曹亦菲，譚曉華，黃仙紅，何 平，連福治，鄧盧翠，楊 磊

(杭州師范大學健康管理學院預防醫(yī)學教研室，浙江杭州 310036)

砷是自然界中常見的毒物之一，同時砷作為藥物在多種腫瘤的臨床治療上有顯著療效，研究機體的砷耐受機制對于砷中毒的預防和解決臨床耐藥問題均有重要意義。阻止砷進入細胞是其發(fā)揮毒性的第一個關鍵步驟，而在哺乳動物中砷的這種入胞機制至今沒有得到完全闡明。水通道蛋白9(aquaporin9，AQP9)是膜主體內在蛋白家族中的一員，定位于細胞膜上，作為通道蛋白參與細胞內外液體的轉運[1]。研究發(fā)現，AQP9在調節(jié)細胞內砷的含量中發(fā)揮重要作用[2－4]，在小鼠肝細胞和人肺癌細胞中 AQP9 參與細胞砷的攝入[5－7]。Thorsen 等[8]發(fā)現，p38的酵母同源物Hog1p通過降低AQP9/AQP7/AQP3同源類似物Fps1p的磷酸化水平增加其對砷的抗性，Fps1 p的磷酸化可能是酵母中一個非常重要的砷耐受性調控機制，而且其磷酸化部分受Hog1p的調控。這些研究提示AQP9在酵母細胞砷攝入中的活性可能與其磷酸化水平有直接關系。但在哺乳動物中是否存在類似機制，即由p38等調節(jié)AQP9磷酸化還不清楚。在多發(fā)性骨髓瘤細胞中抑制p38的活性能提高As2O3的細胞毒性[9]。最近研究發(fā)現，在人和小鼠的中性粒細胞中AQP9的磷酸化能調節(jié)其膜定位，而且可能被依賴于 Rac－1的信號通路所調控[10]。AQP9磷酸化調節(jié)細胞對砷的攝入需要進一步研究。本研究以哺乳動物細胞株ECV－304及其經低濃度砷誘導的抗砷性ECV－304(AsRE)細胞株為模型，分析這兩種對砷耐受性有明顯差異的細胞中AQP9 mRNA、蛋白表達及其磷酸化水平的差異，并探討p38對AQP9磷酸化的影響。

1 材料與方法

1.1 細胞株

ECV－304細胞株，本實驗室冷凍保存;AsRE，由本實驗室前期低濃度砷誘導獲得[11]。

1.2 試劑與儀器

NaAsO2，購自美國 Sigma公司;RPM1640培養(yǎng)基，胎牛血清和RNA抽提液購自美國Gibco公司;CCK－8試劑盒，蛋白A/G凝膠，購自碧云天生物技術研究所，cDNA逆轉錄試劑盒和 SYBR Green熒光定量PCR試劑盒，購自日本TaKaRa公司;鼠抗人AQP9抗體和鼠抗人β肌動蛋白抗體，購自Santa Crluz公司，兔抗人p38抗體，鼠抗人p38磷酸化抗體和鼠抗泛磷酸化抗體購自Abcam公司;ECL化學發(fā)光試劑盒，購自Amersham Bioscience公司。酶標儀，半干轉轉膜儀和蛋白電泳儀，為美國Bio－Rad公司產品;7300型實時熒光定量PCR(RT－PCR)儀，為美國ABI公司產品;電感耦合等離子體質譜儀(ICP－MS，HP4500)，為日本Yokogawa Analytical Systems公司產品。

1.3 細胞培養(yǎng)

AsRE和ECV－304細胞株培養(yǎng)于RPM1640培養(yǎng)基(含10%胎牛血清，青霉素和鏈霉素100 ku·L－1)中，放置于37℃，5%CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中，取對數生長期細胞進行實驗。

1.4 CCK8法檢測細胞生存率

取ECV－304和AsRE對數生長期細胞分別用含 NaAsO22.5，5，10，20 和 40 μmol·L－1的培養(yǎng)基接種于96孔板內培養(yǎng)，另設正常對照組。實驗重復5 次。每孔密度約5 ×104L－1，總體積150 μl，培養(yǎng)24 h后每孔加入15 μl WST－8工作液，37℃繼續(xù)培養(yǎng)1 h后在酶標儀上采用波長450 nm比色，根據各孔吸光度值，計算 IC50值，并繪制生存率曲線。

1.5 電感耦合等離子體質譜法測定細胞內砷含量

NaAsO22.5，5，10，20 和 40 μmol·L－1處理細胞2 h后，PBS洗滌細胞，然后溶于HNO3中，采用電感耦合等離子體質譜儀(ICP－MS)法測定細胞內砷含量。

