閆 睿，符麗娟，王 婧

(遼寧醫(yī)學(xué)院藥理學(xué)教研室，遼寧錦州 121001)

腎間質(zhì)纖維化是各種原因引起的腎疾病進(jìn)入慢性腎衰竭的共同途徑。糖尿病性腎病是引起終末期腎衰竭的主要原因之一，是糖尿病患者死亡的主要慢性并發(fā)癥之一。近年來，隨著對(duì)糖尿病的研究深入，如何防治其嚴(yán)重并發(fā)癥成為首要任務(wù)。糖尿病性腎病是由代謝紊亂引起的復(fù)雜性疾病，病理特征為早期腎小球肥大，進(jìn)展至基底膜增厚及系膜擴(kuò)張，腎小球細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)積聚、腎小球硬化及間質(zhì)纖維化。近年研究發(fā)現(xiàn)炎性因子單核細(xì)胞趨化蛋白1(monocyte chemoattractant protein-1，MCP-1)參與ECM 的積聚，進(jìn)而加重糖尿病性腎病進(jìn)展。MCP-1是一種特異的趨化因子，有著很強(qiáng)的單核細(xì)胞趨化激活作用。研究發(fā)現(xiàn)，正常的腎組織可分泌微量的MCP-1，而當(dāng)腎組織受到刺激后其MCP-1 mRNA及蛋白質(zhì)表達(dá)明顯高于正常組織，并與腎損害程度成正相關(guān)[1]。而肥大細(xì)胞分化增殖活化，從分泌顆粒釋放細(xì)胞因子、化學(xué)趨化因子和生長(zhǎng)因子等炎性介質(zhì)。曲尼司特(tranilast)可以穩(wěn)定肥大細(xì)胞和嗜堿性細(xì)胞的細(xì)胞膜，抑制過敏性物質(zhì)的釋放。它的作用隨著時(shí)間的推移被逐漸挖掘，從最先的抗過敏，治療哮喘，到如今成為焦點(diǎn)的抗纖維化作用，其對(duì)皮膚和眼的纖維增殖性疾病的抗纖維化已被證實(shí)。但對(duì)腎間質(zhì)纖維化的研究尚不明確。本研究通過建立糖尿病大鼠模型，應(yīng)用曲尼司特干預(yù)觀察MCP-1在糖尿病腎纖維化發(fā)生、發(fā)展中的作用，同時(shí)探討其對(duì)糖尿病腎纖維化的作用及機(jī)制，為尋求抗腎纖維化的靶點(diǎn)和延緩腎間質(zhì)纖維化的方法和制劑提供理論與實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 藥物、試劑及儀器

鏈脲佐菌素(streptozotocin，STZ)，貨號(hào):H1027S，美國(guó)Sigma公司。曲尼司特，批號(hào):國(guó)藥準(zhǔn)字H1093017-5，中國(guó)藥科大學(xué)制藥有限公司。MCP-1試劑盒，編號(hào):SX01094，上海森雄科技實(shí)業(yè)有限公司。S-P9002免疫組化試劑盒購(gòu)自北京中山金橋公司。堿性磷酸酶標(biāo)記的山羊抗兔抗體和β肌動(dòng)蛋白和NBT/BCIP顯色液購(gòu)自碧云天試劑公司。三諾安穩(wěn)血糖儀，長(zhǎng)沙三諾生物有限公司。

1.2 動(dòng)物、模型制備及分組

SD大鼠，40只，♂，體質(zhì)量230～270 g，2月齡，由遼寧醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，動(dòng)物許可證號(hào)SCXK(遼)2009-0007。適應(yīng)性飼養(yǎng) 1周后，將40只大鼠隨機(jī)分為正常對(duì)照、模型、曲尼司特100和200 mg·kg－1組，每組10只。除正常對(duì)照組注射等容積 0.1 mmol·L－1枸櫞酸緩沖液外，其余各組一次性尾靜脈注射 STZ 30 mg·kg－1[2]，72 h后非同日連續(xù)3次測(cè)定血糖均≥16.7 mmol·L－1為造模成功大鼠。按照分組ig給予曲尼司特每天1次，連續(xù)12周，正常對(duì)照組和模型組ig給予等量生理鹽水。

1.3 腎指數(shù)測(cè)定、生化指標(biāo)檢測(cè)及標(biāo)本采集

給藥第12周末，用代謝籠準(zhǔn)確收集24 h尿標(biāo)本，記錄尿量測(cè)定24 h尿蛋白，禁食12 h后稱質(zhì)量。檢測(cè)空腹血糖。ip給予20%烏拉坦(5 ml·kg－1)大鼠麻醉，頸總動(dòng)脈取血2 ml，3000×g離心10 min，分離血清檢測(cè)BUN。處死大鼠，腎以冰生理鹽水沖洗干凈，用濾紙吸干水分后稱重，計(jì)算腎指數(shù)=右腎質(zhì)量(mg)/體質(zhì)量(g)×100，以冰生理鹽水沖洗干凈，左腎凍存于－80℃ 冰箱中備用，右腎以10%中性甲醛溶液固定，PBS洗，石蠟包埋 ，制成4 μm切片備用進(jìn)行病理、免疫組化檢查。

