魏寅祥，趙 青，任志廣，賈硯寒，李新穎，黎 燕，彭 暉，馬遠方

(1.河南大學醫(yī)學院細胞與分子免疫學實驗室，河南開封 475003;2.軍事醫(yī)學科學院基礎醫(yī)學研究所分子免疫室，北京 100850)

腫瘤多藥耐藥(multidrug resistance，MDR)指患者接受化療藥物治療后對原來藥物及其他結(jié)構(gòu)和作用機制不同的抗癌藥產(chǎn)生耐藥的現(xiàn)象，是目前腫瘤化療失敗的主要原因。MDR的發(fā)生與多種因素有關，其中 ATP結(jié)合盒轉(zhuǎn)運蛋白(ATP-binding cassette transporter，ABC轉(zhuǎn)運蛋白)能量依賴性地將結(jié)構(gòu)和作用機制不同的抗腫瘤藥物外排到腫瘤細胞外是產(chǎn)生MDR的主要原因之一[1]。ABC轉(zhuǎn)運蛋白超家族包括48個成員，按其序列相似性可分為ABCA到ABCG7個大類。其中P糖蛋白(P-glycoprotein，P-gp)、MDR相關蛋白(MDR associated-proteins，MRP)和乳腺癌耐藥蛋白(breast cancer resistance protein，BCRP)與MDR 關系最為密切[2]。

小分子蛋白激酶抑制劑(small molecular-protein kinase inhibitor，SM-PKI)通過抑制信號通路中關鍵位點抑制腫瘤細胞增殖和存活，是近年來抗腫瘤藥物研究的熱點[3]。雖然具有靶向性強和副作用小等優(yōu)點，但臨床應用中出現(xiàn)的耐藥現(xiàn)象依然是此類抗癌藥難以回避的問題[4]。研究報道，伊馬替尼誘導耐藥細胞中P-gp過表達，提示P-gp可能與伊馬替尼耐藥具有相關性[5]。而最近越來越多的研究表明，多種SM-PKI如伊馬替尼、厄洛替尼、尼洛替尼、吉非替尼、蘭帕替尼、阿帕替尼和 MDRABC 間存在多種作用關系[5－9]。一方面 MDRABC會影響藥物的吸收、分布、代謝和清除，而另一方面一些親和力較高的PKI則被用于逆轉(zhuǎn)相應ABC轉(zhuǎn)運蛋白介導的MDR。因此，對于兩者間作用關系的研究無論對于臨床用藥還是新藥開發(fā)都具有重要的意義。

米哚妥林(midostaurin)是Novartis公司研究開發(fā)的抗腫瘤藥物，為蛋白激酶C(protein kinase C，PKC)、人 FMS樣酪氨酸蛋白激酶(FMS-like tyrosine kinase 3，F(xiàn)LT3)、KIT原癌基因蛋白，血管內(nèi)皮生長因子受體(vascular endothelial growth factor receptor，VEGFR)，血小板衍生生長因子(plateletderived growth factor，PDGF)受體蛋白激酶抑制劑，通過阻斷激酶的活化抑制腫瘤細胞的分化與增殖。米哚妥林目前已經(jīng)進入Ⅲ期臨床，主要應用于白血病的治療[10]，但關于米哚妥林與P-gp及MDR之間作用關系少有報道。本文用P-gp高表達的耐藥細胞K562/A02及其親本細胞K562。在體外從細胞、功能、蛋白、基因和ATP水解酶活性等多個水平，對米哚妥林與P-gp間相互作用關系進行評價，并對相關機制進行探索。

1 材料與方法

1.1 試劑和儀器

米哚妥林、羅丹明123(Rh-123)和DMSO購自美國Sigma公司;多柔比星、紫杉醇和長春新堿均購自浙江海正藥業(yè)有限公司;維拉帕米購自上海禾豐制藥有限公司;MTS細胞毒檢測試劑盒及V3601型P-gp-GloTM檢測系統(tǒng)購自美國Promega公司;BCA蛋白定量試劑盒購美國Thermo公司;抗P-gp單抗C219購自英國Abcam公司;AKT，pAKT(Ser473)，Erk和 pErk(Thr202/Tyr204)抗體均購自美國Cell Signaling Technology公司;HRP標記的羊抗兔和羊抗鼠二抗購自美國KPL公司;Trizol購自美國Invitrogen公司;TransScript First-Stand cDNA Synthesis Supermix逆轉(zhuǎn)錄試劑盒自北京全式金公司;SYBR Green Realtime PCR Master Mix購自日本Toyobo公司;RPMI 1640細胞培養(yǎng)液購自美國Hyclone公司;胎牛血清購自元亨金馬;其余試劑均為進口或國產(chǎn)分析純試劑。細胞培養(yǎng)板購自美國Corning公司;硝酸纖維素膜購自美國Millipore公司;X線片購自美國Kodak公司。

