王曉楠，關(guān) 華，周平坤，蔡 耘，3，錢小紅

(1.北京工業(yè)大學生命科學與生物工程學院分子蛋白質(zhì)組研究室，北京 100124;2.軍事醫(yī)學科學院放射與輻射醫(yī)學研究所，北京 100405;3.北京蛋白質(zhì)組研究中心，北京 102206)

隨著科學技術(shù)的現(xiàn)代化，輻射與人們工作與生活聯(lián)系更加緊密，在合理開發(fā)和利用資源的同時，也需要對過量的輻射進行有效地防護與治療。Jansson等[1]發(fā)現(xiàn)，天然化合物香草醛(香蘭素，vanillin)作為食品添加劑不但對機體和培養(yǎng)細胞安全無毒[1]，而且能夠抑制X線、γ線和紫外線誘導的染色體畸變，減輕 DNA 損傷[2－5]，但其抗輻射作用的濃度相對較高，活性偏低[6]。據(jù)此，在前期研究的基礎(chǔ)上篩選出毒性低、輻射防護作用更好的香草醛衍生物丁香醛(3，5-二甲氧基-4-羥基苯甲醛，syringaldehyde，4-hydroxy-3，5-dimethoxybenzaldehyde，VND3207)。

VND3207作為一種香草醛衍生物，具有防護高能粒子輻射損傷的抗輻射作用。藥效學研究表明，VND3207能夠穩(wěn)定細胞基因組，減輕和修復α/γ射線誘導的DNA原初損傷，并對細胞凋亡具有良好的防護作用，而且在100倍的有效濃度下(0.5 mmol·L－1)幾乎沒有明顯的細胞毒性，照射前和照射后給藥均有效[6－7]。其藥理作用機制可能與清除輻射產(chǎn)生的自由基并激活Akt信號通路有關(guān)[8]。VND3207作為防護電離輻射損傷的抗輻射新藥，需要對其藥代動力學性質(zhì)進行研究，為藥物的安全性和有效性提供理論基礎(chǔ)和科學依據(jù)。因此，本研究建立了一種快速、準確、靈敏、專屬的液質(zhì)聯(lián)用定量分析方法，用以同時測定大鼠血漿樣品中原型藥物VND3207及其代謝產(chǎn)物的濃度，并按照藥代動力學定量分析的要求，對上述方法進行了相應(yīng)的方法學確證。將該方法應(yīng)用于VND3207臨床前藥代動力學研究，闡明了VND3207及其代謝產(chǎn)物丁香酸和丁香醇在大鼠體內(nèi)的藥代動力學過程和參數(shù)，并為丁香酸具有活性代謝物的潛質(zhì)提供了理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試劑

香草醛標準品，批號:20111011，純度＞99%;VND3207標 準品，批 號:20110805，純 度＞99.98%，均由軍事醫(yī)學科學院放射與輻射醫(yī)學研究所提供;3，5-二甲氧基-4-羥基苯甲酸，又名丁香酸(syringic acid)標準品，批號:110905，純度＞98%，購自北京偶合科技有限公司;3，5-二甲氧基-4-羥基苯甲醇，又名丁香醇(syringic alcohol)標準品，批號:10119558，純度＞97%，購自美國 ALFA化學試劑公司，化學結(jié)構(gòu)見圖1。乙腈，色譜純和依地酸(乙二胺四乙酸)二鉀，購自Sigma-Aldrich公司。純凈水，購自娃哈哈公司。甲酸，質(zhì)譜分析純，購自Fluka公司。羧甲纖維素鈉，化學純，購自國藥集團化學試劑有限公司。

Fig.1 Chemical structures of VND3207(A)，syringic acid(B)，syringic alcohol(C)and vanillin(D).

1.2 儀器

4000 Q TRAP PLC/MS/MS Systems三級四級桿-離子阱混合型質(zhì)譜儀，配有電噴霧(ESI)離子源和Analyst 1.5數(shù)據(jù)處理軟件，購自美國Applied Biosystems公司;1260 Infinity型高效液相色譜儀(G1312C二元梯度泵、G1322A在線真空脫氣機、G1367E WPS自動進樣器、G1330B控溫模塊和G1316A柱溫箱)，購自美國Agilent Technologies公司;Model 11 Plus注射泵，購自美國 Harvard Apparatus公司;Sorvall Legend Micro 17型離心機，購自美國Thermo Scientific公司;3K30臺式高速冷凍離心機，購自德國 Sigma公司;SANANT SPD 2010 Speed Vac濃縮儀，購自美國Thermo Scientific公司。

