胡成穆，曹 琦，解雪峰，劉洪峰，丁 琦，李 俊

(安徽醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院安徽天然藥物活性研究省級(jí)實(shí)驗(yàn)室，安徽合肥 230032)

酒精性脂肪肝(alcoholic fatty liver，AFL)是因長期、大量飲用乙醇類飲料所致的肝細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)蓄積超過肝濕重5%的肝損害性疾病。乙醇本身具有熱量，長期大量攝入，不僅損害脂肪氧化，還可刺激脂肪形成，引起脂質(zhì)代謝紊亂。肝由多種細(xì)胞組成，肝細(xì)胞在AFL的形成中起著至關(guān)重要的作用，營養(yǎng)過剩或某種物質(zhì)缺乏均可導(dǎo)致肝細(xì)胞損害[1]，而脂質(zhì)在肝細(xì)胞內(nèi)蓄積是所有肝疾病發(fā)病的先決條件[2]。

豹皮樟(Litsea coreana Leve)，又名老鷹茶，系樟科木姜子屬毛豺皮樟的嫩梢和葉片，是我國南方各民族民間長期飲用的一種植物代用茶，具有清涼止渴和解毒消腫等功效。豹皮樟中含有多種活性成分，經(jīng)本院天然藥物化學(xué)教研室提取分離鑒定，確定了豹皮樟的有效部位為總黃酮，分別鑒定為槲皮素-3-O-β-D-半乳糖苷、山柰酚-3-O-β-D-葡萄糖苷、槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖苷和山柰酚-3-O-β-D-半乳糖苷[3]，含量超過51.5%。前期研究表明，豹皮樟總黃酮 (total flavonoids of L.coreana Leve，TFLC)對(duì)AFL具有一定的保護(hù)作用[4]，為進(jìn)一步探討TFLC的作用機(jī)制，本研究以AFL大鼠肝灌流，分離培養(yǎng)肝細(xì)胞，觀察TFLC對(duì)肝細(xì)胞脂質(zhì)生成及脂肪分化相關(guān)蛋白(adipose differentiation-related protein，ADRP)和過氧化物酶體增殖物激活受體γ(peroxisome proliferators activated receptor γ，PPARγ)表達(dá)的影響。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物、藥品、試劑和儀器

Sprague-Dawley(SD)大鼠，雄性，體質(zhì)量160～200 g，安徽醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供(普通級(jí))，標(biāo)準(zhǔn)顆粒飼料喂養(yǎng)，合格證號(hào):皖醫(yī)實(shí)動(dòng)準(zhǔn)字第01號(hào)。TFLC由安徽醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院提取，使用時(shí)均研細(xì)后用無血清DMEM溶解后過濾滅菌;谷胱甘肽(glutathione，GSH)，上海源聚生物科技有限公司;DMEM培養(yǎng)基干粉，美國Gibco公司;Ⅳ型膠原酶和Trizol，美國Invitrogen公司;新生牛血清，杭州四季青公司;兔抗鼠ADRP多抗和鼠抗PPARγ單抗，美國Santa Cruz公司;HRP標(biāo)記的羊抗小鼠IgG和山羊抗兔IgG抗體，北京中杉金橋公司;丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶(alanine aminotransferase，ALT)和天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶(aspartate aminotransferase，AST)活性測(cè)定試劑盒，南京建成公司;甘油三酯(triglycerides，TG)含量測(cè)定試劑盒，北京福瑞生物工程公司;細(xì)胞角蛋白18(cytokeratin 18，CK18)抗體，北京博奧森公司;PCR逆轉(zhuǎn)錄試劑盒，美國 Promega公司。CO2恒溫培養(yǎng)箱，美國Shellab公司;多功能顯微鏡，日本Olympus公司;PCR儀9700，美國ABI公司。