CO2細胞培養(yǎng)箱(美國Thermo公司)，光學倒置顯微鏡(日本Olympus公司)，高速臺式離心機(德國 Eppendorf公司)，多功能酶標儀(美國Thermo公司)，流式細胞儀(美國 BD公司)，TD-20熒光光度計(美國PE公司)，紫外分光光度計(美國Spectronic Genesys 5公司)，實時定量PCR儀和 SDS-PAG電泳系統(tǒng)(美國 Bio-Rad公司)。

1.2 細胞培養(yǎng)

人慢性粒細胞白血病細胞K562由本室保存，相應的P-gp高表達耐藥細胞K562/A02為多柔比星誘導得到，由中國醫(yī)學科學院血液學研究所藥物室熊冬生教授惠贈。兩種細胞均以含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基置于37℃及5%CO2條件恒溫孵箱培養(yǎng)，取對數(shù)期細胞進行實驗。其中K562/A02細胞的培養(yǎng)基中加入多柔比星1.0 mg·L－1維持其耐藥性及P-gp的高表達，實驗前1周停藥。

1.3 MTS法檢測米哚妥林細胞毒及逆轉(zhuǎn)耐藥作用

K562/A02與K562細胞分別以10%FBS的1640培養(yǎng)基懸浮，按照每180 μl 8×103個細胞接種于96孔微孔板，在5%CO2，37℃條件下培養(yǎng)24 h。加入米哚妥林稀釋液20 μl至終濃度分別為0.2，0.5，1 和 5 μmol·L－1，于 5%CO2，37℃培養(yǎng)72 h。以5%DMSO組為對照，以1640培養(yǎng)基為本底。檢測時各組按每孔10 μl加入MTS，37℃孵育3 h測定492 nm吸光度值(absorbance，A)。細胞存活率(%)=A實驗組/ADMSO組×100%。

K562/A02與K562細胞分別以10%FBS的1640培養(yǎng)基懸浮，按照8×103接種于96孔微孔板，在5%CO2、37℃條件下培養(yǎng)24 h。分別按濃度梯度加入米哚妥林和維拉帕米溶液20 μl，孵育1 h后加入P-gp底物類抗癌藥，并將其濃度控制在IC10左右。K562/A02中多柔比星、紫杉醇和長春新堿在 K562/A02 中相應濃度依次分別為 4 μmol·L－1，120和150 nmol·L－1，在K562中濃度為6，7.5和20 nmol·L－1。同時設置0.5‰DMSO 對照和抗癌藥單獨作用對照組。細胞存活率(%)=A實驗組/ADMSO組×100%。MTS檢測及存活率計算同細胞毒性檢測。

1.4 流式細胞術檢測米哚妥林對 P-gp的外排功能

收集K562/A02和K562細胞并計數(shù)，細胞按5×108L－1密度以10%FBS的1640培養(yǎng)基懸浮，分裝至1.5 ml EP管中待用。按終濃度米哚妥林和維拉帕米加入0.5 和10 μmol·L－1，以0.1%DMSO為陰性對照，37℃恒溫水浴30 min。除裸細胞外，各管加入 Rh-123 至終濃度 0.5 μmol·L－1，37℃避光孵育30 min。取出EP管，5000×g離心1 min，去上清，預冷生理鹽水洗滌2次，每次1 ml。300 μl預冷的生理鹽水重懸細胞，上流式細胞儀檢測(通道為FL1-H，激發(fā)波長488 nm，發(fā)射波長520 nm)，逆轉(zhuǎn)倍數(shù)=熒光值實驗組/熒光值對照組。