1.3 動物、給藥及血樣采集

健康 SD大鼠6只，SPF級，雄性，體質(zhì)量210～230 g，分籠用標準飼料喂養(yǎng)，自由飲水，由北京軍事醫(yī)學科學院實驗動物中心提供，動物許可證號:SCXK-(軍)2007-004。用0.5%羧甲纖維素鈉水溶液配成VND3207混懸液給藥，空腹 ig給予0.7 ml，VND320770 mg·kg－1。分別于給藥前和給藥后1，5，10，15，25，40 min，1，1.5，2，3，4，6，8和 12 h 大鼠尾靜脈采集全血 0.5 ml，20 μl 2%EDTA水溶液抗凝，1858×g離心10 min取上清液，血漿保存于－80℃待測。

1.4 標準曲線及質(zhì)控樣品的配制

用乙腈-水(1∶1，V/V)分別配制 VND3207，丁香酸，丁香醇和香草醛儲存液，然后將VND3207，丁香酸，丁香醇儲存液按比例混合，用乙腈-水(1∶1，V/V)稀釋成濃度為:0.01，0.02，0.1，0.5，2.5，5和10 mg·L－1的溶液作為標準曲線工作液，香草醛用乙腈-水(1∶1，V/V)配制成 1 mg·L－1的溶液作為內(nèi)標工作液。最后將20 μl樣品工作液和10 μl內(nèi)標工作液加入到80 μl空白血漿中，配制成濃度為2，4，20，100，500，1000 和2000 μg·L－1的血漿樣品作為標準曲線。采用VND3207、丁香酸和丁香醇4，100 和 1000 μg·L－1為質(zhì)控樣品，進行方法學確證。

1.5 血漿樣品預處理

標準曲線血漿樣品，質(zhì)控血漿樣品和待測血漿樣品各取 100 μl，分別加入 10 μl內(nèi)標工作液和300 μl乙腈沉淀蛋白，渦旋震蕩 1 min，15000 × g離心10 min，取350 μl上清液常溫濃縮，移除全部溶劑，然后加入 30 μl甲酸-乙腈-水(0.1∶5∶95，V/V)重溶樣品，渦旋震蕩1 min，15000×g離心5 min，取上清液10 μl進行定量分析。

1.6 HPLC-MS/MS法測定 VND3207及其代謝產(chǎn)物的血藥濃度

1.6.1 色譜條件

色譜柱為 Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18column(2.1 mm ×50 mm，5 μm);流動相 A 為甲酸-水溶液(0.1∶100，V/V)，流動相 B 為甲酸-乙腈溶液(0.1∶100，V/V)，流速 400 μl·min－1，流動相(A∶B)洗脫梯度 0～0.5 min，95∶5～20∶80;0.5～2.5 min，20∶80～5∶95;2.5～3.5 min，5∶95;3.5～4 min，5∶95～95∶5，4～9 min，95∶5其中樣品洗脫時間為4 min，色譜柱平衡時間為5 min，柱溫為室溫。

1.6.2 質(zhì)譜條件

ESI離子源，掃描方式為正離子多反應(yīng)監(jiān)測(MRM)。定性離子反應(yīng)分別為質(zhì)荷比(mass-tocharge，m/z)183.0→123.1(VND3207)，m/z 199.0→155.1(丁香酸)，m/z 167.1→123.1(丁香醇)，m/z 153.1→125.1(內(nèi)標);定量離子反應(yīng)分別為 m/z 183.0→155.1(VND3207)，m/z 199.0→140.1(丁香酸)，m/z 167.1→78.1(丁香醇)，m/z 153.1→93.0(內(nèi)標);駐留時間為200 ms;碰撞氣壓力N2為設(shè)為“Medium”;氣簾氣壓力為20 psi;氣體1壓力為65 psi;氣體2壓力N2為50 psi;離子噴霧電壓為5500 V;溫度為650℃;入口電壓為10 psi;出口電壓為10 psi;去簇電壓為45 V(m/z 183.0→123.1，183.0→155.1，153.1→93.0)，57 V(m/z 199.0→155.1，199.0→140.1)，47 V(m/z 167.1→123.1，167.1→78.1)，50 V(m/z 153.1→125.1);碰撞電壓為 15 V(m/z 183.0→123.1，153.1→93.0)，19 V(m/z 183.0→155.1)，13V(m/z 199.0→155.1)，20V(m/z 199.0→140.1)，22V(m/z 167.1→123.1，167.1→78.1)，15 V(m/z 153.1→125.1)。

1.6.3 HPLC-MS/MS法測定VND3207及其代謝產(chǎn)物的方法學考察

以VND3207、丁香酸和丁香醇的色譜峰面積與內(nèi)標峰面積比為縱坐標(Y)，以VND3207、丁香酸和丁香醇的質(zhì)量濃度與內(nèi)標質(zhì)量濃度比為橫坐標(X)，權(quán)重因子為 1/X2，進行線性回歸，得VND3207、丁香酸和丁香醇的標準曲線回歸方程。

