李瑞婧，洪興福，季媛媛，孫震曉

(北京中醫(yī)藥大學中藥學院生物制藥系，北京 100102)

斑蝥素(cantharidin)是從中藥斑蝥(Mylabris)中提取的一種抗腫瘤活性成分，曾用于原發(fā)性肝癌等的治療，但由于對泌尿系統(tǒng)強烈的刺激作用，限制了其在臨床上的使用。去甲斑蝥素(norcantharidin，NCTD)系斑蝥素的結(jié)構同類物，是在對斑蝥素構效關系的研究基礎上，由呋喃及順丁烯二酸酐通過Diles-Alder反應催化加氫合成制得，是我國自行研制生產(chǎn)的新型抗腫瘤藥物。NCTD與斑蝥素相比，缺少1，2位上的兩個甲基，其毒性作用較低，基本消除了對泌尿系統(tǒng)的刺激性，保留了抗癌和升高白細胞的作用[1]，現(xiàn)臨床上主要用于肝癌等惡性腫瘤的治療[1－3]。

前期體外細胞毒研究發(fā)現(xiàn)，NCTD能夠誘導肝癌等腫瘤細胞發(fā)生有絲分裂期阻滯和細胞凋亡[4－6]。近年來，國內(nèi)外對NCTD的抗癌機制研究主要集中在闡明其誘導腫瘤細胞凋亡途徑上，如研究NCTD對腫瘤細胞凋亡信號通路中某些信號分子，如 Bcl-2、Bax、Bcl-xl、CD95、胱天蛋白酶 9、胱天蛋白酶3、絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases，MAPK)、核孤兒受體，即睪丸受體3(testicular receptor 3，TR3)等的影響[7－12]，而對NCTD引起的細胞周期阻滯機制及其與細胞凋亡的關系研究較少[13－15]。卵巢癌發(fā)生率近年成上升趨勢，死亡率高，特效藥少。目前，臨床上尚未使用NCTD治療卵巢癌，有關NCTD對卵巢癌細胞作用的研究工作少見報道。前期研究工作表明，人卵巢癌SK-OV-3細胞株為NCTD敏感細胞株，以其為研究對象，既可以深入研究NCTD的抗癌作用，如引起細胞發(fā)生G2/M期阻滯機制及其與細胞凋亡的關系，同時也為將來臨床上使用NCTD治療卵巢癌提供參考。

1 材料與方法

1.1 化合物、試劑及主要儀器

人卵巢癌SK-OV-3細胞株，購自中國醫(yī)學科學院細胞庫;胎牛血清和RPMI 1640培養(yǎng)基、青霉素與鏈霉素，購自美國 Gibco公司，胰蛋白酶、NCTD、碘化丙啶(propidium iodide，PI)，購自美國Sigma公司;山羊抗兔二抗Alexa Fluor 488、山羊血清購自美國Invitrogen公司;兔抗α微管蛋白，購自美國Epitomics公司，RNaseA，購自德國Merck公司，細胞凋亡檢測試劑盒，購自中國北京寶賽生物技術有限公司，其他如甲醇、Triton X-100、姬姆薩染料、二甲亞砜(DMSO)、四甲基偶氮唑藍(MTT)等為國產(chǎn)分析純試劑。

MCO-18AIC(UV)型飽和濕度培養(yǎng)箱為日本Sanyo公司產(chǎn)品;ECLIPSE TE2000-S型倒置顯微鏡為日本Nikon公司產(chǎn)品;Spectra Max190型酶標儀為美國Molecular Devices公司產(chǎn)品;Epics XL型流式細胞儀為美國Beckman Coulter公司產(chǎn)品;ZEISS 510 META型共聚焦顯微鏡為日本Olympus公司產(chǎn)品;TDL-50B型離心機為中國Anke公司產(chǎn)品。

1.2 NCTD溶液配制

以雙蒸水溶解并稀釋，NCTD配成60 mol·L－1貯存液，過濾除菌，分裝后－20℃貯存。每次臨用前新鮮解凍，使用時用RPMI 1640培養(yǎng)基稀釋母液至所需各濃度。

1.3 細胞培養(yǎng)

SK-OV-3細胞采用常規(guī)培養(yǎng)，在含l0%(V/V)滅活胎牛血清(FBS)、青霉素100 kU·L－1和鏈霉素100 mg·L－1的 RPMI 1640 培養(yǎng)液中，37℃，5%CO2的飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，2～3 d換液傳代1次，取對數(shù)生長期細胞進行相關實驗。