1.5 Western印跡法檢測米哚妥林對耐藥細胞中P-gp的表達

取對數(shù)生長期細胞，制成單細胞懸液，按每孔5×105個細胞接種6孔板。接種24 h后，加入化合物繼續(xù)培養(yǎng)72 h。培養(yǎng)結(jié)束，提取細胞總蛋白制備蛋白樣品;每孔加入等量待測蛋白，進行SDSPAGE檢測(12%);電泳結(jié)束，硝酸纖維素膜覆蓋，冰浴下60 V轉(zhuǎn)印3 h;5%脫脂奶室溫封閉1 h;一抗(1∶1000稀釋)4℃孵育過夜;1×TBST洗滌3次，每次10 min;二抗(HRP-GAR，HRP-GAM，1∶2000稀釋)室溫孵育2 h;1×TBST洗滌3次，每次10 min;加入ECL顯色，暗室曝光。

1.6 定量PCR檢測米哚妥林對耐藥細胞中P-gp基因表達水平

取對數(shù)生長期K562/A02細胞，以按每孔5×105細胞接種6孔板，加入米哚妥林至終濃度0.5 μmol·L－1培養(yǎng) 72 h，1‰DMSO 作為陰性對照。培養(yǎng)結(jié)束，按照 Trizol試劑說明書提取細胞總RNA，稀釋后檢測 A260nm和 A280nm，并換算為計算RNA含量。按逆轉(zhuǎn)錄試劑盒提供體系進行逆轉(zhuǎn)錄，每 20 μl體系含 1 μg RNA。

定量PCR以前述cDNA為模板用SYBR Green Realtime PCR Super Mix按照以下體系進行:SYBR Mix 10 μl，上下游引物各1 μl，cDNA 1 μl，ddH2O 7 μl，總體積共 20 μl。

反應條件如下:① 95℃ 3 min;② 95℃持續(xù)30 s，60℃持續(xù)20 s 72℃持續(xù)20 s并收集熒光共30個循環(huán);③ 從60℃開始以0.5℃為一個梯度逐步升溫檢測直至95℃，繪制溶解曲線。

MDR1正向引物序列為:5'-AAATTGGCTTGACAAGTTGTATATGG-3'(26 bp)，反向:5'-CACCAGCATCATGAGAGGAAGTC-3'(23 bp);GAPDH正向:5'-CCGTCTAGAAAAACCTGCC-3'(19 bp)，反向:5'-GCCAAATTCGTTGTCATACC-3'(20 bp)。所有引物由北京諾賽公司合成。

1.7 P-gp-GloTM檢測系統(tǒng)檢測米哚妥林對P-gp的ATP水解酶活性

P-gp的轉(zhuǎn)運依賴于ATP的水解驅(qū)動，化合物與P-gp相互作用會影響ATP酶活性。通過超速離心分離P-gp膜蛋白，并應用P-gp-GloTM檢測系統(tǒng)提供的ATP依賴的螢火蟲熒光素酶發(fā)光效應進行檢測。P-gp首先與化合物共孵育，再添加入一定量的ATP，隨后終止P-gp ATP酶的反應，剩余未被水解酶代謝的ATP用熒光素酶反應體系被檢測。主要步驟如下:① 用試劑盒緩沖液分別稀釋米哚妥林、Na3VO4、維拉帕米和DMSO，DMSO終濃度均調(diào)整至 1%，使其終濃度為0.2 mmol·L－1，同時將提取的P-gp膜蛋白濃度稀釋至 1.5 g·L－1，均放于冰上待用;② 取0.5 ml EP管，標號加入相應化合物，置于冰上，各組有3個復孔。DMSO組加入20 μl 1%DMSO的檢測緩沖液;Na3VO4、維拉帕米和米哚妥林各組加入相應20 μl化合物0.1 mmol·L－1(在50 μl體系中，最終工作濃度為 40 μmol·L－1);③ 每管加入 20 μl P-gp 1.5 g·L－1，37℃ 孵育5 min;④EP管取出，置于冰上，每管加10 μl MgATP 25 mmol·L－1，37℃孵育40 min;⑤ 取出EP 管，按標記號加入不透光96孔白板孔內(nèi)，每孔另加50 μl ATP檢測試劑，室溫反應20 min后用熒光光度計測量熒光強度。

