900b 17．711a＜0．05＜0．05 A2組2270．74±193．4016．308b 21．680a＜0．05＜0．05 439．03±25．152．024b 2．368a＞0．05＞0．05 B組 718．70±269．29 335．26±176．81 C組 553．56±196．26 339．24±144．41 F值605．634 0．000 301．236 P值0．000

本實驗室前期設計了M．luteus Rpf結構域特異性PCR引物，應用基因點突變技術將M．luteus Rpf基因序列中的第54位谷氨酸（gag）分別突變?yōu)橘嚢彼幔╝ag）和丙氨酸（gcg）得到 Rpfd1、Rpfd2突變體。研究表明：5μg／ml的Rpf結構域蛋白和Rpf蛋白均可刺激恥垢分枝桿菌（Mycobacterium smegmatis，M．S）生長，該結構域突變體 Rpfd1、Rpfd2對于 M．S 的促生長作用不明顯［6］，推測Rpfd1、Rpfd2既可去除復蘇休眠Mtb的功能，又能保留誘導機體產(chǎn)生特異性抗體封閉Mtb 5種Rpf樣蛋白，從而抑制了Mtb的復蘇及生長。

目前研究表明，機體抗結核免疫由體液免疫及細胞免疫構成，在Mtb潛伏感染狀態(tài)下，體液免疫發(fā)揮的作用機制不清。機體內休眠Mtb分泌的Rpf樣蛋白刺激機體免疫能力作用很弱，不足以形成抗體。因此，在Mtb潛伏感染狀態(tài)下，無相應抗體抑制Rpf樣蛋白對休眠Mtb的促復蘇作用，筆者推測當外源性活躍的Mtb進入機體后，產(chǎn)生的Rpf樣蛋白量急劇增多，可喚醒機體內潛伏感染的休眠Mtb，促使休眠Mtb復蘇，從而導致TB的發(fā)生或是復發(fā)。BCG對成人 Mtb保護作用不強，可能因BCG產(chǎn)生抗Rpf樣蛋白抗體數(shù)量有限，如果能讓機體產(chǎn)生及保持比BCG刺激所產(chǎn)生的更高濃度抗Rpf樣蛋白的抗體，就有可能封閉無論是外源的、還是自分泌的Rpf樣蛋白的功能，從而達到抑制休眠Mtb復蘇的作用。

本實驗結果表明，Rpfd、Rpfd1、Rpfd2蛋白均具有很好的免疫原性，能在小鼠體內產(chǎn)生高效價的抗Rpfd特異性抗體，且3種抗原刺激產(chǎn)生的抗體效價顯著高于BCG免疫組。其中A組產(chǎn)生的抗體水平最高，提示其啟動感染宿主體液免疫能力優(yōu)于BCG。使用Rpfd、Rpfd1、Rpfd2蛋白作為抗原，均能被3種抗體識別，且親合程度趨于一致，說明Rpfd、Rpfd1、Rpfd2蛋白產(chǎn)生的特異性抗體同Rpfd、Rpfd1、Rpfd2蛋白之間存在交叉免疫反應，提示該3種蛋白產(chǎn)生的特異性抗體有可能同時封閉Mtb的5種Rpf樣蛋白，從而達到抑制休眠Mtb復蘇和生長的作用。研究中發(fā)現(xiàn)，A組在Rpfd1蛋白作為抗原所產(chǎn)生抗體A450值水平高于B組，在Rpfd、Rpfd2蛋白作為抗原時產(chǎn)生的抗體A450值水平不高于B組，與預期設想不一致，分析可能在小鼠免疫過程中將皮下免疫誤注入腹腔，至免疫效能降低所致。

Mtb是胞內寄生菌，特異性免疫以T細胞介導的細胞免疫為主［10-11］。IFN-γ是宿主抵御細胞內Mtb具有代表性的Th1型細胞因子，是機體抵抗Mtb感染重要的細胞因子。IFN-γ基因敲除的小鼠對Mtb的感染高度易感，常規(guī)劑量BCG免疫即可導致其死亡［12］。IL-2能促進結核抗原特異性T細胞克隆的增殖活化，促使T細胞分泌IFN-γ，活化NK細胞和巨噬細胞，增強巨噬細胞殺滅Mtb的能力［13］。IL-2或IFN-γ聯(lián)合抗結核藥物治療難治性肺結核或耐多藥結核病，可促使癥狀改善，痰菌陰轉，病灶吸收［14-15］。筆者用原核表達的Rpf結構域蛋白及其突變體蛋白免疫小鼠，分別觀察了同源加強免疫后和H37Rv毒株攻擊后，機體分泌IFN-γ和IL-2的能力，從細胞免疫應答方面評價Rpf結構域蛋白及其突變體蛋白作為疫苗對感染Mtb小鼠的免疫保護效力。

本實驗研究發(fā)現(xiàn)，感染前A組小鼠產(chǎn)生的IFN-γ水平高于B組（P＜0．05）和C組（P＜0．05）；感染后A1組、A2組小鼠產(chǎn)生的IFN-γ水平高于B組（P＜0．05）和 C組（P＜0．05）。筆者推測 H37Rv攻擊小鼠后，Rpfd發(fā)揮其促細菌生長作用，使小鼠體內Mtb大量生長，巨噬細胞吞噬大量Mtb后，崩解死亡致使IFN-γ含量明顯下降；而Rpfd1、Rpfd2無促細菌生長作用，巨噬細胞吞噬Mtb后，未達到細菌負荷過載，巨噬細胞殺滅Mtb，同時促進IFN-γ分泌，故IFN-γ量增加。Rpfd、Rpfd1、Rpfd2免疫小鼠后，刺激小鼠產(chǎn)生IL-2水平明顯升高，高于B組；Mtb攻擊免疫小鼠后，三組蛋白免疫組小鼠血清中IL-2檢測量均有下降，A2組IL-2下降尤為明顯，推測機體在抵抗Mtb感染中，IL-2起到十分關鍵的作用，大量消耗IL-2所致，這與Mtb患者IL-2產(chǎn)生量較正常人減少，重型患者尤為明顯的臨床現(xiàn)象十分吻合。

免疫佐劑是一類非特異性免疫增強劑，與抗原物質合并使用時能增強抗原物質免疫原性，增強機體免疫應答。研究顯示，免疫佐劑在以體液免疫為主的疾病治療中取得了肯定的效果。也有少數(shù)報道免疫佐劑可增強結核病的治療效果。實際上，在以細胞免疫為主的疾病中，免疫佐劑的免疫增強效果不及其對炎癥反應的增強效果［16］，故本實驗設計中未加入免疫佐劑。

以上結果表明，Rpf結構域蛋白及其突變體蛋白同時具有啟動宿主體液免疫功能及增強宿主細胞免疫功能的雙重作用，可能起到預防Mtb感染的作用，從而保護新生兒和未感染Mtb的正常人群；并且起到治療作用，使己感染Mtb的無癥狀攜帶者不發(fā)病，或用于已經(jīng)發(fā)病的患者，促進其早日痊愈。在下一步實驗中將設計構建 Mtb Rpf樣蛋白結構域突變體，并建立小鼠潛伏感染模型，觀察其對休眠Mtb復蘇的抑制效果，以期為TB的防治提供更直接的理論和實踐依據(jù)。

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