用大鼠空白血漿配制VND3207、丁香酸和丁香醇4，100，1000 μg·L－1質(zhì)控樣品，每個濃度進行5樣本分析，連續(xù)測定3 d，計算準確度、日內(nèi)精密度與日間精密度。

分別用空白血漿和空白基質(zhì)配制VND3207、丁香酸和丁香醇4，100 和1000 μg·L－1的質(zhì)控樣品，每個濃度進行5樣本分析，根據(jù)基質(zhì)加入前后和樣品提取前后質(zhì)譜信號響應(yīng)的色譜峰面積比，計算基質(zhì)效應(yīng)與提取回收率。

用大鼠空白血漿配制VND3207、丁香酸和丁香醇4，100 和1000 μg·L－1的質(zhì)控樣品，每個濃度進行5樣本分析，分別考察VND3207、丁香酸和丁香醇4，100 和1000 μg·L－1在 10℃自動進樣器中放置6 h;血漿樣品在室溫放置3 h、血漿樣品在－80℃冷凍保存30 d、血漿樣品反復凍融2次以及血漿樣品4℃冷藏保存35 d的穩(wěn)定性。

1.7 統(tǒng)計學分析

標準曲線回歸方程由權(quán)重1/X2最小二乘法校正求得。血藥濃度的擬合計算由Analyst 1.5數(shù)據(jù)處理軟件完成。血藥濃度-時間數(shù)據(jù)及藥代動力學參數(shù)的計算由Office Excel 2007軟件完成，相關(guān)圖表由Orign 6.0軟件繪制。

2 結(jié)果

2.1 HPLC-MS/MS的方法學驗證

2.1.1 VND3207、丁香酸和丁香醇的專屬性與特異性

根據(jù)VND3207、丁香酸、丁香醇和內(nèi)標的一級和二級全掃描質(zhì)譜結(jié)果，分別確定定性和定量離子對。VND3207、丁香酸、丁香醇和內(nèi)標的色譜峰保留時間分別為 2.79，2.68，2.60 和 2.78 min，表明VND3207、丁香酸和丁香醇不受血漿內(nèi)源物質(zhì)干擾，本方法具有一定專屬性與特異性。

2.1.2 VND3207、丁香酸和丁香醇的校正標準曲線

VND3207、丁香酸和丁香醇定量標準曲線線性范圍為2～2000 μg·L－1，標準曲線回歸方程分別為Y=0.00541X+0.0108(r=0.9918)，Y=0.00157X+0.00231(r=0.9980)，Y=0.000294X+0.000442(r=0.9955)，最低定量下線均為2 μg·L－1。

2.1.3 VND3207、丁香酸和丁香醇的準確度與精密度

VND3207、丁香酸和丁香醇 4，100和1000 μg·L－1定量的準確度在 91.2%～110.7% 之間，日內(nèi)和日間精密度CV＜15%，方法的準確度和精密度均符合生物樣品血藥濃度分析的要求。

2.1.4 基質(zhì)效應(yīng)與提取回收率

表1結(jié)果表明，基質(zhì)對VND3207和內(nèi)標的質(zhì)譜信號響應(yīng)有增強作用，對丁香酸和丁香醇的質(zhì)譜信號響應(yīng)有抑制作用。采用乙腈蛋白沉淀法處理血漿樣品提取回收率較高，除 VND32074 μg·L－1提取回收率為(68.7±4.1)%外，VND3207，丁香酸和丁香醇的提取回收率均＞92%，均CV＜15%。

Tab.1 MatrixeffectandrecoveryofVND3207，syrangic acid and syringic alcohol in plasma of rats

2.1.5 穩(wěn)定性

如表2所示，VND3207、丁香酸和丁香醇4，100和 1000 μg·L－1在 10℃自動進樣器中放置 6 h;血漿樣品在室溫放置3 h、血漿樣品在－80℃冷凍保存30 d血漿樣品反復凍融2次以及準確度均在(87.5±9.4)%～(117.6±5.7)%(－80℃保存30 d丁香醇除外)。受試品4，100 和1000 μg·L－1質(zhì)控樣品定量分析的濃度分別為VND3207:3.8±0.1，105.1±2.6 和(932.2±20.3)μg·L－1，丁香酸:3.9±0.7，94.5±3.2 和(919.4±40.0)μg·L－1，丁香酸:4.1±0.3，103.3±3.1 和(957.5±34.0)μg·L－1;準確度均在 (91.1±3.3)%～(105.3±2.6)%以上穩(wěn)定性的考察能夠覆蓋樣品從采集到檢測的時間，由檢測結(jié)果分析，血漿樣品在－80℃冷凍保存30 d后VND3207具有較好的穩(wěn)定性，而丁香醇的含量明顯降低，丁香酸的含量有所增高，因此應(yīng)在血漿樣品采集后盡快進行檢測，不易長期保存。

