林 琳，程曉東，傅真富

(1.浙江大學(xué)校醫(yī)院婦科，浙江杭州 310058;2.浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬婦產(chǎn)科醫(yī)院，浙江杭州 310006;3.浙江省腫瘤醫(yī)院，浙江杭州 310022)

卵巢癌是嚴(yán)重威脅婦女健康的惡性腫瘤之一，其早期診斷比較困難，大約75%的患者診斷時已處于中晚期，所以化學(xué)治療是卵巢癌的主要手段，雖然近年來化療方案的不斷改進(jìn)，但其5年生存率卻一直徘徊在25%～30%，原發(fā)性或繼發(fā)性耐藥是其化療成功的主要阻礙[1－2]。微小 RNA(microRNA，miRNA)是近年來發(fā)現(xiàn)的一類長17～25個核苷酸的內(nèi)源性非編碼小RNA，其與靶點(diǎn)mRNA的非翻譯區(qū)域 (untranslated regions，3'UTR)區(qū)結(jié)合，誘導(dǎo)靶mRNA的降解或抑制翻譯[3]。miRNA是目前已知的最大一類調(diào)節(jié)基因，其在細(xì)胞的生長、增殖、分化、凋亡和個體的發(fā)育中發(fā)揮著重要作用，最近的研究表明，miRNA參與了許多癌癥的發(fā)生發(fā)展[4]，例如miR-21，miR-155，miR-373等發(fā)揮著癌基因的作用，而 miR-148a，let-7，miR-15a，miR-143，miR-34，miR-16等發(fā)揮著抑癌基因作用，并且最近已有 miRNA 用 于 治 療 惡 性 腫 瘤 的 報 道[5－6]。miR-130b是一個新發(fā)現(xiàn)的miRNA，已有研究顯示其通過調(diào)節(jié)抑癌基因RUNX3的活性抑制胃癌的發(fā)生[7]，并且在卵巢癌細(xì)胞中干擾miR-130b表達(dá)可以誘導(dǎo)細(xì)胞的耐藥[8]。

多梳基因-1(Bmi-1)為多梳組基因(polycomb group genes，PcG)家族成員之一，是近年來新發(fā)現(xiàn)的一個癌基因，參與鼻咽癌、乳腺癌、肺癌和膀胱癌等多種人類腫瘤的發(fā)生和發(fā)展，Bmi-1主要是下調(diào)細(xì)胞周期的抑制基因p16和p19表達(dá)，加速細(xì)胞G1/S期的過渡，從而導(dǎo)致細(xì)胞惡性克隆性增生[9－10]。

本研究觀察了卵巢癌OVCAR細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-130b基因片段后卡鉑對其敏感性的改變，并探討了轉(zhuǎn)染miR-130b基因片段對Bmi-1蛋白表達(dá)的影響。

1 材料與方法

1.1 試劑及主要儀器

卵巢癌OVCAR細(xì)胞購于美國ATCC細(xì)胞庫。青霉素、鏈霉素、四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT)和卡鉑為美國Sigma公司產(chǎn)品，胎牛血清購于杭州四季青生物工程材料有限公司，Lipofectiamine 2000購自廣州英韋創(chuàng)津公司，Trizol購自分子探針公司，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自大連寶生物公司，miRNA熒光定量PCR檢測試劑盒購自北京普博辛生物科技有限公司，miR-130b和內(nèi)參U6引物、miR-130b模擬物以及陰性對照由上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司合成，Bmi-1、GAPDH抗體和HRP標(biāo)記的兔抗鼠二抗購自美國Santa Cruz公司。7100熒光定量PCR儀為美國ABI公司產(chǎn)品。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

人卵巢癌上皮OVCAR細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清、青霉素 100 kU·L－1及鏈霉素 100 kU·L－1的RPMI 1640培養(yǎng)液中，培養(yǎng)條件為37℃，5%CO2。