1.2 AFL大鼠模型的制備、肝灌流和肝細(xì)胞分離

大鼠正常飼養(yǎng)1周后，自由飲用乙醇飲料(含18%蔗糖)，其乙醇濃度從5%開始，每個(gè)濃度維持1周，依次增加為 10%，15%，20%，25%，30%，35%至40%，40%持續(xù)至第12周;正常對(duì)照組攝正常飲食12周。造模12周體質(zhì)量為250～300 g的AFL大鼠6只，同期正常大鼠2只。按照Seglen的原位兩步灌流法[5]并稍加改動(dòng)分離肝細(xì)胞:大鼠禁食16 h，ip 10%水合氯醛麻醉，消毒，剖開腹腔，分離肝門靜脈，插麻醉導(dǎo)管并結(jié)扎，分離下腔靜脈插入另一根麻醉導(dǎo)管，灌注預(yù)溫37℃不含Ca2+和Mg2+的Hank液，灌注至下腔靜脈流出的液體變清時(shí)，開始灌注37℃預(yù)溫消化酶(0.05%Ⅳ型膠原酶)，在位灌流待肝變軟呈土黃色，表面呈現(xiàn)龜裂狀，壓之凹陷不易恢復(fù)，停止灌注。分離肝，移至超凈臺(tái)內(nèi)用無菌鑷撕開肝表面的包膜，抖落肝細(xì)胞，預(yù)冷的D-Hanks培養(yǎng)液制成肝細(xì)胞懸液，100目尼龍網(wǎng)篩濾去細(xì)胞團(tuán)塊及組織纖維，濾液4℃，34×g離心5 min，3次，完全DMEM(含10%血清)調(diào)整細(xì)胞濃度，制成5×108L－1的肝細(xì)胞懸液。

1.3 大鼠肝細(xì)胞的鑒定

CK18是成熟肝細(xì)胞的標(biāo)志，可用于鑒定肝細(xì)胞。取灌流獲取的肝細(xì)胞1×106L－1加入0.4%錐蟲藍(lán)(終濃度0.04%)，鏡下觀察，死細(xì)胞被染成明顯的藍(lán)色，活細(xì)胞拒染呈無色透明狀。細(xì)胞爬片，肝細(xì)胞培養(yǎng)48 h，4%多聚甲醛固定，3%H2O2滅活內(nèi)源性過氧化物酶，0.1%Triton X-100冰上破膜，血清封閉，一抗(兔抗大鼠CK18多克隆抗體1∶400)4℃過夜，二抗(HRP標(biāo)記山羊抗兔 IgG抗體1∶800)37℃濕盒1 h(避光)，DAB顯色，蘇木素復(fù)染，脫水，封片。

1.4 MTT法測(cè)定肝細(xì)胞存活

調(diào)整肝細(xì)胞密度為5×108L－1，接種至96孔板培養(yǎng)16 h后，正常大鼠肝細(xì)胞分為正常對(duì)照組、正常 +TFLC 1，10 和 100 mg·L－1組;AFL 大鼠肝細(xì)胞分為 AFL模型對(duì)照組、AFL+TFLC 1，10和100 mg·L－1及 AFL+GSH 10 mmol·L－1對(duì)照組，各設(shè)3個(gè)復(fù)孔，培養(yǎng)42 h，于每孔加入MTT溶液(5 g·L－1)20 μl，37℃繼續(xù)培養(yǎng) 4 h 后終止培養(yǎng)，吸棄上清，加 DMSO 150 μl，振蕩10 min，使甲臜顆粒充分溶解?？瞻譊MSO孔調(diào)零，酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀570 nm波長處測(cè)定每孔吸光度(A)值，求其平均值。

1.5 肝細(xì)胞ALT和AST活性測(cè)定

AFL細(xì)胞分為AFL模型組、AFL+TFLC 1，10和100 mg·L－1及 AFL+GSH 10 mmol·L－1組，正常大鼠肝細(xì)胞為正常對(duì)照組，于6孔培養(yǎng)板培養(yǎng)48 h，收集細(xì)胞培養(yǎng)液，參照試劑盒方法測(cè)定ALT和AST活性。

1.6 肝細(xì)胞內(nèi)TG含量測(cè)定

細(xì)胞分組同1.5。藥物作用48 h的細(xì)胞，棄上清，PBS細(xì)胞洗3遍，加入胰酶消化，收集細(xì)胞懸液，反復(fù)凍融裂解細(xì)胞，超聲細(xì)胞粉碎機(jī)裂解細(xì)胞2 min，離心取上清，按試劑盒說明書方法檢測(cè)上清中TG含量。

1.7 逆轉(zhuǎn)錄PCR法測(cè)定肝細(xì)胞ADRP和PPARγ mRNA表達(dá)