1.4 Masson染色觀察腎組織病理變化

取腎組織，用10%甲醛溶液固定，常規(guī)石蠟包埋，切片，Masson染色觀察腎臟膠原纖維增生情況。各組隨機(jī)選取5只大鼠，每只大鼠隨機(jī)取5張切片，每張切片在統(tǒng)一放大倍數(shù)下(×400)隨機(jī)選取10個(gè)視野，鏡下觀察腎組織病理形態(tài)學(xué)變化及測(cè)算膠原容積分?jǐn)?shù)(CVF)，CVF(%)=膠原面積/總面積×100。

1.5 免疫組織化學(xué)法檢測(cè)腎組織MCP-1蛋白表達(dá)

取腎組織，常規(guī)石蠟包埋，切片厚2 μm脫蠟至水;含3%H2O2的甲醇室溫孵育25 min，阻斷內(nèi)源性過氧化物酶;微波修復(fù)抗原;加入1∶100稀釋的兔抗鼠單克隆抗體(一抗)，置濕盒中4℃過夜;1∶100稀釋生物素化山羊抗兔 IgG(二抗)，37℃孵育25 min;DAB顯色:1 ml蒸餾水加入試劑盒中A，B，C試劑各1滴，混勻后加至切片，室溫顯色，鏡下控制反應(yīng)時(shí)間5 min，陽性細(xì)胞于細(xì)胞質(zhì)出現(xiàn)棕黃色顆粒;蘇木精輕度復(fù)染細(xì)胞核;脫水、透明、中性樹膠封片，鏡下觀察。

1.6 Western印跡法檢測(cè)腎組織MCP-1蛋白表達(dá)

取約100 mg腎組織，立即放入預(yù)冷的Tris緩沖液中〔TBS(mmol·L－1):1%Triton，0.1%SDS，0.5%去氧膽酸，EDTA 1，Tris 20(pH 7.4)，NaCl 150，NaF 10〕，4℃超聲粉碎后，12000 ×g 離心30 min，取上清，用Lowry等[3]法測(cè)定蛋白質(zhì)含量，以牛血清白蛋白(bovine serum albumin，BSA)為標(biāo)準(zhǔn)品，將蛋白濃度調(diào)成一致。用10%～12%SDS-PAGE分離蛋白質(zhì)，每個(gè)泳道蛋白上樣量為20～50 μg。為了準(zhǔn)確判斷目的蛋白帶的位置，一個(gè)泳道加Seeblue plus 2預(yù)染蛋白標(biāo)志物。電泳后將PAGE凝膠中的蛋白質(zhì)電轉(zhuǎn)移至聚偏氟乙烯膜上，取出后將膜放入3%BSA阻斷緩沖液中，封閉60 min，再用 TBS〔Tris 10 mmol·L－1(pH 8.0)，NaCl 150 mmol·L－1〕洗膜 3 次，每次 10 min。將膜放入一抗中(所有一抗均1∶500稀釋)，4℃過夜。TBS沖洗后，將膜放入堿性磷酸酶標(biāo)記的山羊抗兔二抗中(二抗均1∶500稀釋)，室溫孵育1～2 h，然后用TBS洗膜3次，每次10 min，NBT/BCIP顯色液中避光顯色，直至出現(xiàn)，終止反應(yīng)。對(duì)MCP-1進(jìn)行測(cè)定。測(cè)定β肌動(dòng)蛋白，以保證蛋白上樣量的一致性。將蛋白印跡顯像圖掃描，利用凝膠自動(dòng)分析成像軟件Chem Image 5500對(duì)蛋白帶進(jìn)行積分吸光度值(integrated absorbance，IA)分析，以β肌動(dòng)蛋白為參照，計(jì)算二者IA比值表示MCP-1的表達(dá)。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 曲尼司特對(duì)糖尿病大鼠一般情況、腎指數(shù)及生化指標(biāo)的影響