1.4 細胞形態(tài)學觀察[16－17]

取1.3培養(yǎng)的細胞，按照處理分為正常對照和NCTD 60 μmol·L－1處理SK-OV-3 細胞6，12 和24 h組;采用Giemsa染色觀察正常對照組和NCTD組細胞的細胞核及染色體等，隨機選取1000個細胞，計算單個核、多個核及核碎裂、有絲分裂相細胞所占比例。

1.5 MTT比色法檢測細胞存活率[18]

取對數(shù)生長期細胞，以每孔1×103個細胞終密度接種于96孔培養(yǎng)板，分為空白對照組(1640培養(yǎng)基)和 NCTD 30，60，120 和 240 μmol·L－1組，分別培養(yǎng)24，48，72 h后，每孔加150 μl MTT工作液，置37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中孵育6 h，每孔加入DMSO 150 μl，震搖 10 min，在 550 nm 波長處讀取吸光度值(A)，計算抑制率，抑制率(%)=(1－NCTD處理組A值/空白對照組 A值)×100%。利用SPSS17.0統(tǒng)計處理軟件回歸分析方法計算半數(shù)抑制濃度(IC50)。每個樣本至少重復3個孔，實驗重復3次。

1.6 流式細胞術檢測細胞周期阻滯

NCTD 60 μmol·L－1作用于對數(shù)生長期的SK-OV-3細胞后，分別收集6，12，24 h加藥組和正常對照組的細胞，用PBS(pH 7.2)洗滌2次，70%冰乙醇固定，4℃保存過夜。800×g離心5 min棄去固定液，500 μl PBS重懸，加入 RNaseA至終濃度20 mg·L－1，37℃水浴，45 min。加入 PI染液至終濃度50 mg·L－1，4℃避光染60 min。流式細胞儀檢測1×104個細胞，ModFit LT軟件分析細胞周期，上機前常規(guī)進行光路流路校準。

1.7 間接免疫熒光顯微術結(jié)合共聚焦顯微鏡觀察細胞內(nèi)紡錘體形態(tài)的變化

[19]將干凈無熒光血蓋片置于無菌六孔板里，按每孔5×105個密度接種細胞，培養(yǎng)至細胞匯合到70%～80%時，取出血蓋片，清洗后于－20℃甲醇固定20 min，再用 pH 7.4的 0.1%Triton X-100-PBS孵育30 min，山羊血清工作液封閉30 min，加一抗37℃孵育2 h，再用二抗室溫孵育1 h，取出血蓋片，吸去水分，95%甘油封片，共聚焦顯微鏡下觀察。

1.8 流式細胞儀測定SK-OV-3細胞凋亡

分別收集 NCTD 60 μmol·L－1作用 12 和 36 h的SK-OV-3全細胞及機械振蕩分離的有絲分裂期細胞和間期細胞〔(5～10)×106個〕，4℃，800×g離心10 min后，棄上清。加入1 ml預冷的PBS，4℃，800×g離心10 min后，棄上清，重復洗2次。按照細胞凋亡檢測試劑盒使用說明書操作[20]，將細胞重懸于200 μl結(jié)合緩沖液，加入10 μl AnnexinⅤ-FITC 輕輕混勻后，避光室溫反應15 min或4℃反應30 min，上機前 5 min 加入300 μl結(jié)合緩沖液以及 5 μl PI，校準光路后，上機檢測。

1.9 統(tǒng)計學處理

2 結(jié)果

2.1 NCTD對SK-OV-3存活的影響

如圖1所示，NCTD對細胞的抑制率隨濃度增加及作用時間的延長而增加，表明NCTD對SK-OV-3細胞的生長有抑制作用，且在實驗條件下NCTD對SK-OV-3細胞的生長抑制作用呈現(xiàn)時間(P＜0.05)和濃度依賴性(P＜0.05)。NCTD作用SK-OV-3細胞24，48 和72 h 的 IC50分別是(261.3±2.4)μmol·L－1，(48.3±1.7)μmol·L－1和(10.9±1.0)μmol·L－1。

Fig.1 Effect of norcantharidin(NCTD)on SK-OV-3 cell survival.±s，n=3.