細(xì)胞分組同1.5。肝細(xì)胞與藥物作用48 h，Trizol一步法提取肝總RNA。按試劑盒說明書逆轉(zhuǎn)錄，ADRP引物序列，正義:5'-CTTGTGTCCTCCGCTTATGTCAGT-3';反 義:5'-CTGCTCCTTTGGTCTTATCCACCA-3'，349 bp。PPARγ 引物序列，正義:5'-ATTCTGGCCCACCAACTTCGG-3';反義:5'-TGGAAGCCTGATGCTTTATCCCCA-3'，339 bp。β 肌動(dòng)蛋白引物序列，正義:5'-CAGTAACAGTCCGCCTAGAA-3';反義:5'-GATTACTGCTCTGGCTCCTA-3'，175 bp。引物由上海生物工程技術(shù)公司合成。ADRP和PPARγ反應(yīng)條件分別為:57℃復(fù)性，37個(gè)循環(huán)和56℃復(fù)性，35個(gè)循環(huán)。瓊脂糖凝膠上電泳，紫外燈下觀察并掃描。凝膠成像系統(tǒng)對(duì)拍攝的照片進(jìn)行密度掃描，以目的基因條帶積分吸光度值對(duì)β肌動(dòng)蛋白積分吸光度值的比值表示目的基因mRNA相對(duì)表達(dá)水平。

1.8 免疫組化方法測(cè)定肝細(xì)胞ADRP和PPARγ蛋白表達(dá)

細(xì)胞分組同1.5。肝細(xì)胞與藥物作用48 h，4%多聚甲醛固定，3%H2O2滅活內(nèi)源性過氧化物酶，PBS洗3次，(PPARγ需0.1%Triton X-100冰上破膜)，PBS洗3次，血清封閉，一抗(兔抗鼠ADRP多抗1∶300，鼠抗 PPARγ 單抗1∶500)4℃過夜，PBS洗3次，二抗(HRP標(biāo)記山羊抗兔IgG和羊抗小鼠IgG抗體1∶800)37℃濕盒1 h(避光)，DAB顯色，蘇木素復(fù)染，脫水，封片。隨機(jī)選取5個(gè)視野，以胞膜和(或)胞質(zhì)出現(xiàn)明顯的棕黃色和(或)黃棕色顆粒的細(xì)胞為陽性細(xì)胞，計(jì)數(shù)陽性細(xì)胞百分?jǐn)?shù)。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 大鼠肝細(xì)胞的鑒定

常規(guī)錐蟲藍(lán)拒染法鑒定細(xì)胞活率在80%以上。光鏡下，正常肝細(xì)胞為圓形(圖1A)，細(xì)胞核位于細(xì)胞正中，可見到雙核的肝細(xì)胞。免疫細(xì)胞化學(xué)染色顯示，CK18陽性著色部位在胞核和胞漿，呈棕黃色顆粒(圖1B)。

Fig.1 Identification of primary cultured rat hepatocytes.A:hepatocytes cultured for 4 h(×100)，Trypan blue staining;B:hepatocytes immunochemistry stained with cytokeratin 18(CK18)antibody.

2.2 TFLC對(duì)正常和AFL大鼠肝細(xì)胞存活的影響

表1結(jié)果顯示，TFLC作用48 h對(duì)正常大鼠肝細(xì)胞存活無明顯影響。與正常大鼠肝細(xì)胞比較，AFL模型大鼠肝細(xì)胞存活減少(P＜0.05);與AFL模型大鼠肝細(xì)胞比較，TFLC 100 mg·L－1作用48 h能顯著增加AFL大鼠肝細(xì)胞存活(P＜0.05)，與GSH 10 mmol·L－1作用相當(dāng)。

Tab.1 Effect of total flavone of L.coreana(TFLC)on proliferation of hepatocytes in normal and alcoholic fatty liver(AFL)model rats

2.3 TFLC對(duì)AFL大鼠肝細(xì)胞培養(yǎng)液中ALT和AST活性的影響

如表2結(jié)果顯示，與正常大鼠肝細(xì)胞相比，細(xì)胞培養(yǎng)48 h的AFL模型大鼠肝細(xì)胞培養(yǎng)液中ALT和AST活性均明顯升高(P＜0.05);TFLC 10 和100 mg·L－1作用48 h可降低AFL大鼠肝細(xì)胞培養(yǎng)液中ALT和AST活性(P＜0.05)，與GSH 10 mmol·L－1作用相當(dāng)。

Tab.2 Effect of TFLC on activities of alanine aminotransferase(ALT)and aspartate aminotransferase(AST)in hepatocytes of AFL model rats