1.8 統(tǒng)計學分析

2 結(jié)果

2.1 米哚妥林對細胞存活的影響

如圖1所示，米哚妥林在P-gp高表達的耐藥細胞K562/A02及其對應的敏感細胞K562細胞中毒性無顯著差異，米哚妥林 0.5 μmol·L－1對兩種細胞均無明顯殺傷作用，存活率均可達到80%以上。

Fig.1 Cytotoxic effect of midostaurin in sensitive and resistant cells by MTS assay.K562/A02 and K562 cells were seeded in 96-well plate followed by addition of midostaurin.Survival rate(%)=AExperiment/AControl×100%.K562/A02 or K562 cells were treated with midostaurin 0.5，1 and 5 μmol·L －1followed by MTS assay.±s，n=3.

2.2 米哚妥林對K562/A02及K562細胞的增敏作用

將無毒劑量的底物類抗癌藥與不同濃度梯度的米哚妥林在K562和K562/A02細胞中共同作用評價其逆轉(zhuǎn)MDR的效果，以維拉帕米為陽性對照。結(jié)果表明，米哚妥林 0.5 μmol·L－1可顯著恢復K562/A02對多柔比星的耐藥(圖2A)，且米哚妥林0.5 μmol·L－1作用效果(細胞存活率 40%)與維拉帕米 2.5 μmol·L－1作用效果接近。對長春新堿(圖2B)和紫杉醇(圖2C)亦有部分增敏，但效果不如維拉帕米。對親本敏感細胞K562無效果，表明米哚妥林通過對P-gp的作用起到逆轉(zhuǎn)效果。

Fig.2 Effect of midostaurin on sensitization of drug resistance mediated by P-gp.K562/A02 or K562 cells were treated with doxorubicin(A)，vincristine(B)，paclitaxel(C)，and midostaurin 0，0.25 and 0.5 μmol·L －1added into cells for 24 h.Verapamil was used as positive control drug.±s，n=3.＊＊P＜0.01，compared with DMSO control group.

2.3 米哚妥林對P-gp外排功能的影響

如圖3所示，米哚妥林可顯著增加Rh-123在K562/A02細胞中的積累，表明其對P-gp的外排活性具有抑制作用。同時，米哚妥林0.5 和10 μmol·L－1效果均優(yōu)于維拉帕米。而在K562細胞中則無抑制作用。

Fig.3 Effect of midostaurin on the intracellular Rh-123 accumulation.Rh-123 accumulation in K562/A02 or K562 cell following a 30 min incubation in the absence or presence of midostaurin or verapamil 0.5 and 10 μmol·L －1 .0.1%DMSO was taken as control and the results were presented as change fold of fluorescence intensity in treatment group relative to DMSO vehicle.±s，n=3.＊＊P＜0.01，compared with vehicle control group.

2.4 米哚妥林對P-gp基因與蛋白表達水平的影響

圖4 結(jié)果表明，米哚妥林0.5 μmol·L－1作用72 h后，在K562/A02細胞中的米哚妥林對P-gp蛋白(圖4A)和基因(圖4B)均無顯著影響。

Fig.4 Effect of midostaurin on human P-gp protein expression by Western boltting(A)and mRNA expression by qPCR(B).Lane 1:vehicle control;lane 2:midostaurin 0.5 μmo·lL－1.±s，n=3.

2.5 米哚妥林對耐藥和敏感細胞中信號通路分子的影響

米哚妥林的作用靶點包括PKC，F(xiàn)LT3和KIT，可作用于Raf/MEK/ERK通路。通過檢測了逆轉(zhuǎn)條件下米哚妥林K562和K562/A02中AKT和ERK的表達及磷酸化水平變化，以探索其逆轉(zhuǎn)耐藥的機制是否與其激酶抑制活性相關。如圖5所示，米哚妥林0.5 μmol·L－1處理72 h 后對耐藥和敏感細胞中 AKT和ERK的表達及磷酸化水平均無顯著影響。

2.6 米哚妥林對P-gp的ATP水解酶活性的影響

與對照組相比，熒光信號的減弱表示被P-gp ATP酶消耗的ATP量，因此信號降低的越多，P-gp ATP酶活性越高，可認為P-gp的底物。反之，信號的增強表明，ATP酶活性被抑制，化合物P-gp的為抑制劑。在本實驗中，試劑盒提供的Na3VO4為抑制劑對照，維拉帕米為底物對照。如圖6所示，米哚妥林不激活P-gp的ATP酶活性，可能不是ATP酶的底物。