2.2 NCTD對SK-OV-3細胞周期的影響

根據(jù)細胞毒實驗結(jié)果，選擇 NCTD 60 μmol·L－1分別作用于SK-OV-3細胞0，6，12和24 h，利用流式細胞術檢測細胞周期分布，結(jié)果如圖2所示。NCTD作用于SK-OV-3細胞0，6，12和24 h，細胞逐漸表現(xiàn)G2/M期阻滯，隨作用時間延長阻滯作用增強。

2.3 NCTD對SK-OV-3細胞形態(tài)的作用

倒置相差顯微鏡觀察結(jié)果顯示(圖3)，NCTD 60 μmol·L－1作用 6 h(圖 3C)后，細胞形態(tài)發(fā)生了明顯的變化，與正常對照組(圖 3A，3B)相比，NCTD處理組與部分細胞收縮、變圓，與周圍細胞脫離，細胞間隙增大;12 h后(圖3D)，部分細胞變圓、浮起，細胞變圓浮起的數(shù)量隨時間的延長也相應增加;24 h時(圖3E，3F)，部分細胞發(fā)生明顯變形。Giemsa染色(圖4)見與正常對照組(圖4A)相比，NCTD作用于 SK-OV-3細胞6 h(圖 4B)、12 h(圖4C)和24 h(圖4D)后，有絲分裂相細胞數(shù)量明顯增多，部分呈現(xiàn)前中期的形態(tài)特征，部分有絲分裂相阻滯的細胞中，異常凝集的染色質(zhì)散亂地分布于細胞質(zhì)中。并且隨著藥物作用時間的延長，多個核細胞及核碎裂細胞數(shù)量更為增加。

Fig.2 Effect of NCTD on SK-OV-3 cell cycle by flow cytometry.A1－A3:SK-OV-3 cells at 6，12，and 24 h，respectively;B1 － B3:NCTD 60 μmol·L －1treated for 6，12，and 24 h，respectively.

Fig.3 Effect of NCTD on morphological changes of SK-OV-3 cells.A and B:normal control group，B is a partially enlarged detail of A;C:NCTD 60 μmol·L －1treated for 6 h;D:NCTD 60 μmol·L－1treated for 12 h;E and F:NCTD 60 μmol·L－1 treated for 24 h，F(xiàn) is a partially enlarged detail of E.Arrows stand for apoptosis cells.

2.4 NCTD對SK-OV-3細胞內(nèi)微管分布及紡錘體的影響

如圖5和圖6所示，細胞形態(tài)，正常對照組中細胞貼壁良好，鋪展成單層，細胞呈多角形，顯綠色熒光的微管沿細胞分布，構成胞質(zhì)骨架，顯紅色的細胞核單一、完整(圖5A1～A3)。圖6A1～A3為對照組一個處于有絲分裂中期的細胞，紡錘體輪廓可見。NCTD組的細胞變圓，微管排列發(fā)生變化，沒有明顯極性(圖5B1～B3)，圖6B1～B3為NCTD組一個處于有絲分裂中期的細胞，可見細胞紡錘體出現(xiàn)坍塌，結(jié)構發(fā)生明顯紊亂，圖6C1～C3顯示NCTD組一個有絲分裂期細胞出現(xiàn)染色體多極分離的現(xiàn)象。

2.5 NCTD對SK-OV-3細胞凋亡的影響

如圖7流式結(jié)果所示，NCTD作用12 h，細胞凋亡率為20.4%，作用36 h，細胞凋亡率為62.3%?？梢婋S著藥物作用時間延長，細胞的凋亡率增加。

利用溫和的機械震蕩法分離NCTD處理12 h的NCTD細胞，把細胞分成懸浮和貼壁兩類，分別測定兩類細胞中凋亡細胞的比率，然后分別繼續(xù)作用24 h，即NCTD作用36 h，測定兩類細胞中凋亡細胞的比率(圖8)，同時通過Giemsa染色觀察細胞核的變化，統(tǒng)計懸浮和貼壁細胞中單核、多個核及核碎裂、有絲分裂期細胞所占比例。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，NCTD作用SK-OV-312 h，懸浮細胞多個核或核碎裂細胞所占比例相對較大，為7.6%，且凋亡細胞比例達69.1%，而貼壁細胞以單個核細胞為主，所占比例高達89.3%，凋亡細胞占15.3%;Giemsa染色發(fā)現(xiàn)，懸浮細胞處于分裂期的細胞占到56.2%，貼壁細胞中沒有找到處于分裂期的細胞。NCTD繼續(xù)作用24 h后，懸浮細胞組凋亡細胞比例減少，占47.4%，而貼壁細胞組凋亡細胞比例增加，占53.6%。說明NCTD誘導SK-OV-3細胞凋亡可不依賴G2/M期阻滯。

Fig.5 Effect of NCTD onabnormalmicrotubule arrangement of SK-OV-3 cells.A1－A3:SK-OV-3 cells at 8 h group;B1－B3:NCTD 60 μmol·L－1treated for 8 h group.The green fluorescence in A1 and B1 shows the intracellular localization of microtubule.The red fluorescence in A2 and B2 shows the intracellular localization of nuclei.