糖尿病大鼠模型組大鼠造模成功后，開始出現(xiàn)明顯的多飲、多食、多尿，逐漸消瘦，精神萎靡，至實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)死亡2只;模型組大鼠體質(zhì)量增加緩慢，曲尼司特100 和200 mg·kg－1組大鼠增長(zhǎng)較快(P＜0.05)，兩組之間體質(zhì)量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但均較正常對(duì)照組體質(zhì)量明顯減輕(P＜0.05)。實(shí)驗(yàn)過程中，曲尼司特100 mg·kg－1組因灌胃窒息大鼠死亡1只。表1結(jié)果顯示，與正常對(duì)照組相比，模型組、曲尼司特100和200 mg·kg－1組血糖、24 h 尿蛋白、血 BUN 均明顯升高(P＜0.01);模型組、曲尼司特100 mg·kg－1組腎指數(shù)明顯升高(P＜0.05)，曲尼司特200 mg·kg－1組腎指數(shù)與正常對(duì)照組相比無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異;與模型組比較，曲尼司特100和200 mg·kg－1能明顯降低糖尿病大鼠腎指數(shù)、24 h尿蛋白、血BUN(P＜0.01)，但曲尼司特治療后24 h尿蛋白、血BUN均未恢復(fù)至正常對(duì)照組水平(P＜0.05)。

Tab.1 Effect of tranilast(Tra)on levels of fasting blood glucose(FBG)，body mass and kidney index，urinary protein(UP)，and blood urea nitrogen(BUN)of diabetic model rats

2.2 曲尼司特對(duì)糖尿病大鼠腎形態(tài)的影響

由圖1可見，Masson染色在正常對(duì)照組的膠原染色主要位于腎小球基底膜、Bowman囊、系膜區(qū)和腎小管周圍血管，膠原容積分?jǐn)?shù)(3.50±0.52)%，腎小球毛細(xì)血管襻開放良好，未見腎小球節(jié)段硬化，腎小管上皮細(xì)胞排列整齊(圖1A);模型組可見腎間質(zhì)內(nèi)大量膠原纖維增生，間質(zhì)膠原呈現(xiàn)藍(lán)染，間質(zhì)纖維化呈灶狀分布，可見腎小球局灶性節(jié)段性硬化(圖1B)，膠原容積分?jǐn)?shù)為(7.05±1.49)%;曲尼司特 100 和 200 mg·kg－1組腎小球輕度腫脹，腎小管上皮細(xì)胞變性，間質(zhì)纖維增生(圖1C，D)，膠原容積分?jǐn)?shù)分別為(5.72±1.28)%和(4.94±1.06)%。上述改變較模型組均有減輕，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05)，曲尼司特200 mg·kg－1組更為顯著(P＜0.01)，但都未恢復(fù)至正常對(duì)照組水平(P＜0.05)。

Fig.1 Effect of tranilast on pathological changes in renal tissue of diabetic rats(Masson staining，×400).See Tab.1 for the rat treatments.A:normal control group;B:model group;C:Tra 100 mg·kg－1;D:Tra 200 mg·kg－1.Arrows show the collagen fiber.

2.3 曲尼司特對(duì)糖尿病大鼠腎組織MCP-1表達(dá)影響

2.3.1 免疫組化結(jié)果

由圖2可見，正常對(duì)照組腎小球內(nèi)皮細(xì)胞、系膜細(xì)胞，腎小管及間質(zhì)無明顯染色，腎組織少量表達(dá)MCP-1(圖2A)。模型對(duì)照組腎組織著色廣泛、濃集，MCP-1表達(dá)擴(kuò)大及增強(qiáng)(圖2B)。與模型組比較，曲尼司特100和200 mg·kg－1組腎小管上皮細(xì)胞有弱著色，MCP-1表達(dá)程度減輕(圖2C，D)，提示曲尼司特可以減少糖尿病性腎病大鼠腎組織內(nèi)MCP-1的表達(dá)。

Fig.2 Effect of tranilast on expression of monocyte chemcoattractant protein-1(MCP-1)in the kidneys of diabetic rats(Immunohistochemistry × 400).See Tab.1 for rat treatments.A:normal group;B:model group;C and D:tranilast 100 and 200 mg·kg－1groups.Arrows show positive cells.

2.3.2 Western印跡結(jié)果

由圖3及其半定量結(jié)果可見，與正常對(duì)照組(0.264±0.012)相比，模型組腎組織 MCP-1 蛋白表達(dá)水平(0.675±0.059)顯著增加(n=3，P＜0.01)。與模型組相比，曲尼司特100和200 mg·kg－1組MCP-1蛋白表達(dá)水平明顯減弱(n=3，P＜0.05)，分別為0.511±0.040 和0.404±0.075，其中曲尼司特200 mg·kg－1作用更加明顯(n=3，P＜0.01)，但都未恢復(fù)至正常對(duì)照組水平(P＜0.05)。

Fig.3 Effect of tranilast on expression of MCP-1 in the kidneys of diabetic model rats by Western blotting.See Tab.1 for rat treatments.Lane 1:control group;lane 2:model group;lane 3:Tra 100 mg·kg －1;lane 4:Tra 200 mg·kg －1.