1.3 細(xì)胞RNA轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)

OVCAR細(xì)胞接種于6孔板，細(xì)胞達(dá)到70%～80% 融合時，按照Lipofectiamine 2000轉(zhuǎn)染試劑盒說明書進(jìn)行基因轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)?；瘜W(xué)合成的miR-130b模擬物:5'-UCAAUUUGCAUUUCGAAGUUU-3'，陰性對照為:5'-UUCGUCAUACGGCCUUAUACU-3';48 h后收集細(xì)胞提取總RNA，進(jìn)行干擾效果的鑒定和相應(yīng)的實(shí)驗(yàn)。

1.4 細(xì)胞總RNA的提取及RT-PCR

收集細(xì)胞，每5×105～1×106個細(xì)胞加入1 ml Trizol，按照Trizol說明書操作，提取細(xì)胞總 RNA，按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書逆轉(zhuǎn)錄出cDNA第一鏈，用于后續(xù)的熒光定量PCR檢測。

1.5 熒光定量PCR擴(kuò)增檢測miR-130b的表達(dá)

按照試劑盒說明書加入Q-PCR混合物、引物，置入7100熒光定量PCR儀反應(yīng)。miR-130b正義引物:5'-CTCGGCAGTCAGGCGT-3'，反義引物:5'-GTCTCCGTCGCTTTCAGACGAT-3';內(nèi)參照U6正義引物:5'-CTCGTTCGGCAGCACA-3'，反義引物:5'-AACGCTTCACAATGTGCGT-3'。擴(kuò)增反應(yīng)條件:94℃預(yù)變性15 s，95℃ 30 s，60℃ 15 s擴(kuò)增40個循環(huán)，最后72℃延伸30 s。待測miRNA的表達(dá)量用2－△Ct表示，△Ct值=目的基因Ct值－內(nèi)參基因 Ct值[5]。

1.6 MTT檢測細(xì)胞存活

將處于對數(shù)生長期的正常對照組、miR-130b模擬物轉(zhuǎn)染組和陰性對照組OVCAR細(xì)胞分別接種到96孔板，12 h后加入對倍系列稀釋的卡鉑(100，50，25，12.5，6.25，3.12，1.56 和 0.78 μmol·L－1)作用68 h。不同處理的 OVCAR細(xì)胞，加入 20 μl MTT 0.5 g·L－1孵育 4 h，100 μl DMSO 溶解結(jié)晶，酶標(biāo)儀570 nm波長處測定吸光度(A)值，計算細(xì)胞存活抑制率(%)=(1－A用藥組/A對照組)×100%。每個濃度設(shè)3個復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。參照肖建初等[11]的方法使用 Bliss法計算半數(shù)抑制濃度(IC50值)。

1.7 Western印跡法檢測多梳基因-1蛋白的表達(dá)

收集正常對照組、miR-130b模擬物轉(zhuǎn)染組和陰性對照組OVCAR細(xì)胞，PBS洗滌2次，1×SDS上樣緩沖液裂解細(xì)胞，95℃ 10 min，12000×g離心10 min，取上清，8%～12%SDS-PAGE 膠電泳2 h，電轉(zhuǎn)移蛋白至PVDF膜，將PVDF膜浸潤在含5%脫脂奶粉的TBST中1 h，加入特異性一抗4℃過夜，加入HRP標(biāo)記的二抗室溫孵育1 h，最后加入發(fā)光底物X線曝光顯示目的蛋白條帶。蛋白條帶使用美國Bio-Rad公司生產(chǎn)的QuantityOne軟件進(jìn)行積分吸光度(IA)值分析，以目標(biāo)蛋白與內(nèi)標(biāo)的IA比值表示蛋白的相對表達(dá)量。

1.8 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 OVCAR細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-130b模擬物鑒定