Fig.6 Effect of midostaurin on P-gp ATPase activity.Crude membranes from K562/A02 cells were incubated with DMSO or midostaurin 40 μmol·L －1diluted with buffer solution and MgATP 5 mmo·lL－1at 37℃for 40 min.Relative light units(RLU)represent the level of ATP in the sample，exhibiting a negative relationship with activity of P-gp ATPase.Sodium vanadate(Vi)and topotecan(TOPT)40 μmol·L －1were used as inhibitor and substrate control respectively.±s，n=3.*P＜0.05，＊＊ P＜0.01，compared with vehicle group.

3 討論

P-gp是于20世紀70年代發(fā)現(xiàn)的首個耐藥相關蛋白，在結(jié)腸癌、直腸癌與腎癌等腫瘤中可原發(fā)性高表達，在急性白血病、淋巴瘤、小細胞肺癌、卵巢癌等腫瘤化療中可獲得性表達，臨床資料顯示P-gp過表達與患者的不良預后有關[11]。P-gp的底物主要包括蒽環(huán)類物 (多柔比星和柔紅霉素)、植物堿(長春新堿和長春堿)、紫杉烷(紫杉醇和多西紫杉醇)類普遍在臨床上使用的腫瘤化療藥物[12]，而近年的研究表明，P-gp亦有可能與伊馬替尼等多種新型激酶抑制劑的臨床耐藥相關[5]。

近30年來，一直致力于對多藥耐藥逆轉(zhuǎn)劑的開發(fā)。以維拉帕米、環(huán)菌素A等第一代逆轉(zhuǎn)劑為代表，其特征多為P-gp底物，依靠與其他藥物競爭結(jié)合并外排發(fā)揮抑制作用，但由于其與P-gp親和力較低，一般使用劑量較大，并且伴有明顯的毒性作用[13]。通過對第一代逆轉(zhuǎn)劑進行結(jié)構(gòu)改造，發(fā)展了以維拉帕米右旋同分異構(gòu)體、PSC833(環(huán)孢素A衍生物)和VX-710為代表的第二代逆轉(zhuǎn)劑。與第一代相比，它們的主要特點是具有較低的細胞毒作用，且逆轉(zhuǎn)MDR作用明顯增強，但限制其臨床應用的主要障礙是與抗腫瘤藥物合用時干擾后者的藥代動力學[14]。目前以高效低毒、高親和力、非P-gp底物、無明顯藥代動力學改變?yōu)橹饕卣鞯牡谌嗨幠退幠孓D(zhuǎn)劑正在研發(fā)中。

本研究中，米哚妥林 0.5 μmol·L－1(IC20以內(nèi))即可在功能水平有效逆抑制P-gp的外排活性，在細胞水平可逆轉(zhuǎn)P-gp介導的MDR，表現(xiàn)出較好的逆轉(zhuǎn)活性，同時在ATP酶實驗中表明其可能不是P-gp的底物。而已有報道表明米哚妥林臨床使用其血藥濃度可達到 771～4649 nmol·L－1[15]，大于本研究采用的 0.5 μmol·L－1。這表明了這一逆轉(zhuǎn)策略應用的可行性。但是，近期研究表明米哚妥林在肝中需通過CYP3A4酶進行代謝[16]。這使得米哚妥林這種新型的激酶抑制劑是否能作為P-gp抑制劑直接開發(fā)應用還有待體內(nèi)進一步研究，因為米哚妥林具有P-gp抑制作用和CYP3A4底物的特性，這表明其很可能會影響其他藥物的藥代動力學，在與其他化療藥物(特別是P-gp底物)聯(lián)用時要在用藥的劑量、時序等方面給予特別的重視。但是，鑒于目前投入臨床試驗的化合物多是在已知的活性化合物骨架結(jié)構(gòu)的基礎上改造、修飾通過對其衍生物藥效學篩選得到，而至今仍沒有一種小分子P-gp抑制劑被投入臨床應用，因此，人們需要尋找更多全新結(jié)構(gòu)的化合物，為未來多藥耐藥逆轉(zhuǎn)劑的開發(fā)提供更多空間。所以米哚妥林以其前述特征可作為一種P-gp逆轉(zhuǎn)劑的先導化合物骨架可考慮列入。

[1]Sharom FJ.ABC multidrug transporters:structure，function and role in chemoresistance[J].Pharmacogenomics，2008，9(1):105-127.