3 討論

MCP-1是單核巨噬細(xì)胞的特異性趨化因子，可由體內(nèi)多種細(xì)胞產(chǎn)生，包括內(nèi)皮細(xì)胞、單核細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞、系膜細(xì)胞和腎小管上皮細(xì)胞等。已有研究發(fā)現(xiàn)，正常腎組織多種細(xì)胞均能分泌微量MCP-1，當(dāng)腎組織受到刺激后，其MCP-1 mRNA及蛋白質(zhì)的表達(dá)明顯高于正常組織，并與腎損害程度成正相關(guān)。本實(shí)驗(yàn)中病程12周時(shí)，糖尿病大鼠血糖、BUN和24 h UP水平明顯高于健康對(duì)照組，腎毛細(xì)血管基底膜增厚、結(jié)構(gòu)模糊;足突破壞、融合消失;系膜基質(zhì)增多、系膜細(xì)胞腫脹，表明此時(shí)糖尿病大鼠已有糖尿病性腎病的改變。糖尿病性腎病組MCP-1表達(dá)量明顯高于健康對(duì)照組，而曲尼司特干預(yù)組，腎功能以及腎臟病理改變有明顯改善，且MCP-1的表達(dá)量也明顯降低。胡長(zhǎng)軍等[4]研究也提示糖尿病大鼠組MCP-1表達(dá)較正常大鼠顯著上調(diào)。Ha等[5]研究發(fā)現(xiàn)高血糖和高糖基化血紅蛋白可刺激系膜細(xì)胞MCP-1 mRNA及MCP-1表達(dá)加強(qiáng)。還有研究發(fā)現(xiàn)，db/db糖尿病大鼠模型持續(xù)高血糖、腎小球免疫復(fù)合物沉積能刺激腎產(chǎn)生MCP-1，導(dǎo)致腎進(jìn)行性損傷[6]。Morii等[7]也發(fā)現(xiàn) MCP-1 通過趨化單核巨噬細(xì)胞在腎小管間質(zhì)聚集，介導(dǎo)腎間質(zhì)炎癥、腎小管萎縮和間質(zhì)纖維化而促進(jìn)糖尿病性腎病的發(fā)展。上述研究提示MCP-1的過表達(dá)在糖尿病性腎病發(fā)生、發(fā)展中可能起到重要作用。其機(jī)制可能與以下因素有關(guān):①腎疾病中MCP-1水平的升高能增強(qiáng)多種細(xì)胞因子和黏附分子的表達(dá)和合成，加重腎損害;②MCP-1能激活單核細(xì)胞中的溶酶體酶等炎癥介質(zhì)的釋放，并可引發(fā)氧化應(yīng)激，激活蛋白水解酶，增加氧自由基的生成，直接損傷腎臟血管內(nèi)皮細(xì)胞[8－9]。

曲尼司特可穩(wěn)定肥大細(xì)胞和嗜堿性粒細(xì)胞的細(xì)胞膜，抑制過敏性物質(zhì)的釋放。Mifsud等[10]研究發(fā)現(xiàn)，糖尿病性腎病大鼠模型每天給予曲尼司特(400 mg·kg－1，從第8周到第16周)干預(yù)，不影響血壓和血糖，但可改善腎小管纖維化和萎縮，降低腎小球硬化和蛋白尿。本研究結(jié)果表明，曲尼司特干預(yù)12周，糖尿病大鼠腎組織病理改變減輕，說明其可以抑制糖尿病模型大鼠腎小球基底膜增厚、系膜基質(zhì)增多及腎間質(zhì)纖維增生。同時(shí)曲尼司特干預(yù)使大鼠BUN、腎指數(shù)和24 h UP水平明顯降低，提示曲尼司特對(duì)糖尿病大鼠腎臟具有保護(hù)作用。此外，曲尼司特治療后，糖尿病大鼠腎MCP-1表達(dá)明顯降低，提示曲尼司特可以通過降低MCP-1表達(dá)，延緩糖尿病腎病變，起到腎保護(hù)作用。劉雪梅等[11]在狼瘡腎炎、IgA腎病、慢性腎小球腎炎等多種類型的腎活檢標(biāo)本研究觀察了肥大細(xì)胞的數(shù)量與腎間質(zhì)損害程度的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)腎間質(zhì)損害程度不同的各組腎小球腎炎比較，肥大細(xì)胞數(shù)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，且與間質(zhì)纖維化及腎功能衰竭呈明顯正相關(guān)，說明肥大細(xì)胞與間質(zhì)纖維化有密切關(guān)系。而曲尼司特為肥大細(xì)胞的細(xì)胞膜穩(wěn)定劑，具體作用有待于進(jìn)一步研究。

綜上所述，MCP-1的過表達(dá)在糖尿病性腎病發(fā)生、發(fā)展中起重要作用，曲尼司特可阻止肥大細(xì)胞脫顆粒釋放炎癥介質(zhì)MCP-1，從而延緩腎間質(zhì)纖維化的發(fā)展。

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