熒光定量 PCR結(jié)果顯示，正常對照組、miR-130b模擬物轉(zhuǎn)染組和陰性對照組miR-130b表達(dá)的相對值分別為 0.22±0.08，0.46±0.12和0.23±0.10，miR-130b 模擬物轉(zhuǎn)染組miR-130b表達(dá)顯著高于正常對照組和陰性組(P＜0.01)，正常對照組和陰性組之間無統(tǒng)計學(xué)差異。說明轉(zhuǎn)染miR-130b模擬物的OVCAR細(xì)胞中miR-130b表達(dá)顯著增加，轉(zhuǎn)染成功。

2.2 轉(zhuǎn)染miR-130b模擬物對OVCAR細(xì)胞存活的影響

MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示(圖 1)，正常對照組、miR-130b模擬物轉(zhuǎn)染組和陰性對照組卡鉑對卵巢癌 OVCAR 細(xì)胞的 IC50值分別為 32.4±4.6，14.7±2.1和(31.4±4.2)μmo·lL－1，miR-130b模擬物轉(zhuǎn)染組顯著低于正常對照組和陰性對照組(P＜0.01)，說明上調(diào)miR-130b后可以顯著增加卡鉑對OVCAR細(xì)胞的敏感性，其敏感性約增加了2.21 倍。

2.3 轉(zhuǎn)染miR-130b模擬物對OVCAR細(xì)胞Bmi-1蛋白表達(dá)的影響

圖2結(jié)果顯示，正常對照組、miR-130b模擬物轉(zhuǎn)染組和陰性對照組Bmi-1蛋白條帶的IA值分別為0.75±0.16，0.21±0.12 和 0.77±0.18;與正常對照組相比，miR-130b模擬物轉(zhuǎn)染組Bmi-1蛋白的表達(dá)出現(xiàn)顯著降低(P＜0.01)，而陰性對照組 Bmi-1蛋白的表達(dá)則無顯著性改變。

Fig.1 Effectofmimic/miR-130b tranfection on OVCAR cell survival treated with carboplatin 0.78 －100 μ mol·L －1for 68 h by MTT assay.

Fig.2 Effect of miR-130b tranfection on expression of Bmi-1 by Western blotting.Lane 1:normal control cells;lane 2:mimic/miR-130b trasfected cells;lane 3:negative/miR-130b trasfected cells.

3 討論

miRNA模擬物是新近研發(fā)的一種可以刺激相應(yīng)靶miRNA過表達(dá)的化學(xué)合成物，目前已廣泛用于miRNA的過表達(dá)研究，給miRNA的功能研究帶來了極大的方便[12]。本研究中熒光定量PCR結(jié)果顯示，所使用的miR-130b模擬物可以成功上調(diào)miR-130b的表達(dá)，在miR-130b高表達(dá)的狀態(tài)下，檢測了卡鉑對卵巢癌OVCAR細(xì)胞的敏感性，結(jié)果顯示，miR-130b高表達(dá)可以顯著增加卡鉑對OVCAR細(xì)胞的毒性。化療是卵巢癌的主要治療方法之一，但是化療藥物的細(xì)胞毒性和耐藥性則是成功化療的主要障礙。上述結(jié)果提示，化療時聯(lián)用miR-130b有可能減少卡鉑的用量或者克服卡鉑的耐藥。

進(jìn)一步的研究顯示，miR-130b模擬物轉(zhuǎn)染組OVCAR細(xì)胞的Bmi-1蛋白出現(xiàn)了顯著的降低。已有研究顯示，Bmi-1在卵巢上皮性腫瘤中高表達(dá)，并且與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及預(yù)后密切相關(guān)，是卵巢癌患者獨(dú)立的預(yù)后指標(biāo)，并且細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果也顯示了基因沉默 Bmi-1后，可以顯著抑制卵巢癌細(xì)胞的生長[13－14]。由此推測，高表達(dá)的 miR-130b 可能是通過下調(diào)Bmi-1的表達(dá)增加了卡鉑對卵巢癌OVCAR細(xì)胞的敏感性，具體miR-130b調(diào)控Bmi-1的機(jī)制還有待進(jìn)一步的研究來闡明。另外，本研究僅僅是在細(xì)胞水平完成的實(shí)驗(yàn)，在體內(nèi)能否可以達(dá)到相似的效果，還有待進(jìn)一步的裸鼠移植瘤實(shí)驗(yàn)來證實(shí)。