Fig.6 Effect of NCTD on aberrant mitotic spindles of SK-OV-3 cells.A1－A3:SK-OV-3 cells at 8 h group;B1－B3 and C1 － C3:NCTD 60 μmol·L －1treated for 8 h group，respectively.The green fluorescence in A1，B1 and C1 shows the intracellular localization of microtubules.The red fluorescence in A2，B2 and C2 shows the intracellular localization of nuclei.

Fig.7 Effect of NCTD on SK-OV-3 apoptosis.A:NCTD 60 μmol·L －1treated for 12 h group;B:NCTD 60 μmol·L －1treated for 36 h group.

Fig.8 Effect of NCTD on apoptosis of adherent cells and non-adherent SK-OV-3 cells.A:NCTD 60 μmol·L －1 treated for 12 h-non-adherent group;B:NCTD 60 μmol·L －1treated for 12 h-adherent group;C:NCTD 60 μmol·L －1treated for 36 h-non-adherent group;D:NCTD 60 μmol·L－1treated for 36 hadherent group.

3 討論

研究表明，NCTD低劑量對SK-OV-3細胞的生長就有顯著的抑制作用，且存在著明顯的時間和劑量依賴性。NCTD可以引起細胞發(fā)生明顯的G2/M期阻滯，同時，NCTD影響SK-OV-3細胞內(nèi)微管的分布，引起紡錘體形成失敗，推測 NCTD引起的SK-OV-3細胞發(fā)生G2/M期阻滯與其干擾細胞內(nèi)微管及紡錘體組裝有關。NCTD可以誘導SK-OV-3細胞凋亡，實驗發(fā)現(xiàn)，NCTD引起的SK-OV-3細胞凋亡可以不依賴細胞G2/M期阻滯。

眾多研究發(fā)現(xiàn)，引起細胞周期阻滯和誘導細胞凋亡是一些抗腫瘤藥物的重要機制。正常細胞和腫瘤細胞的增殖都依賴于細胞周期的運行，腫瘤治療的中心環(huán)節(jié)就是干擾腫瘤細胞的細胞周期，從而使腫瘤細胞增殖速率減慢或誘導腫瘤細胞走向死亡。流式細胞術測定結(jié)合細胞形態(tài)學觀察發(fā)現(xiàn)，細胞在NCTD作用下發(fā)生明顯的G2/M期阻滯，為進一步探討細胞G2/M期阻滯機制，我們利用間接免疫熒光術在共聚焦顯微鏡下觀察NCTD對人卵巢癌SK-OV-3細胞內(nèi)微管分布和紡錘體形態(tài)的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，NCTD破壞了SK-OV-3細胞的正常形態(tài)，細胞微管排列紊亂，有的細胞的紡錘體結(jié)構出現(xiàn)坍塌，有的細胞出現(xiàn)染色體多極分離的現(xiàn)象。微管是細胞的重要組成部分，參與細胞紡錘體的形成，細胞由分裂間期進入有絲分裂期時，細胞質(zhì)中的微管解聚成微管蛋白，微管蛋白在中心體周圍重新裝配為紡錘體，介導染色體的運動;分裂進入末期后，紡錘體解聚形成游離的微管蛋白，重新參與微管的組裝[21]。由此可見，微管處于一種動態(tài)的聚合-解聚狀態(tài)是非常重要的，任何干擾微管這種動態(tài)平衡的行為，均會引起有絲分裂阻滯，并可能通過一系列的信號轉(zhuǎn)導誘導細胞凋亡[22]。我們體外研究已發(fā)現(xiàn)，NCTD在一定濃度范圍內(nèi)可以抑制微管蛋白聚合，并在 SK-OV-3細胞中得到驗證[23]，由此推測NCTD引起紡錘體結(jié)構的紊亂可能與抑制微管蛋白的聚合有關。