[2]Choudhuri S，Klaassen CD.Structure，function，expression，genomic organization，and single nucleotide polymorphisms of human ABCB1(MDR1)，ABCC(MRP)，and ABCG2(BCRP)efflux transporters[J].Int J Toxicol，2006，25(4):231-259.

[3]Baselga J.Targeting tyrosine kinases in cancer:the second wave[J].Science，2006，312(5777):1175-1178.

[4]Hegedus C，Ozvegy-Laczka C，Szakács G，Sarkadi B.Interaction of ABC multidrug transporters with anticancer protein kinase inhibitors:substrates and/or inhibitors[J]?Curr Cancer Drug Targets，2009，9(3):252-272.

[5]Burger H，van Tol H，Brok M，Wiemer EA，de Bruijn EA，Guetens G，et al.Chronic imatinib mesylate exposure leads to reduced intracellular drug accumulation by induction of the ABCG2(BCRP)and ABCB1(MDR1)drug transport pumps[J].Cancer Biol Ther，2005，4(7):747-752.

[6]Dohse M，Scharenberg C，Shukla S，Robey RW，Volkmann T，Deeken JF，et al.Comparison of ATP-binding cassette transporter interactions with the tyrosine kinase inhibitors imatinib，nilotinib，and dasatinib[J].Drug Metab Dispos，2010，38(8):1371-1380.

[7]Agarwal S，Sane R，Gallardo JL，Ohlfest JR，Elmquist WF.Distribution of gefitinib to the brain is limited by P-glycoprotein(ABCB1)and breast cancer resistance protein(ABCG2)-mediated active efflux[J].J Pharmacol Exp Ther，2010，334(1):147-155.

[8]Dai CL，Tiwari AK，Wu CP，Su XD，Wang SR，Liu DG，et al.Lapatinib(Tykerb，GW572016)reverses multidrug resistance in cancer cells by inhibiting the activity of ATP-binding cassette subfamily B member 1 and G member 2[J].Cancer Res，2008，68(19):7905-7914.

[9]Mi YJ， Liang YJ， Huang HB， Zhao HY，Wu CP，Wang F，et al.Apatinib(YN968D1)reverses multidrug resistance by inhibiting the efflux function of multiple ATP-binding cassette transporters[J].Cancer Res，2010，70(20):7981-7991.

[10]Stone RM， Fischer T， Paquette R，Schiller G，Schiffer CA，Ehninger G，et al.Phase ⅠB study of the FLT3 kinase inhibitor midostaurin with chemotherapy in younger newly diagnosed adult patients with acute myeloid leukemia[J].Leukemia，2012，26:2061-2068.

[11]Leighton JC Jr， Goldstein LJ. P-glycoprotein in adult solid tumors.Expression and prognostic significance[J].Hematol Oncol Clin North Am，1995，9(2):251-273.

[12]Flens MJ，Zaman GJ，van der Valk P，Izquierdo MA，Schroeijers AB，Scheffer GL，et al.Tissue distribution of the multidrug resistance protein[J].Am J Pathol，1996，148(4):1237-1247.

[13]Szakács G，Paterson JK，Ludwig JA，Booth-Genthe C，Gottesman MM.Targeting multidrug resistance in cancer[J].Nat Rev Drug Discov，2006，5(3):219-234.

[14]Zhao Q，Li Y，Peng H.Structure basis of P-gp-ligands interaction and reversal of P-gp mediated multidrug resistance[J]，J Int Pharm Res(國際藥學研究雜志)，2010，37:439-445.

[15]Millward MJ，House C，Bowtell D，Webster L，Olver IN，Gore M， et al. The multikinase inhibitor midostaurin(PKC412A)lacks activity in metastatic melanoma:a phaseⅡA clinical and biologic study[J].Br J Cancer，2006，95(7):829-834.

[16]Wang Y， Yin OQ， Graf P， Kisicki JC，Schran H.Dose-and time-dependent pharmacokinetics of midostaurin in patients with diabetes mellitus[J].J Clin Pharmacol，2008，48(6):763-775.