2.4 TFLC對(duì)AFL大鼠肝細(xì)胞內(nèi)TG含量的影響

由表3看出，與正常大鼠肝細(xì)胞比較，培養(yǎng)48 h的AFL模型大鼠肝細(xì)胞內(nèi)TG含量明顯增加(P＜0.05);TFLC 10 和100 mg·L－1作用48 h 可減少AFL大鼠肝細(xì)胞內(nèi)TG含量(P＜0.05)，與GSH 10 mmol·L－1作用相當(dāng)。

Tab.3 Effect of TFLC on content of triglycerides(TG)in hepatocytes of AFL model rats

2.5 TFLC對(duì)AFL大鼠肝細(xì)胞ADRP mRNA和蛋白表達(dá)的影響

與正常肝細(xì)胞相比，AFL大鼠肝細(xì)胞ADRP mRNA表達(dá)明顯增多(數(shù)據(jù)略)。如圖2所示，與AFL模型大鼠肝細(xì)胞相比，TFLC 10 mg·L－1作用48 h能明顯降低 ADRP mRNA表達(dá)(P＜0.05)，與GSH 10 mmol·L－1作用相當(dāng)。

Fig.2 Effect of TFLC on adipose differentiation-related protein(ADRP)mRNA expression in hepatocytes of AFL model rats.See Tab.1 for cell treatment.A:representative RT-PCR for ADRP expression.B:RT-PCR quantitative analysis result of A.IA:integrated absorbance.Lane 1:AFL model;lane 2:AFL+TFLC 10 mg·L －1;lane 3:AFL+glutathione 10 mmol·L －1.±s，n=3.*P＜0.05，compared with AFL model group.

由圖3和圖4看出，正常大鼠的肝細(xì)胞有少量ADRP陽性表達(dá)(圖3A)，AFL模型組ADRP陽性表達(dá)肝細(xì)胞明顯增多(P＜0.01)(圖3B)，AFL+TFLC 100 mg·L－1組(圖 3E)和 AFL+ 谷胱甘肽10 mmol·L－1組(圖3F)ADRP陽性表達(dá)細(xì)胞明顯減少(P＜0.01)。

Fig.3 Effect of TFLC on ADRP expression in hepatocytes of AFL model rats(SP).See Tab.1 for cell treatment.A:normal;B:AFL model;C － E:AFL+TFLC 1，10 and 100 mg·L －1;F:AFL+glutathione 10 mmol·L －1.Arrows show ADRP positive cells.

Fig.4 Effect of TFLC on ADRP protein expression in hepatocytes of AFL model rats .See Tab.1 for cell treatment.±s，n=3.＊＊P＜0.01，compared with normal group;##P＜0.01，compared with AFL model group.

2.6 TFLC對(duì)AFL大鼠肝細(xì)胞PPARγ mRNA和蛋白表達(dá)的影響

如圖5所示，與正常肝細(xì)胞相比，AFL大鼠肝細(xì)胞PPARγ mRNA表達(dá)明顯增多(數(shù)據(jù)略)。與AFL模型大鼠肝細(xì)胞相比，TFLC作用48 h能明顯降低AFL大鼠肝細(xì)胞PPARγ mRNA表達(dá)(P＜0.01)。

Fig.5 Effect of TFLC on peroxisome proliferator-activated receptorγ(PPARγ)mRNA expression in hepatocytes of AFL model rats.See Tab.1 for cell treatment.The intensity of PPARγ mRNA bands was normalized to that of β-actin.B was the semiquantitative result of A.Lane 1:AFL model;lane 2:AFL+TFLC 10 mg·L －1;lane 3:AFL+glutathione 10 mmol·L －1.±s，n=3.*P＜0.05，＊＊P＜0.01，compared with AFL model group.

如圖6和圖7所示，正常組肝細(xì)胞可見少數(shù)PPARγ陽性表達(dá)細(xì)胞，著色較淡(圖6A);模型組可見較多陽性表達(dá)細(xì)胞，胞核著色較深(圖6B)。與 AFL 模型組相比，AFL+TFLC 100 mg·L－1組(圖 6E)和 AFL+ 谷胱甘肽 10 mmol·L－1組(圖6F)PPARγ陽性表達(dá)肝細(xì)胞明顯減少(P＜0.05)，

表達(dá)程度降低。

Fig.7 Effect of TFLC on PPARγ protein expression in hepatocytes of AFL model rats.See Tab.1 for cell treatment.±s，n=3.＊＊P＜0.01，compared with normal group;#P＜0.05，compared with AFL model group.