本研究利用對凋亡細胞敏感的AnnexinⅤ和細胞核特異性染色劑PI雙染試劑盒，流式細胞術檢測NCTD誘導SK-OV-3細胞凋亡情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，細胞凋亡率明顯呈時間依賴性增加。用溫和震蕩的方法把NCTD作用12 h后的SK-OV-3細胞分成懸浮和貼壁兩組細胞，分別測定分離當時和NCTD繼續(xù)作用24 h后兩組細胞中凋亡細胞所占比率，發(fā)現(xiàn)沒有有絲分裂相細胞的貼壁細胞組在NCTD作用24 h后凋亡細胞比例大增，而懸浮組細胞則有所下降，說明NCTD誘導SK-OV-3細胞凋亡可不依賴細胞G2/M期阻滯。

有絲分裂災變死亡是由于細胞有絲分裂異?；蚣毎L時間阻滯在有絲分裂期而誘發(fā)的一種細胞死亡方式，可以在電離輻射、化療藥物或高溫作用下發(fā)生[24]。隨著對其機制研究的日漸深入，近年來提出與細胞凋亡、壞死、自噬并列為4種主要的細胞死亡形式，其主要細胞學特點為有絲分裂異常致有絲分裂阻滯、中心體異常復制致形成多極紡錘體、染色體異常凝集等。有絲分裂災變死亡的發(fā)生是受到多種信號通路調(diào)節(jié)的精密過程，與細胞周期檢查點異常、中心體或紡錘體結(jié)構異常以及DNA損傷存在密切的聯(lián)系[25－26]。本實驗中NCTD通過誘導細胞有絲分裂期阻滯和細胞凋亡抑制人卵巢癌SK-OV-3細胞生長，而細胞有絲分裂期阻滯最終可能導致細胞發(fā)生有絲分裂災變死亡。有關NCTD誘導的SK-OV-3細胞有絲分裂期阻滯與有絲分裂災變死亡及凋亡間的相關性尚需進一步研究闡明。

參考文獻:

[1]Wang GS.Medical uses of Mylabris in ancient China and recent studies[J].J Ethnopharmacol，1989，26(2):147-162.

[2]Sun W，F(xiàn)ang YZ，Zhang WZ，Ge CY，Zhao FD，Zhou Tt，et al.Inhibitive effect of norcantharidin on vasculogenic mimicry in three-dimensional cultures of gallbladder carcinoma cell lines GBC-SC and SGC-996 in vitro[J].Surg Res New Tech(外科研究與新技術)，2012，1(1):42-48.

[3]Chu YP，Shen L，Bai Y.Efficacy observation of liver cancer at the later stage for the eldely treated with integration of norcantharidin and Chinese medicine[J].World J Integr Trad West Med(世界中西醫(yī)結(jié)合雜志)，2012，7(9):765-767.

[4]Sun ZX，Zhao TD，Wei YL，Li JS.Study of apoptosis of human hepatoma cells(BEL-7402)induced by norcantharidin[J].Acta Anat Sin(解剖學報)，1999，30(1):65-68.

[5]Sum ZX，Zhao TD，Wei YL，Li JS.Study on apoptosis of K562 human myeloid leukemia cells induced by norcantharidin[J].Chin J Histochem Cytochem(中國組織化學與細胞化學雜志)，1999，8(1):92-98.

[6]Sum ZX，Zhao TD，Wei YL，Li JS.Studies on apoptotic cytology of K562 human myeloid leukemia cells induced by cantharidin and norcantharidin[J].Acta Anat Sin(解剖學報)，2000，31(1):56-60.

[7]Sun ZX， Ma QW， Zhao TD，Wei YL，Wang GS，Li JS，et al.Apoptosis induced by norcantharidin in human tumor cells[J].World J Gastroenterol，2000，6(2):263-265.

[8]Peng F，Wei YQ，Tian L，Yang L，Zhao X，Lu Y，et al.Induction of apoptosis by norcantharidin in human colorectal carcinoma cell lines:involvement of the CD95 receptor/ligand[J].J Cancer Res Clin Oncol，2002，128(4):223-230.

[9]An WW，Wang MW，Tashiro S，Onodera S，Ikejima T.Norcantharidin induces human melanoma A375-S2 cell apoptosis through mitochondrial and caspase pathways[J].J Korean Med Sci，2004，19(4):560-566.