1.6 實時熒光定量PCR法檢測AQP9mRNA表達

用含NaAsO22.5，5，10和20 μmol·L－1的培養(yǎng)基處理對數生長期的細胞，設不加藥作為正常對照組，2 h后收集細胞。采用標準的Trizol－氯仿一步法抽取總RNA并測定濃度，逆轉錄為cDNA，在實時定量PCR中作為模板。采用SYBR GreenⅠ熒光染料嵌合法在ABI 7300定量PCR儀上進行。管家基因 β肌動蛋白引物序列為正向:5'－TGGCACCCAGCAATGAA－3'， 反 向:5'－CTAAGTCATAGTCCACCTAGAAGCA－3';目的基因 AQP9的引物為正向:5'－ACTCAGTGTCATCATGTAGTGG－3'， 反 向:5'－CACCTCAGGCTTACAAGAACA－3'。PCR 反應 體系 為:SYBR Premix Dimer－Eraser(2 × conc.)10 μl;0.8 μl 正 反 向 引 物100 μmol·L－1;RT 產 物 1 μl，加 ddH2O 至 20 μl。反應條件:95℃30 s 1個循環(huán);95℃5 s，60℃31 s 40個循環(huán);95℃ 15 s，60℃ 60 s，95℃ 15 s 1個循環(huán)。所得 Ct值通過 2－ΔΔCt法計算相對表達量[12]。

1.7 Western印跡法檢測AQP9和p38蛋白表達

用 NaAsO22.5，5，10 和20 μmol·L－1的培養(yǎng)基處理對數生長期的細胞，同時設正常對照組，2 h后加入裂解液，超聲勻漿后提取總蛋白，SDS－PAGE電泳后轉移至硝酸纖維素膜，用含5%牛血清白蛋白的封閉液封閉過夜，PBST溶液(磷酸鹽緩沖液+聚山梨酯－20)洗膜3次，每次10 min;加入一抗(稀釋濃度1∶500)孵育2 h或4℃過夜，再洗膜3次，加入辣根過氧化物酶標記的二抗(稀釋濃度1∶2000)室溫下孵育1 h，洗膜3次后ECL發(fā)光顯影，凝膠成像系統(tǒng)拍照進行條帶分析。以目標蛋白積分吸光度與內參β肌動蛋白分吸光度比值，表示蛋白的相對表達量。

1.8 免疫沉淀法檢測AQP9 mRNA蛋白磷酸化水平

收集相應處理后的細胞，裂解提取得到蛋白后加入充分重懸的蛋白A/G凝膠，4℃緩慢搖動1 h。離心后取上清，加入2 μg抗AQP9，4℃緩慢搖動過夜。繼續(xù)加入40 μl充分重懸的蛋白A/G凝膠，4℃搖動3 h，然后離心吸除上清，PBS洗滌3次，加入適量SDS－PAGE電泳上樣緩沖液重懸。后續(xù)實驗同Western印跡分析，一抗為鼠抗泛磷酸化抗體。

1.9 過量表達AQP9后細胞內砷含量的測定

將AQP9全長序列克隆進入真核表達載體pcDNA3.1，得到 pcDNA3.1－AQP9 質粒，將其與pcDNA3.1空載體通過脂質體2000分別轉染進入AsRE和ECV304細胞，經Western印跡法確定轉染成功后，細胞用 NaASO28 μmol·L－1處理2，4，6，8，10和12 h后，采用1.5方法檢測細胞內砷含量。

1.10 統(tǒng)計學分析

2 結果

2.1 砷在AsRE細胞和ECV－304細胞蓄積速度

圖1 CCK－8結果顯示，在NaAsO2各濃度下，AsRE細胞的存活率顯著高于ECV－304細胞(P＜0.05)，其 IC50值分別是 12.59 和 4.06 μmol·L－1。說明AsRE對砷的耐受性顯著高于ECV－304細胞。

Fig.1 Effect of NaAsO2on survival rate in AsRE and ECV－304 cells.Cells grown in 96－well plates were treated with NaAsO2for 24 h then assessed viability by CCK8 assay.±s，n=4.

Fig.2 Effect of NaAsO2on As accumulation in AsRE and ECV－304 cells.A.AsRE and ECV－304 cells treated with NaAsO2for 2 h.±s，n=5.*P＜0.05，compared with ECV－304 cells.B.AsRE and ECV－304 cells treated with NaAsO28 μmo·lL－1.±s，n=3.*P＜0.05，＊＊P＜0.01，compared with ECV－304 cells.