Tab.2 Stability of VND3207，syringic acid and syringic alcohol in plasma of rats

2.2 VND3207及其代謝產(chǎn)物的血藥濃度和藥代動力學

測定大鼠單次 ig給予VND320770 mg·kg－1后1，5，10，15，25，40 min，1，1.5，2，3，4，6，8和12 h血漿中VND3207及其代謝產(chǎn)物丁香酸和丁香醇的平均血藥濃度-時間曲線(圖2)，計算藥代動力學參數(shù)(表3)。

血漿中原型藥物VND3207及其代謝產(chǎn)物丁香酸和丁香醇分別于3.2，13.3 和6.8 min達到最大峰濃度 1.44±0.88，28.82±12.23 和(0.33±0.14)mg·L－1，清除半衰期分別為 78.0±44.6，114.4±17.9 和(66.0±23.8)min，平均駐留時間分別為31.5±10.2，85.5±21.4 和 (39.5±7.7)min，VND3207在體內(nèi)吸收和消除的速率快，體內(nèi)駐留時間短。

Fig.2 Concentration-time profiles of VND3207(A)，syringic acid(B)and syringic alcohol(C)in plasma of rats.VND320770 mg·kg－1was ig given rats，and blood samples were collected and VND3207，syringic acid，and syringic alcohol concentrations in plasma were determined by HPLC-MS/MS.±s，n=6.

Tab.3 Pharmacokinetic parameters of VND3207，syringic acid and syringic alcohol in rat plasma after VND320770 mg·kg －1was ig given to rats

3 討論

VND3207作為防護電離輻射損傷的抗輻射新藥，對其藥代動力學進行研究具有重要意義。在本研究中，首先對比了固相萃取法[9－10]，乙酸乙酯萃取法[11]，環(huán)己烷萃取法[12]和乙腈蛋白沉淀法對復雜基質(zhì)樣品中香草醛衍生物的提取效率。結(jié)果表明，乙腈蛋白沉淀法具有較好的提取特異性和較高的提取回收率，且成本低、操作簡便，因此，采用乙腈蛋白沉淀法作為血漿樣品制備方法。參考香草醛衍生物液質(zhì)聯(lián)用分析方法的相關(guān)文獻報道[13－14]，優(yōu)化了不同流動相的組成、配比、pH值、流速、洗脫梯度等色譜條件，最終獲得最佳的色譜峰形和檢測靈敏度。

在此基礎(chǔ)上，本實驗室開展了VND3207及其代謝產(chǎn)物的藥代動力學初步研究。結(jié)果表明，大鼠口服給藥后VND3207被機體快速吸收，而達到血液循環(huán)的藥量明顯低于給藥劑量，同時在血漿中檢測到大量VND3207的氧化代謝產(chǎn)物丁香酸和少量的還原代謝產(chǎn)物丁香醇?？赡苁怯捎赩ND3207從胃腸道吸收后經(jīng)過門靜脈進入肝，在肝豐富的酶系作用下產(chǎn)生原藥的首過效應(yīng)，從而將大量的VND3207氧化為代謝物丁香酸。與原型藥物VND3207相比，丁香酸在大鼠體內(nèi)的AUC較高，T1/2和MRT時間更長、cmax濃度更大，前期藥效學研究也發(fā)現(xiàn)，實驗動物在被照射前30 min口服給予VND3207，仍具有較好的抗輻射作用，而口服給藥25 min后VND3207的血藥濃度已降為(105.1±64.6)μg·L－1，遠比代謝產(chǎn)物丁香酸(23416.7±11193.3)μg·L－1的血藥濃度低，因此，推測代謝產(chǎn)物丁香酸極有可能成為潛在的活性代謝物。由于丁香酸在大鼠體內(nèi)的暴露量大于原藥暴露量的10%，因此，對其藥效學活性和藥動學評價的相關(guān)研究工作已經(jīng)開展，實驗結(jié)論有待確定。

本實驗首次建立了同時準確測定大鼠血漿中VND3207及其代謝產(chǎn)物的液質(zhì)聯(lián)用定量分析方法，并將該方法應(yīng)用于VND3207及其代謝產(chǎn)物的藥代動力學研究。初步的研究結(jié)果對新藥研發(fā)過程中給藥劑量的確定，藥物制劑的研究，藥物代謝途徑的探討等都具有參考價值。

致謝:感謝軍事醫(yī)學科學院微生物流行病研究所藥學研究室程遠國研究員協(xié)助完成動物實驗。

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