[10]An WW，Wang MW，Tashiro S，Onodera S，Ikejima T.Mitogen-activated protein kinase-dependent apoptosis in norcantharidin-treated A375-S2 cells is proceeded by the activation of protein kinase C[J].Chin Med J(Engl)，2005，118(3):198-203.

[11]Yang PY，Chen MF，Kao YH，Hu DN，Chang FR，Wu YC.Norcantharidin induces apoptosis of breast cancer cells:involvement of activities of mitogen activated protein kinases and signal transducers and activators of transcription[J].Toxicol In Vitro，2011，25(3):699-707.

[12]Liu S， Yu H， Kumar SM，Martin JS，Bing Z，Sheng W，et al.Norcantharidin induces melanoma cell apoptosis through activation of TR3 dependent pathway[J].Cancer Biol Ther，2011，12(11):1005-1014.

[13]Chen YN，Chen JC，Yin SC，Wang GS，Tsauer W，Hsu SF，et al.Effector mechanisms of norcantharidin-induced mitotic arrest and apoptosis in human hepatoma cells[J].Int J Cancer，2002，100(2):158-165.

[14]Huang Y，Liu Q，Liu K，Yagasaki K，Zhang G.Suppression of growth of highly-metastatic human breast cancer cells by norcantharidin and its mechanisms of action[J].Cytotechnology，2009，59(3):201-208.

[15]Yu CC，Ko FY，Yu CS，Lin CC，Huang YP，Yang JS，et al.Norcantharidin triggers cell death and DNA damage through S-phase arrest and ROS-modulated apoptotic pathways in TSGH 8301 human urinary bladder carcinoma cells[J].Int J Oncol，2012，41(3):1050-1060.

[16]Sun ZX，Zhao TD，Li JS.Recognizing apoptotic and necrotic cells by counterstaining in situ[J].Chin J Histochem Cytochem(中國組織化學與細胞化學雜志)，1998，7(2):160-163.

[17]Zhang RC，Liu B，Sun ZX，Xu DY.Effects of extract of Polygonum multiflorum on cell cycle arrest and apoptosis of human liver cell line L02[J].J Chin Integr Med(中西醫(yī)結(jié)合學報)，2010，8(6):554-561.

[18]Wang HQ， Sun ZX. Effectof Pdcd4 tumor suppressor gene expression on cytotoxicity of hydroxycamptothecine[J].World Chin J Digestol(世界華人消化雜志)，2009，17(7):647-651.

[19]Bonness K，Aragon IV，Rutland B，Ofori-Acquah S，Dean NM，Honkanen RE.Cantharidin-induced mitotic arrest is associated with the formation of aberrant mitotic spindles and lagging chromosomes resulting，in part，from the suppression of PP2Aalpha[J].Mol Cancer Ther，2006，5(11):2727-2736.

[20]Zhang RC，Zhang C，Sun ZX，Deng QH.Damage effect of Polygonum multiflorum fractions on human normal liver cells L02 and liver cancer cells HepG2[J].China J Chin Mater Med(中國中藥雜志)，2012.37(12):1830-1835.

[21]Jordan MA.Mechanism of action of antitumor drugs that interact with microtubules and tubulin[J].Curr Med Chem Anticancer Agents，2002，2(1):1-17.

[22]Hamel E.Natural products which interact with tubulin in the vinca domain:maytansine，rhizoxin，phomopsin A，dolastatins 10 and 15 and halichondrin B[J].Pharmacol Ther，1992，55(1):31-51.

[23]Hong XF，LI BS，Sun ZX.Inhibitory effect of norcanthari-din on tubulin polymerization in vitro[J].Chin J Pharmacol Toxicol(中國藥理學與毒理學雜志)，2012，26(5):630-634.

[24]Vakifahmetoglu H，Olsson M，Zhivotovsky B.Death through a tragedy:mitotic catastrophe[J].Cell Death Differ，2008，15(7):1153-1162.

[25]Zhang B，Zhang SM，Guan H，Wang Y，Liu XD，Xu QZ，et al.The spindle damage and mitotic catastrophe induced by 6-bromoisovanillin in HeLa cells[J].Sci Technol Rev(科技導報)，2010，28(10):19-23.

[26]Goto H， Izawa I， Li P， Inagaki M.Novel regulation of checkpoint kinase 1:Is checkpoint kinase 1 a good candidate for anti-cancer therapy?[J].Cancer Sci，2012，103(7):1195-1200.