ICP－MS測定細胞內砷含量，結果顯示AsRE和ECV－304細胞株內砷含量都隨NaASO2濃度增加而增加(圖2A)，但相同 NaASO2濃度處理，AsRE細胞內的砷含量顯著低于ECV－304細胞內的砷含量(P＜0.05)。而用 NaAsO28 μmol·L－1處理ECV－304和AsRE細胞不同時間后，發(fā)現AsRE細胞內的砷蓄積與ECV－304細胞相比顯著緩慢(P＜0.01)，而且在處理6 h后砷含量幾乎不再增加，ECV－304細胞中砷的含量則隨處理時間一直呈增加的趨勢(圖2B)。提示AsRE細胞對砷的耐受性可能與細胞內砷的蓄積量相關。

2.2 NaAsO2對AsRE細胞中AQP9 mRNA表達的影響

圖3 結果顯示，NaAsO22.5，5，10 和20 μmol·L－1處理ECV－304和AsRE 2 h后，兩細胞中AQP9 mRNA的表達水平都隨處理濃度的增加而有所下降，但AsRE細胞中AQP9 mRNA的表達水平下降更為顯著(P＜0.05)。提示降低AQP9 mRNA的表達水平可能與砷的攝入量降低相關，而且在砷耐受性較高的AsRE細胞中，AQP9表達在不同時間段的不同表現可能與砷攝入含量高度相關。

Fig.3 Effect of NaAsO2on AQP9 mRNA levels in AsRE and ECV－304 cells.AsRE and ECV－304 were treated with NaAsO2for 2 h.±s，n=4.＊＊P＜0.01，compared with the same cell line treated with NaAsO2.5 μmol·L －1 .2

2.3 NaAsO2對 ECV－304和 AsRE細胞 AQP9 和p38蛋白及其磷酸化表達水平的影響

Western免疫印跡結果顯示，在NaAsO2各濃度處理中，AsRE細胞中磷酸化AQP9(p－AQP9)表達均處于較高水平，AQP9蛋白水平隨NaAsO2濃度增加而下降;ECV－304細胞中AQP9蛋白水平無明顯變化，p－AQP9水平隨 NaAsO2濃度增加呈上升趨勢，但總體水平均低于AsRE細胞(圖4)。處理不同時間，兩細胞中AQP9蛋白表達水平均無明顯變化，其磷酸化表達水平則隨時間增加而增加，AsRE細胞中增加更為顯著(圖5)?？梢娏姿峄降淖兓赡芘c細胞砷耐受性增加相關。AsRE細胞p－AQP9與AQP9表達比值隨濃度和時間增加而增加，但p－AQP9水平并未隨濃度增加而增加，因此，推測砷刺激導致AQP9磷酸化與未磷酸化水平比例發(fā)生變化，從而影響對砷的攝入。

Fig.4 Effect of NaAsO2on protein and phosphorylation levels of AQP9 in AsRE and ECV304 cells by Western blotting.Cells were treated with NaAsO2for 2 h.The bar graph represents the densitometry measurement of the AQP9(B1)，phosphorylated AQP9(p－AQP9，B2)to β－actin ratio and the ratio of p－AQP9 to AQP9(B3).A:Lane 1 －5，AsRE cells treated with NaAsO20，2.5，5，10 and 20 μmol·L －1;lanes 6 －10，ECV－304 cells treated with NaAsO20，2.5，5，10 and 20 μmol·L －1 .±s，n=3.*P＜0.05，＊＊P＜0.01，compared with NaASO20 μmo·lL－1in the same cell line.

Fig.5 Effect of NaAsO28 μ mol·L －1for 0 －8 h on protein and phosphorylation level of AQP9 in AsRE and ECV－304 cells by Western blotting.The graph represents the densitometry measurement of the AQP9 to β－actin ratio(B1)，p－AQP9(B2)to β－actin ratio and the p－AQP9 to AQP9 ratio(B3).A:Lanes 1－5，AsRE cells were cultured with NaAsO2 8 μmol·L －1for 0，0.5，1，2，4 and 8 h;lanes 6 －10，ECV－304 cells were cultured with NaAsO28 μmo·lL－1for 0，0.5，1，2，4 and 8 h.±s，n=3.*P＜0.05，＊＊P＜0.01，compared with 0 h in the same cell line.