綜上所述，高表達(dá)miR-130b可以增加卡鉑對卵巢癌細(xì)胞的敏感性，下調(diào)Bmi-1蛋白表達(dá)可能是其增敏作用的主要機(jī)制，提示miR-130b有望成為克服卵巢癌鉑類耐藥的新靶點(diǎn)。

[1]Clarke-Pearson DL. Clinicalpractice. Screening for ovarian cancer[J].N Engl J Med，2009，361(2):170-177.

[2]Pliarchopoulou K，Pectasides D.Epithelial ovarian cancer:focus on targeted therapy[J].Crit Rev Oncol Hematol，2011，79(1):17-23.

[3]Morozova N，Zinovyev A，Nonne N，Pritchard LL，Gorban AN，Harel-BellanA. KineticsignaturesofmicroRNA modes of action[J].RNA，2012，18(9):1635-1655.

[4]Bartel DP.MicroRNAs:target recognition and regulatory functions[J].Cell，2009，136(2):215-233.

[5]Farazi TA，Spitzer JI，Morozov P，Tuschl T.miRNAs in human cancer[J].J Pathol，2011，223(2):102-115.

[6]Sorrentino A，Liu CG，Addario A，Peschle C，Scambia G，F(xiàn)erlini C.Role of microRNAs in drug-resistant ovarian cancer cells[J].Gynecol Oncol，2008，111(3):478-486.

[7]Lai KW，Koh KX，Loh M，Tada K，Subramaniam MM，Lim XY，et al.MicroRNA-130b regulates the tumour suppressor RUNX3 in gastric cancer[J].Eur J Cancer，2010，46(8):1456-1463.

[8]Yang C，Cai J，Wang Q，Tang H，Cao J，Wu L，et al.Epigenetic silencing of miR-130b in ovarian cancer promotes the development of multidrug resistance by targeting colony-stimulating factor 1[J].Gynecol Oncol，2012，124(2):325-334.

[9]Park IK， Morrison SJ， Clarke MF. Bmi1，stem cells，and senescence regulation[J].J Clin Invest，2004，113(2):175-179.

[10]Hu ZH， Hu YD. Study condition of the relationship between BMI-1 gene and tumor[J].Chin J Cancer Prev Treat(中華腫瘤防治雜志)，2006，13(23):1824－1827.

[11]Xiao JC.A BASIC Program computing LD50with figure by bliss method[J].J Sun Yat-sen Univ(中山醫(yī)科大學(xué)學(xué)報)，1988，9(8):80-81.

[12]Zhou XC，Qiu LH.The effects of miRNA-7 on the invasion and proliferation of human ovarian cancer cell line HO-8910 and HO-8910pm cells[J].Prog Obstet Gynecol(現(xiàn)代婦產(chǎn)科進(jìn)展)，2012，21(5):332-336.

[13]Huang XX，Chen JW，Li M，Cao Y，Hou JH，Wu QL，et al.Expression of Bmi-1 in ovarian carcinoma and its clinicopathological significance[J].J Sun Yat-Sen Univ(Med Sci)〔中山大學(xué)學(xué)報(醫(yī)學(xué)科學(xué)版)〕，2010，31(6):852-866.

[14]Xin T，Zhang FB，Sui GJ，Jin XM.Bmi-1 siRNA inhibited ovarian cancer cell line growth and decreased telomerase activity[J].Br J Biomed Sci，2012，69(2):62-66.