3 討論

AFL是酒精性肝病(alcoholic liver disease，ALD)的早期階段，發(fā)展為肝纖維化和肝硬化的危險(xiǎn)性比單純性脂肪肝高。本研究以18%的蔗糖為溶媒，以濃度遞增的方式加入乙醇，讓大鼠逐漸適應(yīng)，建立AFL大鼠模型。慢性乙醇攝入可導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)動(dòng)物血脂水平增加，肝脂肪沉積[6]。

肝細(xì)胞具有豐富的酶系及多種特異性功能，體外培養(yǎng)用于藥理學(xué)研究具有許多優(yōu)點(diǎn)，在一定時(shí)間內(nèi)離體培養(yǎng)細(xì)胞具有體內(nèi)肝功能[7]。膠原酶二步灌流法[8]是目前原代肝細(xì)胞分離的常用方法，本研究經(jīng)適當(dāng)改進(jìn)后成功分離大鼠原代肝細(xì)胞。慢性乙醇攝入導(dǎo)致AFL大鼠肝細(xì)胞內(nèi)脂肪沉積，TG有不同程度增加。肝細(xì)胞損傷，增殖反應(yīng)下降，ALT和AST水平升高。

Fig.6 Effect of TFLC on PPARγ protein expression in hepatocytes of AFL model rats(SP).See Tab.1 for cell treatment.A:normal;B:AFL model;C－E:AFL+TFLC 1，10 and 100 mg·L－1;F:AFL+glutathione 10 mmol·L－1.↑:PPARγ positive cells.

ADRP，又名親脂素(adipophilin)，相對(duì)分子質(zhì)量為48 ku，是脂肪細(xì)胞早期分化及脂質(zhì)積聚的標(biāo)志。ADRP具有調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝的作用，可作為載體協(xié)助脂肪酸進(jìn)入細(xì)胞，濃度和時(shí)間依賴性地促進(jìn)長鏈脂肪酸的攝取。ADRP高表達(dá)可促進(jìn)細(xì)胞胞漿內(nèi)游離脂肪酸增多，增加肝TG的沉積，可使細(xì)胞內(nèi)的脂滴數(shù)目增多，體積增大。抑制ADRP的表達(dá)能增加脂肪酸的β氧化。ADRP反義寡核苷酸可減少肝的TG和甘油二酯水平，增強(qiáng)胰島素的作用[9]。免疫組化方法比油紅O染色技術(shù)對(duì)實(shí)驗(yàn)者要求更少，同時(shí)ADRP免疫組化方法比HE染色或油紅O染色更易發(fā)現(xiàn)微小脂滴，ADRP陽性表達(dá)可作為AFL形成的標(biāo)志[10]。

PPARγ是主要表達(dá)于脂肪、肝和骨骼肌等組織的核轉(zhuǎn)錄因子，其目標(biāo)基因直接參與脂肪細(xì)胞的分化成熟，并影響體內(nèi)脂肪的合成及蓄積。PPARγ可刺激前脂肪細(xì)胞分化為脂肪細(xì)胞，誘導(dǎo)肝細(xì)胞脂肪酸重新合成引起脂質(zhì)蓄積[11]，增加肝細(xì)胞的脂肪合成，并參與葡萄糖穩(wěn)態(tài)的調(diào)節(jié)[12]。ADRP作為PPARγ的目標(biāo)基因，表達(dá)增高可促進(jìn)PPARγ的表達(dá)和肝脂肪變性[13]。

本研究采用兩步灌流法獲取大鼠原代肝細(xì)胞，MTT方法檢測(cè)肝細(xì)胞活性。TFLC對(duì)正常肝細(xì)胞增殖反應(yīng)無明顯影響，但能增強(qiáng)AFL模型大鼠肝細(xì)胞增殖反應(yīng)，抑制AFL大鼠肝細(xì)胞ALT和AST活性，降低AFL大鼠肝細(xì)胞內(nèi)TG的含量。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，AFL大鼠肝細(xì)胞ADRP和PPARγ陽性表達(dá)細(xì)胞數(shù)增多，程度加重，TFLC干預(yù)后肝細(xì)胞ADRP和PPARγ陽性表達(dá)的細(xì)胞數(shù)和表達(dá)量均明顯減少。TFLC可減少肝細(xì)胞內(nèi)TG的沉積，對(duì)AFL大鼠肝細(xì)胞脂肪變性有抑制作用，可能與其改善肝細(xì)胞活性、調(diào)控肝細(xì)胞ADRP和PPARγ的表達(dá)、降低肝細(xì)胞TG的積聚有關(guān)。

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