如圖 6所示，NaAsO2處理后，AsRE和ECV－304細胞株中p38蛋白表達水平無明顯變化。ECV－304細胞中隨砷的濃度增加略有增加，磷酸化p38(p－p38)/p38值也同樣上升(圖6)。不同處理時間結果顯示(圖7)，AsRE和ECV－304細胞中p－p38水平都顯著上升，p－p38/p38比值同樣顯著地增加(P＜0.05)。提示在哺乳動物細胞中，p38的磷酸化與AQP9的磷酸化存在一定的聯系，但是否起主要作用還需要進一步實驗證實。

Fig.6 Effect of NaAsO2on protein and phosphorylation levels of p38 in AsRE and ECV304 cells by Western blotting.See Fig.4 for cells treatment.The bar graph represents the densitometry measurement of the p38 of β－actin ratio(B1)，phospho－p38(p－p38)to β－actin ratio(B2)and the ratio of p－p38 to p38(B3).A:Lanes 1 －5，NaAsO20，2.5，5，10 and 20 μmol·L －1in AsRE cells;lanes 6 －10，NaAsO20，2.5，5，10 and 20 μmol·L －1in ECV－304 cells.±s，n=3.*P＜0.05，compared with NaAsO20 μmol·L －1in same cell line.

Fig.7 Effect of NaAsO28 μ mol·L －1for 0 －8 h on protein and phosphorylation level of p38 in AsRE and ECV－304 cells by Western blotting.The graph represents the densitometry measurement of the p38 to β－actin ratio(B1)，p－p38 to β－actin ratio(B2)and the ratio of p－p38 to p38(B3).A:Lanes 1 －5，AsRE cells were cultured with NaAsO28 μmol·L －1for 0，0.5，1，2，4 and 8 h;lanes 6 －10，ECV－304 cells were cultured with NaAsO28 μmol·L －1for 0，0.5，1，2，4 and 8 h.±s，n=3.*P＜0.05，＊＊P＜0.01，compared with 0 h in same cell line.

2.4 AQP9過量表達對細胞內砷攝入量的影響

如圖8和圖9所示，與轉染pcDNA3.1空載體的對照相比，轉染 AQP9的AsRE細胞(圖8)與ECV－304細胞中(圖9)砷的攝入量都明顯增加，但在NaAsO2同一濃度下，ECV－304細胞中砷的含量均顯著高于AsRE細胞(P＜0.05)。AsRE細胞在處理后10 h內，砷攝入量與時間基本成線性關系，10～20 h內砷攝入量增加平緩(圖8A)，而ECV－304細胞內砷攝入量基本隨時間增加而增加，沒有增加量減緩的趨勢(圖9)。這些結果提示，AsRE細胞對砷的耐受性可能與其能減緩砷的攝入量有關。

Fig.8 Effect of AQP9 overexpression(A)on As accumulation in AsRE cells(B).A:AsRE cells were transfected with pcDNA3.1 plasmid(lane 1)and pcDNA3.1/AQP9(lane 2)and detected by Western blotting.B:AsRE cells treated with NaAsO28 μmol·L －1for 2，4，6，8，10 and 20 h.±s，n=3.*P＜0.05，＊＊P＜0.01，compared with AsRE cells transfected with pcDNA3.1 at same time point.

Fig.9 Effect of AQP9 overexpression(A)on As accumulation in ECV－304 cells(B).A:ECV－304 cells were transfected with pcDNA3.1 plasmid(lane 1)and pcDNA3.1/AQP9(lane 2)and detected by Western blotting.B:ECV－304 cells treated with NaAsO2 8 μmo·lL－1for 2，4，6，8，10 and 20 h.±s，n=3.*P＜0.05，compared with ECV－304 cells transfected with pcDNA3.1 at the same time point.

3 討論

進入細胞是砷毒性發(fā)揮作用的關鍵一步，闡明砷的進入細胞機制對于砷的防治或臨床應用具有重要意義。自然界中的砷以不同價態(tài)形式存在，其中以三價的無機砷毒性最高。起初研究者發(fā)現在原核生物中砷的入胞主要依靠磷酸轉運器[13－14]。后來發(fā)現在真核生物中AQPs家族成員在砷的入胞中發(fā)揮通道作用。如酵母中甘油促進蛋白的同源物Fps1p的分布與對 As(III)和 Sb(III)的抗性相關[4，15]。而在哺乳動物中，AQP9 被認為在調節(jié)砷的入胞中扮演了重要角色[3－7]。本文研究了水通道蛋白AQP9 mRNA表達水平、蛋白表達及其磷酸化水平與細胞砷抗性之間的關系，并初步探討了調控AQP9磷酸化的分子。研究發(fā)現，AQP9蛋白的磷酸化水平與細胞砷耐受性密切相關，而p38是否調控AQP9磷酸化還需進一步實驗證實。前期實驗中我們通過低濃度NaAsO2誘導ECV－304細胞，得到一個具有較強砷耐受性的細胞AsRE[11]。本實驗中我們首先檢測了砷對這兩個具有不同耐受性的細胞株的毒性作用，發(fā)現經過抗性誘導的AsRE細胞株其存活率顯著高于ECV－304細胞株，而且對砷的攝入量顯著低于ECV－304細胞。表明經過低濃度砷誘導的細胞確實對砷的耐受性增強。而且AsRE細胞中用砷處理4h后砷攝入量幾乎不再增加。Lee等[16]報道，來源于人肺腺瘤細胞株 CL3的砷抗性細胞R15對砷的攝入量也顯著低于CL3。這些研究均提示通過抑制砷進入細胞來降低細胞內砷含量是其產生耐受性的原因之一。

許多研究表明，AQP9 mRNA表達水平與細胞對砷的敏感性有關。如急性早幼粒細胞白血病細胞株NB4中AQP9的表達量最高，其對As2O3也最為敏感，而慢性粒細胞白血病細胞株K562中內源AQP9表達量低，對As2O3也最不敏感。如果在K562細胞株中過量表達AQP9，則對As2O3也表現出高度敏感性[17]，而且這種敏感性與高水平的砷攝入有關[5]。最近研究發(fā)現，在與羊膜細胞相比砷敏感性更高的絨毛膜細胞中AQP9的表達水平也更高[18]，說明AQP9的表達與細胞對砷的敏感性相關。本研究也發(fā)現，砷耐受性高的AsRE細胞其AQP9 mRNA表達水平隨NaAsO2濃度增加明顯下調，較為敏感的ECV－304細胞中mRNA表達水平也隨濃度有所下降，但下調的幅度沒有AsRE細胞大。結合砷的攝入實驗，似乎可以看到砷耐受性更高的AsRE細胞有一個砷攝入的飽和閾值，一旦達到此閾值，細胞可能會通過下調AQP9的表達來降低砷的攝入。

有關依賴于AQP9通道蛋白的砷攝入，對于參與的信號蛋白和轉錄調節(jié)因子以及調控機制目前所知甚少。2003年Arima等[19]曾報道p38 MAPK信號分子能調節(jié)AQPs的表達。而發(fā)現這幾者之間關聯性最直接的證據是在酵母中p38 MAPK的同源物Hog1p的表達增加能提高細胞的耐受性，同時證實細胞內砷的攝入依賴于AQP9的同源物Fps1p。Hog1p通過自身的磷酸化來調節(jié)Fps1p的磷酸化，從而調節(jié)細胞對砷的敏感性[8]。本研究發(fā)現AQP9的蛋白水平在砷耐受性高的AsRE細胞中隨NaAsO2濃度的增加而降低，這與其基因表達水平是一致的，而且其磷酸化表達量維持在一個較高的水平。在ECV－304細胞中，AQP9的蛋白水平隨NaAsO2濃度的增加略有增加，但其磷酸化水平隨濃度上升而明顯上調。這些表明AQP9的磷酸化水平在對砷耐性受不同的細胞中都會有所增加，而AsRE細胞可能是由于此細胞之前就受過低濃度砷的誘導，其磷酸化水平已經達到一個較高的水平，提示在哺乳動物細胞中AQP9的磷酸化與砷的攝入之間也存在一定的關系。最近研究發(fā)現，在中性粒細胞中AQP9定位于膜上可能依賴于其磷酸化作用，且可能被依賴于Rac－1的信號通路所調控。因此AQP9的磷酸化可能導致其更多定位于細胞膜上，從而影響了砷的攝入。Rac－1信號因子處于外界刺激所誘導的信號途徑的上游，其下游為MAPK激酶，包括 p38蛋白激酶。AsRE細胞中AQP9表達水平無明顯變化，而其磷酸化水平增加，推測砷的刺激也導致細胞內AQP9向磷酸化方向轉化，未磷酸化水平降低，甚至可能改變其在膜上的分布，因此影響其對砷的攝入，此推論將在后續(xù)工作中進行驗證。而實驗中也發(fā)現p38蛋白表達水平在ECV－304和AsRE細胞中表達量幾乎沒有顯著的變化，因此推測p38可能并不是此信號傳導途徑上調控AQP9磷酸化的主要因子，可能還存在別的蛋白激酶能夠導致AQP9的磷酸化水平上調。這與Thoren等的報道是一致的，其研究結果也表示在酵母中p38的同源物Hog1p可能不止是激活AQP9的同源物Fps1p磷酸化的唯一原因。因此尋找此途徑中最為關鍵的調節(jié)AQP9磷酸化水平的蛋白因子，也是以后的研究方向。

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